Мумбайстатин, способ его получения и его применение в качестве фармацевтического препарата

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового соединения мумбайстатина, его фармацевтически приемлемых солей или сложных и простых эфиров. Мумбайстатин является ингибитором глюкозо-6-фосфат транслоказы, имеет молекулярную формулу С₂₈Н₂₀О₁₂ и относится к классу хиноновых соединений. Получают указанное соединение культивированием микроорганизма вида Streptomyces HIL-008003 (DSM 11641) и при необходимости переводят его в фармацевтически приемлемые соли или простые и сложные эфиры. Представителем сложных эфиров мумбайстатина является лактон L970860. Мумбайстатин и его производные используют для приготовления фармацевтических препаратов и композиций, предназначенных для лечения сахарного диабета. Все заявленные соединения обладают более высокой ингибиторной активностью по отношению к глюкозо-6-фосфат транслоказы. 10 c.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл.

Настоящее изобретение относится к соединению, мумбайстатину, которое получено путем культивирования микроорганизма HIL-008003 (DSM 11641), и к его фармацевтически приемлемым солям и производным. Мумбайстатин является ингибитором глюкозо-6-фосфат транслоказы и может быть использован в лечении сахарного диабета. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения мумбайстатина, к микроорганизму HIL-008003 (DSM 11641), к применению мумбайстатина и его фармацевтически приемлемых солей и производных в качестве фармацевтических препаратов, в частности к их применению в лечении сахарного диабета и к фармацевтическим композициям, содержащим мумбайстатин или его фармацевтически приемлемую соль или производное.

Основной характеристикой сахарного диабета является повышенная скорость образования глюкозы в печени. В частности, наблюдается значительная корреляция между увеличением уровня глюкозы в плазме при инсулиннезависимом сахарном диабете (NIDDM) и образованием глюкозы в печени. Глюкоза вырабатывается в печени двумя путями - глюконеогенезом и глюкогенолизом. Конечные стадии обоих путей катализируются с помощью микросомальной глюкозо-6-фосфатазы, ключевого фермента в гомеостатической регуляции уровня глюкозы в крови. Известно, что уровень этого фермента повышается как при экспериментальном диабете, так и при патологическом состоянии, вызванном диабетом. Поэтому вмешательство в эту ферментативную систему должно привести к снижению продуцирования глюкозы в печени.

Глюкозо-6-фосфатаза печени является многокомпонентной системой, состоящей по крайней мере из трех функциональных активностей: глюкозо-6-фосфат транслоказы (Т1), глюкозо-6-фосфат фосфогидролазы и фосфат/пирофосфат транслоказы (Т2). Глюкозо-6-фосфат транслоказа способствует транспорту глюкозо-6-фосфата в просвет эндоплазматического ретукулума (ER). Фосфогидролаза, активный участок которой расположен на поверхности просвета ER, гидролизует глюкозо-6-фосфат и освобождает глюкозу и фосфат в просвет. В то время, как выход фосфата осуществляется с помощью фосфат/пирофосфат транслоказы, точный механизм выхода глюкозы все еще неясен.

Высокая степень субстратной специфичности глюкозо-6-фосфат транслоказы делает ее потенциальной мишенью для фармакологических средств, применяемых в лечении сахарного диабета. Таким образом, из физиологических сахарофосфатов только глюкозо-6-фосфат переносится с помощью транслоказы. По сравнению с этим, фосфатаза проявляет неспецифические свойства и, как известно, гидролизует ряд органических эфиров фосфорной кислоты.

Серия неспецифических ингибиторов глюкозо-6-фосфатазы была описана в литературе, например флорризин (J. Biol. Chem. 242, 1955-1960 (1967)), 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойная кислота (Biochem. Biophys. Res.Commun. 48, 694-699 (1972)), 2,2'-диизотиоцианатостильбен и 2-изотиоцианато-2'-ацетоксистильбен (J. Biol. Chem. 255, 1113-1119 (1980)). Первые применяемые в терапевтических целях ингибиторы глюкозо-6-фосфатазной системы описаны в Европейских патентных заявках ЕР-А-587087 и ЕР-А-587088. Кодайстатины А, В, С и D, описанные в международной патентной публикации WO 98/47888, являются первыми ингибиторами глюкозо-6-фосфат транслоказы из микробных источников.

