Способ оценки антиоксидантного потенциала липопротеинов низкой плотности

 

Изобретение относится к клинической биохимии. Способ заключается в получении ЛНП из сыворотки крови осаждением в присутствии гепарина (200 ЕД/мл сыворотки) и хлорида марганца (50 мМ/мл сыворотки) при 0^oС, промывании осажденных ЛНП 0,9%-ным раствором хлорида натрия, растворении их в 1 мл 1 М раствора хлорида натрия, измерении в них концентрации белка по общепринятому методу Лоури, после чего к 0,25 мл ЛНП добавляют 0,5 мл этилового спирта, встряхивают, добавляют 0,25 мл аскорбиновой кислоты и 0,5 мл 10 N КОН (для омыления образцов), затем пробы инкубируют в водяной бане при 70^oС в течение 40 мин, остужают, добавляют 2 мл гексана, тщательно встряхивают 3 мин, верхний гексановый слой переносят в другие пробирки и далее определяют в нем концентрации витаминов Е и А спектрофлюориметрическим методом. Длина волны для ретинола составляет Ех 340, Em 490 нм, для α-токоферола - Ех 290, Em 334 нм. Результаты выражают для витамина Е - в мг/мг белка ЛНП, для витамина А - в мкг/мг белка ЛНП. Изобретение обеспечивает информативность, простоту способа, занимает непродолжительное время исследования и может использоваться в условиях клинических биохимических лабораторий.

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к способам определения концентраций витаминов, и предназначается для оценки антиоксидантного потенциала липопротеинов низкой плотности (ЛНП) и, таким образом, степени их защищенности от окислительных процессов.

Согласно современным представлениям в патогенезе атеросклероза и многих других заболеваний ключевую роль играет нарушение баланса окислительно-антиоксидантной системы крови, в первую очередь ЛНП. Окисленные ЛНП приобретают атерогенные свойства, они активно захватываются макрофагами, которые трансформируются в пенистые клетки - морфологический маркер атеросклеротического процесса. Степень окисленности ЛНП определяют путем определения в них концентрации продуктов перекисного окисления липидов. Кроме того, существуют методы оценки "предрасположенности" ЛНП к окислительной модификации. Одним из таких является метод оценки устойчивости ЛНП к окислению. Показатель устойчивости ЛНП к окислению отражает, с одной стороны, количество продуктов ПОЛ в ЛНП (перекиси липидов, диены, оксистеролы, малоновый диальдегид и др.) и, с другой стороны, их антиоксидантный потенциал (содержание в ЛНП эндогенных антиоксидантов). Из эндогенных антиоксидантов в ЛНП наибольшее значение имеет витамин Е (α-токоферол). Этот антиоксидант является основным для ЛНП, количество его в ЛНП превалирует над другими жирорастворимыми антиоксидантами. Витамин Е первым расходуется при окислении ЛНП, и играет ключевую роль в защите ЛНП от окислительных изменений. Витамин А (ретинол) содержится в ЛНП в намного меньшем количестве, но также препятствует их окислительной модификации. Таким образом, по концентрации жирорастворимых антиоксидантов в ЛНП (витаминов Е, А и др.) можно судить о степени защищенности ЛНП против окисления.

На сегодняшний день немного известно простых способов оценки концентрации жирорастворимых витаминов в ЛНП, а существующие способы очень трудоемкие и, в основном, являются комбинированной модификацией способов оценки концентраций антиоксидантов в сыворотке крови. Поэтому они применительно к современному этапу исследований в области патогенеза атеросклероза и других заболеваний выглядят устаревшими и менее информативными. Так, часто используется метод исследования концентраций жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови с использованием жидкостной хроматографии высокого давления [1], который является длительным, трудоемким и требует наличия дорогостоящего оборудования. Если этот метод применяют к самим ЛНП, то последние при этом обычно выделяются методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности КВг в течение 24 часов и более в условиях экспериментальных лабораторий научно-исследовательских институтов [2].

