Всасывание минеральных веществ кишечными клетками

 

Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии, и касается увеличения всасывания минеральных веществ в кишечнике. Для этого предлагается использовать лактобактерии в той форме, которая обеспечивает способность пребывания бактерий живыми в кишечнике. Осуществляют введение этих бактерий в составе пищевой композиции для энтерального введения. Изобретение обеспечивает повышение всасывания минеральных веществ за счет активации транспорта этих веществ в клетку кишечника. 3 c. и 7 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 ил.

Это изобретение относится к способу облегчения или увеличения всасывания у млекопитающих минеральных веществ из обычной пищи. В частности, это изобретение относится к способу, заключающемуся в применении композиции для энтерального введения, содержащей микроорганизмы Lactobacilli.

Минеральные вещества являются ключевыми элементами в основных физиологических процессах. Например, кальций имеет очень важное значение для образования костей и зубов, сокращении мышц и синтеза гормонов, кальций также является необходимым вторичным посредником в большинстве явлений, связанных с активацией клеток.

Минеральные вещества, основным источником которых является пища, усваиваются организмом при прохождении через слизистую кишечника, чтобы затем перейти в кровяной поток. Степень усвояемости (или всасывания) минеральных веществ в организме фактически зависит как от их растворимости в среде кишечника, так и способности кишечных клеток усваивать их и переносить их в кровяной поток (R.Wasserman et al. In Mineral Absorption in the Monogastric GI Trac. Advances in Experimental Medicine and Biology, 249, 45-65. Plenum Press, N.Y., 1989).

В течение многих лет изучали локализацию, эффективность и механизмы всасывания кальция по всему кишечнику на крысах и цыплятах (Bronner F., J. Nutr. , 122, 641-643, 1992; Schachter D., Am. J. Physiol., 196, 357-362, 1959). По понятным этическим и техническим причинам эти исследования на людях были ограниченными (Hylander E. et al., Scand. J. Gastroenterol., 25, 705, 1990), и предпринималось только несколько опытов in vitro (Elsherydah A. et al. , Gastroenterology, 109, 876, 1995; Feher J.J., Am. J. Physiol., 244, C303. 1983; Feher J.J., Cell Calcium, 10, 189, 1989).

Одной из наиболее широко изученных сторон всасывания минеральных веществ является биодоступность минеральных веществ в зависимости от состава суточного пищевого рациона (Bronner F., J. Nutr., 123, 797, 1993). Однако многие минеральные вещества, которые обладают высокой биодоступностью являются также нестабильными и не пригодны для использования с пищей. Кроме того, просто добавление в пищу больших количеств минеральных веществ часто оказывает негативное воздействие на органолептические свойства пищи.

Возможным решением проблемы является облегчение или улучшение всасывания минеральных веществ из пищи. Однако имелось мало исследований по способам облегчения или увеличения всасывания минеральных веществ из пищи, и результаты не были согласующимися.

Rasic и др. обнаружили, что минеральные вещества, содержащиеся в молочных продуктах, усваиваются лучше, когда эти продукты подвергаются ферментации. Этот эффект относится к наличию кислот в сквашенных молочных продуктах (ХР 002052238: In Fermented Fresh Milk Product, v. 1, p.114-115, 1978).

Совсем недавно Yaeshima и др. также показали увеличение всасывания кальция у крыс из обогащенной кальцием сыворотки, когда потребляется комбинация олигосахаридов и Bifidobacteria (XP 002052237: Bulletin of the International Dairy Fermentation, 313, 1996).

Однако Kot и др. сообщили, что Lactobacillus acidophilus естественно используют Fe²⁺ и окисляют его в Fe³⁺, которое является нерастворимой формой, которая усваивается труднее (J. Agric. Food Chem., 43, 1276-1282, 1995).

Следовательно, остается необходимость в способах облегчения или увеличения всасывания минеральных веществ, присутствующих в пище.

Таким образом, изобретение относится к способу увеличения всасывания минеральных веществ из пищи, включающему энтеральное введение млекопитающему пищевой композиции, которая содержит бактерии lactobacilli.