В настоящее время обнаружено, что из другого микробного источника получено новое соединение с высокой ингибиторной активностью по отношению к глюкозо-6-фосфат транслоказе, которое названо мумбайстатином. Таким образом, настоящее изобретение относится к соединению, названному мумбайстатином, которое имеет молекулярную формулу C₂₈H₂₀O₁₂ и охарактеризовано одним или более физико-химическим и спектральным свойствами, приведенными ниже, такими как спектроскопические данные ¹H ЯМР, представленные в виде спектра ¹Н ЯМР на фигуре 9, и спектроскопические данные ¹³С ЯМР, представленные в виде спектра ¹³С ЯМР на фигуре 10, и к его фармацевтически приемлемым солям и производным, как например сложным эфирам, простым эфирам и очевидным химическим эквивалентам, включая все стереоизомерные формы и таутомерные формы.

Мумбайстатин имеет неизвестную прежде новую структуру, принадлежащую к хиноновому классу соединений. Просмотр литературных данных в указателе кратких описаний химических соединений с использованием ключей для поиска в виде молекулярной формулы установил, что мумбайстатин является новым соединением. Другого соединения, обладающего структурными характеристиками мумбайстатина, нет.

Мумбайстатин получают путем культивирования микроорганизма, на который ссылаются как на культуру No HIL-008003 или также на культуру No Y-9645974 (названную культурой HIL-008003). Используемый для получения мумбайстатина микроорганизм был выделен из образца почвы, собранного со дна реки Hiranyakeshi около Amboli, Maharashtra, Индия. Микроорганизм HIL-008003 был идентифицирован как Streptomyces litmocidini. Микроорганизм был депонирован 4 июля 1997 г. в Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh), Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Germany и ему присвоен номер DSM 11641.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения нового соединения, названного мумбайстатином, и его фармацевтически приемлемых солей и производных из вида Streptomyces HIL-008003, из его мутантов и вариантов. Вышеуказанный способ включает выращивание культуры No HIL-008003, ее мутантов или вариантов при аэробных условиях в питательной среде, содержащей один источник углерода или более и один источник азота или более и, необязательно, питательные неорганические соли и/или микроэлементы с последующим выделением вышеуказанного соединения и очисткой обычным способом.

Питательная среда предпочтительно содержит источники углерода, азота и питательные неорганические соли и, необязательно, микроэлементы. Источниками углерода являются, например, крахмал, глюкоза, сахароза, декстрин, фруктоза, меласса, глицерин, лактоза или галактоза, предпочтительно глюкоза. Источниками азота являются, например, мука из соевых бобов, мука из арахиса, дрожжевой экстракт, мясной (говяжий) экстракт, пептон, триптон, солодовый экстракт, кукурузный экстракт, желатин или гидролизат казеина, предпочтительно мука из соевых бобов и кукурузный экстракт.

Питательными неорганическими солями и микроэлементами являются, например, вторичный кислый фосфат натрия, вторичный кислый фосфат калия, хлорид натрия, хлорид кобальта, хлорид кальция, карбонат кальция, нитрат калия, сульфат аммония или сульфат магния, предпочтительно хлорид кобальта и карбонат кальция.

Выращивание культуры No HIL-008003 обычно выполняют при температуре от 25 до 30^oС и рН от 6,0 до 8,0. Предпочтительно культуру No HIL-008003 выращивают при 27^oС (±1^oС) и рН 7,0.

Ферментацию HIL-008003 предпочтительно проводят в течение приблизительно от 40 до 70 часов, когда достигается оптимальный выход мумбайстатина согласно настоящему изобретению. Особенно предпочтительным является проводить ферментацию в течение приблизительно от 40 до 48 часов в условиях выращивания культуры в питательной среде, например во флаконах со встряхиванием, а также в лабораторных ферментерах. Если желательно, то ®Десмофен (окись полипропилена) может быть использован в качестве противовспенивающего агента в ферментерах. Ход процесса ферментации и образования мумбайстатина можно контролировать посредством измерения степени ингибирования активности глюкозо-6-фосфат транслоказы в необработанных и разрушенных ®Tритоном Х-100 микросомах печени крысы в титрационных микропланшетах при комнатной температуре, используя колориметрический анализ, описанный в Methods in Enzymology 174, 58-67 (1989) с некоторыми модификациями. В полученной культуральной среде мумбайстатин находится, главным образом, в культуральном фильтрате и, таким образом, может быть выделен путем экстракции культурального фильтрата несмешивающимся с водой растворителем, как например, этилацетатом, дихлорметаном, хлороформом или бутанолом при рН 5-8 или с помощью гидрофобной хроматографии, используя полимерные смолы, такие как ®Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan), ®Amberlite XAD (Rohm and Haas Industries, USA), или активированный уголь, или с помощью ионообменной хроматографии при рН 5-8. Предпочтительным способом является адсорбция на ®Diaion HP-20 с последующей десорбцией соединения при использовании растворителя для элюирования, как например вода, метанол, ацетон, ацетонитрил, н-пропанол, изопропанол или их сочетания. Концентрирование и лиофилизация активных элюатов дают сырое вещество.