С другой стороны, известен быстрый метод выделения ЛНП из сыворотки крови осаждением гепарином [2, 3], при котором ЛНП из сыворотки крови осаждают в присутствии гепарина (200 ЕД/мл сыворотки) и хлорида марганца (50 мМ/мл сыворотки), перемешивают, оставляют на 30 минут при 0^oС, центрифугируют 30 минут при 1500 об/мин при 0^oС, после чего осадок содержит преципитированные ЛНП.

Прототипом (основой) заявляемого изобретения явился способ исследования концентрации витаминов В (α-токоферола) и А (ретинола) также в сыворотке крови, при котором к 0,25 мл сыворотки крови добавляют 0,5 мл этилового спирта, встряхивают, добавляют 0,25 мл аскорбиновой кислоты и 0,5 мл 10 N КОН (для омыления образцов), затем пробы инкубируют в водяной бане при 70^oС в течение 40 минут, остужают, добавляют 2 мл гексана, тщательно встряхивают 3 минуты, верхний гексановый слой переносят в другие пробирки и, далее, определяют в нем концентрации витаминов Е и А спектрофлюориметрическим методом. Длина волны для ретинола составляет Ex 340, Em 490 нм, для токоферола - Ex 290, Em 334 нм [4].

Недостатком данного метода является низкая информативность и недостаточно объективная оценка состояния антиоксидантной системы самих ЛНП. Поэтому показатели концентрации антиоксидантов (особенно жирорастворимых) в сыворотке крови, как уже указывалось выше, менее современны и информативны по сравнению с таковыми в ЛНП. Кроме того, ЛНП являются и транспортной формой жирорастворимых витаминов. Все вместе эти аргументы свидетельствуют о недостатках данного метода применительно к оценке состояния окислительно-антиоксидантной системы ЛНП.

Заявляемый способ отличается от известного тем, что вместо сыворотки крови концентрация жирорастворимых витаминов Е и А измеряется непосредственно в самих ЛНП. ЛНП выделяют быстрым гепарин-осаждающим методом путем добавления к 1 мл сыворотки крови 200 ЕД гепарина (из фармакопейного раствора, содержащего 5000 ЕД/мл), перемешивания, добавления 75 мкл 1 М раствора хлорида марганца, перемешивания. Пробу оставляют на 30 минут при 0^oС, центрифугируют при 0^oС 30 минут, осадок промывают 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия, центрифугируют, осажденные ЛНП растворяют в 1 мл 1 М раствора хлорида натрия. В полученных ЛНП измеряют белок по общепринятому методу Лоури и соавторов (1951 г.) и в 0,25 мл ЛНП определяют концентрацию витаминов Е и А по вышеописанному спектрофлюориметрическому методу [3]. Результаты выражают для витамина Е - в мг/мг белка ЛНП, для витамина А - в мкг/мг белка ЛНП.

Преимуществом предлагаемого способа является его информативность и диагностическая значимость в отношении состояния антиоксидантной системы ЛНП, так как α-токоферол и ретинол являются основными жирорастворимыми ангиоксидантами этих частиц, препятствующими возникновению окислительных изменений в этих частицах.

Проведено сравнительное исследование между известным способом [4] определения концентрации витаминов Е и А в сыворотке крови и предлагаемым способом определения концентрации витаминов Е и А в ЛНП, полученных методом осаждения с гепарином, из тех же сывороток у 68 мужчин. Тридцать восемь человек из них имели нарушения липидного обмена - дислипопротеинемии II типа (ДЛП), а 30 были с нормолипидемией. Кроме того, у всех этих мужчин был исследован показатель устойчивости ЛНП к окислению in vitro. Были получены следующие результаты. У мужчин с ДЛП как устойчивость ЛНП к окислению, так и концентрации витаминов Е и А в сыворотке крови были значительно (р<0,01) снижены ((10,3±0,7) и (0,55±0,05) мкг/мл сыворотки соответственно) в сравнении с мужчинами без ДЛП ((13,01±0,8) и (0,69±0,07) мкг/мл сыворотки соответственно). Мы исследовали концентрации витаминов Е и А непосредственно в ЛНП (заявляемым способом) у этих же пациентов. Оказалось, что у мужчин с ДЛП уровни витаминов Е и А в ЛНП были также ниже (р<0,05) и составили (1,35±0,22) мг/мг белка ЛНП и (56,7±9,9) мкг/мг белка ЛНП соответственно в сравнении с мужчинами без ДЛП ((1,83±0,25) мг/мг белка ЛНП и (79,9±11,2) мкг/мг белка ЛНП соответственно).