Неожиданно, при использовании модели in vitro было обнаружено, что lactobacilli способны непосредственно облегчать или улучшать всасывание минеральных веществ, особенно кальция, кишечными клетками человека. Не желая ограничиваться теорией, предполагается, что это связано с индуцированием подкисления микросреды около кишечных клеток и бактерий, контактирующих с кишечными клетками. Как бактерии, так и кишечные клетки могут участвовать в индукции подкисления. Это локализированное подкисление может, таким образом, играть активную роль в растворении минеральных веществ и, следовательно, в способности организма усваивать их.

Объектом изобретения является применение lactobacilli при приготовлении пищевой композиции для энтерального введения для облегчения или улучшения всасывания минеральных веществ у млекопитающего. Пищевую композицию для энтерального введения можно использовать для лечения или профилактики недостатка минеральных веществ.

Воплощения изобретения иллюстрируются примерами со ссылкой на чертежи, на которых: фиг.1 представляет основное всасывание кальция кишечными клетками Сасо-2 при отсутствии lactobacilli; фиг. 2 представляет влияние примерно 6,7•10⁷ КОЕ/мл lactobacilli различных штаммов на всасывание кальция кишечными клетками Сасо-2; фиг. 3 представляет влияние примерно 3,4•10⁸ КОЕ/мл lactobacilli различных штаммов на всасывание кальция Сасо-2 кишечными клетками.

Изобретение относится к энтеральному введению пищевой композиции, которая содержит lactobacilli для облегчения или улучшения всасывания минеральных веществ, присутствующих в суточном пищевом рационе. Примерами минеральных веществ являются кальций, магний, железо и/или цинк. Прием внутрь lactobacilli повышает биодоступность минеральных веществ, что делает минеральные вещества, которые часто не очень растворимы в кишечнике, более доступными для кишечных клеток.

Можно использовать любой штамм lactobacilli пищевой категории. Например, можно использовать Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorous, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri и Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus reuterii, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, особенно L. casei подвид casei и L. casei подвид rhamnosus; Lactobacillus delbruckii, особенно L. delbruckii подвид lactis., L. delbruckii подвид helveticus и L. delbruckii подвид bulgaricus; и Leuconostoc mesenteroides, особенно L. mesenteroides подвид cremoris (например, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, v.2, 1986; Fujisawa et al., Int. Syst. Bact., 42, 487-491, 1992).

Lactobacilli могут быть способны прилипать к кишечным клеткам, но это не является необходимым. Однако предпочтительны lactobacilli у которых, по меньшей мере, 50 бактерий, в частности, по меньшей мере, 80 бактерий способны прилипать в условиях in vitro к 100 кишечным клеткам. Для того, чтобы выбрать "прилипающий" тип бактерий, культуру бактерий можно распластать на сливающейся культуре иммортализованной линии эпителиальных клеток кишечника (ЕР 0802257), отмыть сливающуюся культуру и определить число бактерий, прилипших к ворсинкам линии.

Особый интерес представляют пробиотические lactobacilli. Некоторые штаммы действительно способны прилипать к кишечным клеткам человека, исключая патогенные бактерии, которые находятся на кишечных клетках человека, и/или воздействуют на иммунную систему человека при более сильном реагировании до внешней агрессивности (иммуномодулирующая способность), например, усиливая фагоцитирующую активность гранулоцитов человечьей крови (J. of Dairy Science, 78, 491-497, 1995; иммуномодулирующая способность штамма La1, который депонирован Nestec SA согласно Будапештскому договору в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM), 25 rue docteur Roux, 75724 Париж, 30 июня 1992, под номером CNCM I-1225). Этот штамм описан в ЕР 0577904.

В качестве примера может быть использован пробиотический штамм Lactobacillus acidophilus CNCM I-1225. Этот штамм был недавно повторно распределен среди бактерий Lactobaciilus johnsonii, по новой таксономии, предложенной Fujisawa et al. , который в настоящее время является авторитетом в области таксономии ацидофильных молочнокислых бактерий (Int. J. Syst. Bact., 42, 487-791, 1992). Доступны также другие пробиотические бактерии, такие как, например, описанные в ЕР 0199535 (Gorbach et al.), US 5296221 (Mitsuoka et al.), US 556785 (Institut Pasteur) или US 5591428 (Probi AB).