Сырой материал в дальнейшем может быть очищен с помощью любого из следующих способов: обычной хроматографии с нормальной фазой, используя алюминий или силикагель в качестве стационарной фазы и растворитель для элюирования, например этилацетат, хлороформ, метанол или их сочетания; хроматографии с обращенной фазой, используя в качестве стационарной фазы материал, подобный силикагелю, как например диметилоктадецилсилилсиликагель, также называемый RP-18, или диметилоктилсилилсиликагель, также называемый RP-8, и растворитель для элюирования, как например вода, буферы, такие как фосфатный, ацетатный, цитратный (рН 2-8), и органические растворители, такие как метанол, ацетонитрил, ацетон, тетрагидрофуран или сочетания этих растворителей; гель-проникающей хроматографии, используя смолы, такие как ®Sephadex LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Sweden), TSKgel ®Toyopearl HW-40F (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan) в растворителях, как например метанол, хлороформ, ацетон, этилацетат или сочетания этих растворителей, или ®Sephagex G-10 и G-25 в воде, или противоточной хроматографии, используя двухфазную систему для элюирования, состоящую из двух или более растворителей, таких как вода, метанол, этанол, изопропанол, н-пропанол, тетрагидрофуран, ацетон, ацетонитрил, метилен-хлорид, хлороформ, этилацетат, петролейный эфир, бензол и толуол. Эти способы могут быть применены повторно или могут быть применены комбинации различных способов. Предпочтительным способом является хроматография на ®Toyopearl с последующей хроматографией с обращенной фазой на модифицированном силикагеле (RP-18).

Соединение мумбайстатин может быть превращено в фармацевтически приемлемые соли или производные, подобные сложным и простым эфирам и другим действительным химическим эквивалентам, которые все охвачены настоящим изобретением. Кроме того, изобретение охватывает все соли и производные мумбайстатина, которые сами по себе не подходят для использования в качестве фармацевтических препаратов, но которые могут быть использованы в качестве промежуточных соединений для получения фармацевтически приемлемых солей и производных. Изобретение охватывает мумбайстатин и все его соли и производные во всех их стереоизомерных формах и таутомерных формах. Соли и производные могут быть получены с помощью стандартных процедур, известных специалистам в данной области. Соли, такие как, например, соли натрия и калия, могут быть получены путем обработки мумбайстатина подходящими основаниями натрия или калия. Эфиры могут быть получены, например, путем взаимодействия мумбайстатина с карбоновыми кислотами в присутствии реагентов, таких как дициклогексилкарбодиимид (DCC) или путем обработки соединения ацилирующими агентами, такими как хлорангидриды. Другие способы получения эфиров даны в литературе, например в J. March, Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, John Wiley & Sons, 1992.

Сложные эфиры мумбайстатина, охваченные настоящим изобретением, включают внутримолекулярные сложные эфиры, т.е. лактоны. Соединение, упоминаемое в качестве предмета настоящего изобретения, является соединением, которое названо L970860, и его фармацевтически приемлемыми солями и производными во всех их стереоизомерных и таутомерных формах. Соединение L970860 является лактоном, получаемым обработкой мумбайстатина трифторуксусной кислотой. Оно имеет молекулярную формулу C₂₈H₁₈О₁₁ и охарактеризовано с помощью одного или более физико-химического и спектрального свойств, представленных ниже, таких как спектроскопические данные ¹H ЯМР, представленные в виде спектра ¹H ЯМР на фиг. 7 (a, в, c,) и спектроскопические данные ¹³С ЯМР, представленные в виде спектра ¹³С ЯМР на фиг. 8 (a, в). Лактонизацию мумбайстатина, приводящую к L970860, можно использовать для выделения или очистки мумбайстатина.

Простые эфиры могут быть получены из мумбайстатина, например путем взаимодействия с алкилирующими агентами в щелочных условиях. Другие способы получения простых эфиров описаны в литературе, например в Advanced Organic Synthesis, 4^th Edition, J. March, John Wiley & Sons, 1992.