Кроме того, при этом исследовании была обнаружена сильная положительная корреляция (r= +0,79, р<0,05) между известным и заявляемым способами определения жирорастворимых антиоксидантов (витаминов Е и А). Таким образом, применение обоих способов выявляет достоверное снижение концентрации витаминов Е и А как в сыворотке крови, так и в ЛНП у пациентов с ДЛП по сравнению с мужчинами с нормолипидемией. Полученные с помощью заявляемого способа данные согласуются с показателем устойчивости ЛНП к окислению у обследованных мужчин и не противоречат данным мировой и отечественной литературы. Действительно, согласно показателям заявляемого способа концентрация α-токоферола в ЛНП значительно выше (в 26-28 раз), чем ретинола, что свидетельствует о преобладании витамина Е в ЛНП как основного защитного фактора против их окисления.

Таким образом, заявляемый способ является информативным и диагностически значимым, так как позволяет определять концентрации витаминов Е и А непосредственно в самих ЛНП, то есть оценивать антиоксидантный потенциал ЛНП.

Преимуществами способа являются относительная простота технического выполнения, так как работа осуществляется силами одного врача-лаборанта и небольшое время исследования, поскольку обследование одного человека занимает максимально 4 часа.

Способ может быть использован в условиях клинических биохимических лабораторий с целью оценки антиоксидантного потенциала ЛНП путем определения концентраций жирорастворимых витаминов Е и А в ЛНП.

Источники, принятые во внимание: 1. Milne D.B., Bottnen J. Retinol, α-tocopherol, lycopene and β-carotene simultaneously determined in plasma by liquid chromatography. // Clin. Chem. -1986. - V.32. -P. 874-876.

2. Lindgren F. T., Silvers A., Jutagir R. et al. A comparison of simplified methods for lipoprotein quantification using the analitic ultracentrifuge as a standart //Lipids - 1977.- V. 12, N. 3.- Р. 278-282.

3. Burstein M., Scholnik H.R. Lipoprotein-polyanion-metal interactions // Adv. Lipid Res. - 1973. - V. 11.- P. 63-108.

4. Taylor S.L., Lamden M.P., Tappel A.L. Sensitive fluorometric method for tissue tocopherol analysis. //Lipids - 1976. - V. 11. - N. 7. - Р. 530-538.

Формула изобретения

Способ оценки антиоксидантного потенциала липопротеинов низкой плотности (ЛНП) путем определения концентрации витаминов Е и А непосредственно в ЛНП, включающий добавление к 0,25 мл исследуемой биологической пробы 0,5 мл этилового спирта, встряхивание, последующее добавление 0,25 мл аскорбиновой кислоты и 0,5 мл 10 N КОН, инкубацию пробы в водяной бане при 70^oС в течение 40 мин, остужение, добавление 2 мл гексана, тщательное встряхивание 3 мин, забор верхнего гексанового слоя, перенос его в другие пробирки и далее определение в нем концентрации витаминов Е и А спектрофлюориметрическим методом и оценку результатов, отличающийся тем, что в качестве биологической пробы используют ЛНП, выделенные гепариносаждающим методом в присутствии хлорида марганца, отцентрифугированные, промытые 0,9%-ным раствором хлорида натрия, растворенные в 0,5 мл 1 М раствора хлорида натрия и с измеренной в них концентрацией белка.