Пищевые композиции предпочтительно включают достаточное количество живых lactobacillus для облегченного всасывания минеральных веществ кишечными клетками, например, по меньшей мере 10⁶ КОЕ/мл, в частности 10⁷-10¹¹ КОЕ/мл, предпочтительно 10⁸-10¹¹ КОЕ/мл ("КОЕ" означает "колониеобразующая" единица).

Пищевая композиция может также содержать по желанию другие бактерии, например другие пробиотические бактерии.

Пищевая композиция может также включать пригодный источник белка, например источник белка животного и растительного происхождения. Пригодными источниками белка являются молочные белки, соевые белки, рисовые белки, пшеничные белки, белки сорго и тому подобное. Белки могут быть в интактной или гидролизованной форме.

Пищевая композиция может также включать источник углеводов, например сахарозу, фруктозу, глюкозу, мальтодекстрин и тому подобное.

Пищевая композиция также может включать пригодный источник липидов, например пригодный источник липидов животного или растительного происхождения. Пригодные источники липидов включают молочные жиры, подсолнечное масло, рапсовое масло, оливковое масло, сафлоровое масло и тому подобное.

Пищевая композиция может быть также обогащена минеральными веществами и витаминами. Особенно предпочтительно обогащать пищевую композицию кальцием.

Пищевые композиции можно приготовить в виде продуктовых композиций, предназначенных для потребления человеком или животными. Пригодные пищевые композиции могут быть в форме жидкостей, порошков или твердых частиц.

Пищевую композицию можно подвергнуть ферментации для получения достаточного количества lactobacilli. Ферментированные композиции на основе молока, таким образом, наиболее пригодны. Термин молоко относится не только к молоку животных, но также к тому, что обычно называют растительным молоком, что представляет собой экстракт обработанного или необработанного растительного сырья такого, как бобовые (соя, нут бараний, чечевица и тому подобное) или масличные семена (рапс, соя, кунжут, хлопок и тому подобное), чьи экстракты содержат белки в растворе и/или в коллоидной суспензии, которые коагулируют при химическом воздействии, кислом брожении и/или под действием тепла.

Возможно подвергнуть эти растительные виды молока тепловой обработке подобной тем, что используются для животного молока. Также возможно подвергнуть их обработкам, которые специфичны для них, таким как обесцвечивание, дезодорация, и обработкам, скрывающим нежелательный вкус. Наконец, слово молоко также означает смеси животного молока и растительных видов молока.

Также возможно добавлять, смешивать или заключать в оболочку пищевую композицию, во время ее приготовления, с соответствующим количеством культуры lactobacilli в жидкой концентрированной, сухой или инкапсулированной форме при необходимости.

Было установлено, что микроинкапсулирование lactobacilli имеет преимущества для лечения. Первое, микрокапсулирование значительно повышает выживание lactobacilli и, следовательно, число живых lactobacilli, которые появляются в кишечнике. Даже более важно, что lactobacilli постепенно высвобождаются в кишечник, что позволяет осуществлять пролонгированное воздействие lactobacilli на всасывание минеральных веществ кишечными клетками.

Предпочтительно, для того, чтобы инкапсулировать lactobacilli, lactobacilli подвергают сублимационной сушке или распылительной сушке (ЕР 0818529) и включают их в гель, состоящий, например, из застывшей жирной кислоты, альгината натрия, полимеризованной гидроксипропилметилцеллюлозы или полимеризованного поливинилпирролидона. Этот способ описан в FR 2443247, который включен в качестве ссылки.

Пищевые композиции не должны содержать углеводы, необходимые для активной ферментации под действием lactobacilli в среде кишечника. Наоборот, облегченное всасывание минеральных веществ является независимым от ферментативной активности lactobacilli, а скорее является результатом непосредственного контакта между lactobacilli и кишечными клетками. Полагается, что это индуцирует подкисление микросреды и, следовательно, лучшее растворение минеральных веществ.

Однако может быть желательным обеспечить восстановление или определенное размножение lactobacilli в кишечной среде так, чтобы продлить эффект облегченного всасывания минеральных веществ. Этого можно достичь при добавлении к пищевой композиции волокон, которые облегчают специфическое размножение lactobacilli в кишечной среде. Эти волокна растворимы и поддаются ферментации.

Эти волокна можно выбрать из, например, растительных пектинов, хито-, фрукто-, гентио-, галакто-, изомальто-, манно- или ксило-олигосахаридов или олигосахаридов из сои (например, Playne et al., Bulletin of the IDF 313. Group B42, Annual Session of September 95, Vienna).

Предпочтительными пектинами являются полимеры α-1,4-D-галактуроновой кислоты, имеющие молекулярную массу порядка от 10 до 400 кДа, которые можно выделить из моркови или томатов (например, JP 60164432).

Предпочтительные галакто-олигосахариды включают сахаридную часть, состоящую из от 2 до 5 повторяющихся единиц структуры [-α-D-Глю-(1-->4)-β-D-Гал-(1-->6)-] (Yakult Honsa Co., Япония). Предпочтительными фрукто-олигосахаридами являются инулин-олигофруктозы, экстрагированные из цикория, которые могут включать, например, 1-9 повторяющихся единиц структуры [-β-D-Фру-(1-->2)-β-D-Фру-(1-->2)-] (WO 94/12541; Raffinerie Tirlemontoise S.A., Бельгия) или олигосахариды, синтезированные из сахарозных единиц, которые могут включать, например, сахаридную часть, состоящую из от 2 до 9 повторяющихся единиц структуры [-α-D-Глю-(1-->2)-β-D-Фру-(1-->2)-] (Meiji Seika Kasiha Co. , Япония).

Предпочтительные мальто-олигосахариды включают сахаридную часть, состоящую из от 2 до 7 повторяющихся единиц структуры [-α-D-Гал-(1-->4)-] (Nihon Shokuhin Kako Co. , Япония). Предпочтительные изомальтозы включают сахаридную часть, состоящую из от 2 до 6 повторяющихся единиц структуры [-α-D-Глю-(1-->6)-] (Showa Sangyo Co., Япония). Предпочтительные гентио-олигосахариды включают сахаридную часть, состоящую из от 2 до 5 повторяющихся единиц структуры [-β-D-Глю-(1-->6)-] (Nihon Shokuhin Kako Co., Япония). Наконец, предпочтительные ксило-олигосахариды включают сахаридную часть, состоящую, например, из от 2 до 9 повторяющихся единиц структуры [-β-ксил-(1-->4)-] (Suntory Co., Япония).

Количество волокон в пищевой композиции зависит от их способности способствовать развитию lactobacilli. В виде общего правила, пищевая композиция может содержать от 1 до 50% таких волокон (по массе относительно сухого вещества). Концентрация lactobacilli может составлять, по меньшей мере, 10³ КОЕ lactobacilli на г волокон, предпочтительно от 10⁴ до 10⁷ КОЕ/г волокон.

Другое преимущество, обеспечиваемое волокнами, состоит в том, что под действием волокон замедляется прохождение через кишечник. Это особенно проявляется в случае, если количество волокон является большим, порядка 20-50% относительно массы композиции. Становится возможный, когда lactobacilli постепенно выделяются при прохождении через кишечник, удлинить таким способом полезное действие lactobacilli на всасывание минеральных веществ в кишечнике.

Пищевые композиции могут быть в виде любого пригодного энтерально введенного продукта. Например, пищевая композиция может быть в виде кисломолочного продукта (ЕР 0577904), детского питания (ЕР 0827697), творога (РСТ/ЕР 97/06947), созревшего сыра, мороженого (WO 98/09535), бисквита, наполненного кремом (ЕР 704164; ЕР 666031), сухой колбасы и/или паштета (ЕР 689769).

Пищевые композиции могут быть также в виде, пригодном для людей, которые не переносят молочные продукты. Эти пищевые композиции не будут содержать аллергенные производные молока. Например, для детей, у которых имеется аллергия на молочные белки, пищевая композиция может быть составлена с включением гипоаллергенных производных молока. Эти производные молока могут быть в соответствии с Европейской директивой 96/4/ЕС, в которой констатируется, что в гипоаллергенном молоке аллергенные белки должны детектироваться иммунологически в 100 раз меньше, чем в негидролизованном молоке (Off. J. Europ. Comm. , L49/2, приложение пункт 5.а, 1996; Fritsche et al. Int. Arch. Aller. and Appl. Imm., 93, 289-293, 1990).

Пищевые композиции особенно пригодны для лечения или профилактики у людей, имеющих недостаток минеральных веществ, или для компенсации физиологического недостатка в результате низкого уровня минеральных веществ в пище, или удовлетворения больших физиологических потребностей в минеральных веществах у детей, беременных женщин, женщин, кормящих грудью, и пожилых людей.

Далее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано примерами, проценты даны по массе, если не указано особо. Эти примеры даются только в качестве иллюстрации и ни коем образом не ограничивают изобретение.

Пример 1 Материалы: ⁴⁵CaCl₂ получили от Amersham, люцифер желтый от Sigma, коллаген I от Centrix Pharmaceuticals, PBS, HEPES и компоненты среды для культивирования клеток от Gibco и культуральные подложки от Falcon.

Клеточная культура: человечью клеточную линию Сасо-2, выделенную из аденокарциномы толстой кишки, получили из Американской Типовой Культуральной Коллекции (пассаж 41). Клетки помешают в культуру в количестве 4•10⁴ клеток/см² в ДМЕМ, содержащую 4,5 г/л глюкозы, 20% инактивированной теплом фетальной телячьей сыворотки, 1 мг/мл фунгизона, 100 Е/мл пенициллина/стретомицина, 200 мкг/мл гентамицина и 1% заменимых аминокислот. Клетки соответственно правилам обрабатывают трипсином и вновь помещают в культуру при 1:20. Клетки, использованные в опытах по транспорту кальция, помещают в культуру при 1•10⁵ клеток/см² в проницаемых вставках, ранее покрытых слоем коллагена I в концентрации 50 мкг/мл. Во всех случаях клетки поддерживают в инкубаторе в атмосфере 10% СO₂/90% воздуха. Каждые два дня среду замещают.

Жизнеспособность клеток Сасо-2: для того, чтобы исключить возможность того, что усиление всасываемости кальция кишечными клетками в присутствии lactobacilli является результатом повреждения клеток, часть каждой пробы, служащей в тесте с кальцием, использовали для анализа активности гексозаминидазы (Landegren et al., J. Immunol. Method, 67, 379-378, 1984). Этот колориметрический тест делает возможным количественно определить лизис клеток и/или гибель при измерении активности гексозаминидазы, высвобождаемой в супернатант из цитозоля поврежденных клеток. Результаты показывают, что во всех случаях, активность гексозаминидазы является эквивалентной в присутствии lactobacilli.

Проницаемость клеточного "газона": целостность "газона", образованного клетками Сасо-2 в конце их роста и их дифференциации, оценивают, измеряя трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER), используя вольтметр/омметр Millicell-ERS. Опыты по всасыванию кальция проводят, когда это значение сопротивления достигает, по меньшей мере, 700 Ом•см². Проницаемость клеточного "газона" во время опытов со всасыванием кальция оценивают при определении уровня диффузии (в%) люцифера желтого, молекула которого не проходит через клеточную мембрану.

Транспорт кальция: клетки Сасо-2 культивируют на вставках в течение от 3 до 5 недель. В день опыта клеточный "газон" дважды промывают PBS и затем в нижний отсек вставки, внедренный в серозную оболочку (базолатеральный полюс клеток), вносят 2,5 мл буфера-носителя (140 мМ NaCl, 5,8 мМ КС1, 0,34 мМ NaH₂PO₄, 0,44 мМ КН₂РО₄, 0, 8 мМ MgSO₄, 20 мМ HEPES, 4 мМ глутамина, 25 мМ глюкозы, рН 7,4) с добавлением 2,5 мМ CaCl₂, в то время как в верхний отсек вставки, внедренный в просвет кишечника (апикальный полюс клеток), вносят 1,5 мл буфера-носителя с добавлением 10 мМ CaCl₂ и следовых количеств ⁴⁵CaCl₂ и люцифер желтый. Вставки затем помещают при 37^oС и через регулярные интервалы времени отбирают пробы в 50 мкл из нижнего и верхнего отсеков.

Радиоактивность этих проб определяют жидкостной сцинтилляцией и делают возможным экстраполировать данные на количество адсорбированного "холодного" CaCl₂. Основной транспорт кальция выражают в нмоль кальция, транспортированного в нижний отсек вставки. Диффузию люцифера желтого, детектируемую спектрофотометрически в нижнем отсеке, выражают в% от количества помещенного в верхний отсек.

Влияние lactobacilli: штамму Lactobacillus johnsonii La1 (CNCM 1-1225), La17, La22, La31; Lactobacillus acidophilus La10, La18, La31; Lactobacillus bulgaricus Lfi5, YL8; Lactobacillus paracasei ST11; Lactobacillus gasseri LGA7; Lactobacillus reuteri LR7 и Streptococcus thermophilus Sfi20, YS4 (Nestec collection, Lausanne, Швейцария) помещают в культуру в анаэробных условиях в бульоне MRS для Lactobacillus или M17 для Streptococcus два раза по 24 час, промывают PBS и повторно суспендируют в буфере-носителе перед внесением в верхний отсек вставок. Соотношение Сасо-2: бактерии равняется примерно 1:100 по тестам (6,7•10⁷ или 3,4•10⁸ КОЕ/мл в верхнем отсеке вставок для тестов, представленных на фиг. 2 и 3). Всасывание кальция оценивают способом, упомянутым выше.

Результаты основного транспорта кальция: во вставках обнаружили градиент кальция при помещении 2,5 мМ CaCl₂ в нижний отсек, что соответствует обычной концентрации в плазме человека, и произвольно 10 мМ CaCl₂ в верхний отсек, что соответствует содержанию кальция в продуктах питания. Как показали результаты типичного опыта, иллюстрированного фиг. 1, основное всасывание кальция клетками Сасо-2 увеличивается со временем, достигая 600 нмоль/вставку, включающую 3•10⁶ клеток, через 4 часа. Для того чтобы проверить целостность клеточного "газона" во время опыта, определяли диффузию люцифера желтого, и было показано, что она составляет менее 2%.

Определение влияния lactobacilli: на фиг. 2 и 3 всасывание кальция клетками Сасо-2 достоверно увеличивается в присутствии "прилипающих" Lactobacillus johnsonii штаммы La1 и La22, в присутствии "не прилипающих" Lactobacillus штаммы La10 и La18 и в присутствии штаммов L. paracasei (ST11), L. gasseri (LGA7) и L. reuterii (LR7).

Способность бактерий прилипать к кишечным клеткам, следовательно, непосредственно не коррелирует с их способностью повышать всасывание этими же клетками. Во всех этих опытах, диффузия люцифера желтого модулируется подобным образом, но остается незначительной.

Снижение рН в верхнем отсеке вставок также наблюдают, когда клетки Сасо-2 находятся в присутствии lactobacilli, независимо от штамма, за исключением штамма Sfi20 (таблица 1). Следовательно, отсутствует корреляция между увеличением всасывания кальция и этим снижением рН. Однако некоторые бактериальные штаммы, способные увеличивать всасывание кальция, не способны подкислять опытную среду при отсутствии Сасо-2. Это означает, что для подкисления в присутствии Сасо-2 и бактерий необходимо взаимодействие между организмами двух типов, и оно может быть отнесено за счет клеток Сасо-2.

Пример 2 Опыты, подобные проведенным в примере 1, поставили в целях определения влияния lactobacilli на всасывание кальция кишечными клетками в присутствии меченого инулина (³H-инулин, Amersham; изотопное пребиотическое волокно). Эти результаты подтверждают, что lactobacilli увеличивают in vitro всасывание минеральных веществ кишечными клетками.

Пример 3 Опыты, подобные проведенным в примере 1, поставили в целях определения влияния lactobacilli на всасывание магния, железа и цинка кишечными клетками. Результаты подтверждают, что lactobacilli увеличивают in vitro всасывание минеральных веществ кишечными клетками.

Пример 4. Инкапсулирование молочнокислых бактерий.

В резервуаре емкостью 100 л готовят 80 л культурной среды, имеющей следующий состав в % (таблица 2).

Посев проводят с 1 л 20-часовой культуры Lactobacillus johnsoii La1 (CNCM I-1225). Среду инкубируют в течение 12 часов при 30^oС. Культуральный бульон центрифугируют и получают 240 г клеток. Их разводят в 250 мл сепарированного молока с добавлением 7% лактозы. Смесь замораживают, используя жидкий азот. Проводят сублимационную сушку при 40^oС в течение ночи. Готовят 5%-ную дисперсию полученного порошка в гидрогенизированном растительном жире, имеющем т. пл. 42^oС и разжиженном при 45^oС. Дисперсию вводят при 45^oС под давлением 4 бар одновременно с жидким азотом в количестве 1 часть дисперсии на 5 частей азота в верхнюю часть вертикального цилиндра с диаметром 1,5 м и высотой 10 м. Резервуар помещают в нижнюю часть цилиндра, который содержит жидкий азот, в котором собирают микрогранулы, содержащие бактерии, чей диаметр варьирует между 0,1 и 0,5 мм. Микрогранулы затем помещают в псевдоожиженный слой и опрыскивают над слоем спиртовым раствором, содержащим 8% зеина, в таком количестве, чтобы вокруг микрогранул образовался слой из зеина, составляющий 5% от их массы.

Затем микрогранулы включают в продуктовую композицию, предназначенную для облегчения всасывания минеральных веществ кишечными клетками.

Пример 5 Концентрированную основу для мороженого готовят смешением при 60-65^oС в течение 20 мин примерно 11% молочного жира, 8,8% сухого молока (сухое обезжиренное молоко), 25% сахарозы, 5% глюкозного сиропа и 0,6% Emulstab® SE30. Основу гомогенизируют при 72-75^oС и давлении 210 бар (2 стадии при 210/50 бap), пастеризуют при 85^oС в течение 22 сек (пастеризатор APV, Франция, Evreux, 400 л/час), охлаждают до 4^oС и к этому добавляют 40% молока, сквашенного штаммом Lactobacillus johnsonii La1 (5•10⁸ КОЕ/мл) и Bifidobacterium longum Bi16 (3•10⁸ КОЕ/мл). Состав этой концентрированной основы представлен в таблице 3.

После созревания сливок в течение 12 час при 5^oС их замораживают до взбитости 95% по объему (мороженица Crepaco, Франция, Evreux, 160 л продукта/час).

Готовят тесто для вафель, которое содержит 10% фрукто-олигосахарида Raftilose® L30 (Raffinerie Tirlemontoise SA., BE) по рецепту, представленному в таблице 4. После выпечки из вафель обычно формируют конусный стаканчик. После охлаждения внутренность конусных стаканчиков покрывают опрыскиванием жирной пленкой, и затем конусные стаканчики заполняют взбитым мороженым, описанным выше. На вафельный конусный стаканчик используют 130 мл взбитого мороженого (примерно 65 г) и 5 г шоколада (распыление над мороженым).

Таким образом, обеспечивается 1,1 г волокон и примерно 10⁸ КОЕ/г lactobacilli на рожок с мороженым. Волокна, способствуя специфическому развитию lactobacilli в кишечном тракте, способствуют усваиваемости минеральных веществ.

Формула изобретения

1. Применение lactobacilli, способных пребывать живыми в кишечнике в качестве ингредиента при приготовлении пищевой композиции для энтерального введения для облегчения или улучшения всасывания минеральных веществ у млекопитающих.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что lactobacilli являются бактериями Lactobacillus, которые способны прилипать к кишечным клеткам.

3. Применение по п.2, отличающееся тем, что lactobacilli являются Lactobacillus johnsonii штамм CNCM I-1225.

4. Применение по п.1, отличающееся тем, что пищевая композиция для энтерального введения содержит 10⁷-10¹¹ КОЕ lactobacilli.

5. Применение по п.1, отличающееся тем, что пищевая композиция для энтерального введения облегчает всасывание кальция, магния, железа и/или цинка.

6. Применение по п.1, отличающееся тем, что пищевая композиция для энтерального введения содержит молочные белки.

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что пищевая композиция для энтерального введения является детским питанием, включающим гипоаллергенные гидролизаты молочных белков.

8. Применение по п.1, отличающееся тем, что пищевая композиция для энтерального введения дополнительно содержит пробиотические волокна.

9. Применение lactobacilli в качестве ингредиента при приготовлении пищевой композиции для энтерального введения для лечения или профилактики недостатка минеральных веществ.

10. Способ увеличения всасывания минеральных веществ из пищи, заключающийся в энтеральном введении млекопитающему пищевой композиции по п.1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7