Мумбайстатин в значительной степени ингибирует глюкозо-6-фосфат транслоказу микросом печени крысы. Полученные при фармакологическом тестировании результаты представлены ниже. Мумбайстатин и его фармацевтически приемлемые соли и производные используют в качестве фармацевтически активных ингредиентов, в частности в лечении сахарного диабета и вообще в лечении или профилактике состояний, которые вызваны или связаны с повышенной активностью глюкозо-6-фосфат транслоказы, или состояний, при которых рекомендуется снизить активность глюкозо-6-фосфат транслоказы. Мумбайстатин и его фармацевтически приемлемые соли и производные можно вводить животным, предпочтительно млекопитающим животным и, в частности, человеку в качестве фармацевтических препаратов самих по себе, в смеси с другим препаратом и в виде фармацевтических композиций, которые позволяют вводить препараты энтерально или парентерально.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к мумбайстатину и к его фармацевтически приемлемым солям и производным для их использования в качестве фармацевтических препаратов и к использованию мумбайстатина и его фармацевтически приемлемых солей и производных для получения лекарственных средств для снижения активности глюкозо-6-фосфат транслоказы, в частности для получения лекарственных средств для лечения сахарного диабета. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат эффективное количество мумбайстатина и/или одну или более фармацевтически приемлемых солей и/или производных вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Мумбайстатин может быть введен орально, внутримышечно, внутривенно или другими способами введения. Фармацевтические композиции, которые содержат только мумбайстатин или его фармацевтически приемлемую соль или производное или в комбинациях, можно получить согласно стандартным способам путем смешивания соединения (соединений) с одним или более фармакологически приемлемыми носителями и/или вспомогательными агентами, как например наполнителями, эмульгаторами, смазочными агентами, маскирующими агентами, красителями или буферными веществами, и превращения смеси в соответствующую фармацевтическую форму, как например представленную в виде таблеток, покрытых оболочкой таблеток, капсул или суспензии или раствора, подходящих для энтерального или парентерального введения.

Примерами вспомогательных веществ и/или наполнителей являются крахмал, трагакант, лактоза, тальк, агар-агар, полигликоли, этанол и вода. Подходящими и предпочтительными для парентерального введения являются суспензия или раствор в воде. Кроме того, можно вводить активные вещества как таковые, без носителей или разбавителей, в соответствующей форме, например в виде капсул. Фармацевтические композиции, содержащие мумбайстатин или его фармацевтически приемлемую соль или производное, могут также включать другие фармацевтически активные ингредиенты. Обычные композиции, содержащие галеновы препараты, и способ введения, а также диапазон дозировок, который соответствует конкретному случаю, зависят от индивидуумов, которые подвергаются лечению, или от соответствующего состояния или заболевания и могут быть оптимизированы посредством способов, известных в данной области.

Мумбайстатин и его соли и производные, помимо использования в качестве фармацевтически активных ингредиентов и промежуточных соединений в получении производных, могут быть использованы как вспомогательные агенты для диагностических целей, например для диагностики in vitro и для научных целей в биохимических исследованиях, в которых желательно достичь ингибирования глюкозо-6-фосфат транслоказы.

Настоящее изобретение иллюстрировано следующими примерами, которые не ограничивают объем изобретения.

Аббревиатуры: МеОН - метанол, DMSO - диметилсульфоксид, TFA - трифторуксусная кислота.

Пример 1. Выделение культуры HIL-008003 из почвы (a) Композиция питательной среды для выделения, г: Кукурузный крахмал - 10,0 Казеин - 1,0 Пептон - 1,0 Дрожжевой экстракт - 1,0 К₂НРO₄ - 0,5
Агар порошкообразный - 13,0
Деминерализованная вода - 1,0 л
рН - 7,5
(b) Выращивание почвенной культуры на чашках и выделение
10 г почвы, собранной со дна реки Hiranyakeshi, около Amboli, Maharashtra, Индия, добавляли к 90 мл стерилизованной деминерализованной воды в колбе Эрленмейера объемом 250 мл, которую затем встряхивали в течение 2 часов с помощью ротационного встряхивателя (220 об/мин). Затем указанную выше суспензию почвы последовательно в 10 стадий разбавляли вплоть до 10^-5. Из последнего разведения 1 мл суспензии помещали в центр стерильной стеклянной чашки Петри (диаметр 15 см), в которую затем вливали приблизительно 50 мл указанной выше среды, дополненной амфотерицином В в качестве противогрибкового агента в количестве 25 мкг/мл. До вливания в чашки Петри среду охлаждали до 45^oС и содержимое чашек тщательно перемешивали круговыми движениями в горизонтальной плоскости. Смесь почвенной суспензии и среды оставляли для оседания и инкубировали при (28^oС±1)^oС в течение 7 дней. Чашки Петри периодически проверяли и культуру микроорганизма HIL-008003 (культура Y-9645974) отделяли от других растущих микроорганизмов.

Пример 2. Содержание культуры НIL-008003
Культуру No HIL-008003 содержали в следующей среде, г:
Солодовый экстракт - 10,0
Дрожжевой экстракт - 4,0
Глюкоза - 4,0
Агар порошкообразный - 13,0
Деминерализованная вода - 1,0 л
рН - 7,5
После тщательного растворения указанных выше ингредиентов при нагревании среду разливали в пробирки и затем стерилизовали при 121^oС в течение 20 минут. Затем пробирки охлаждали и оставляли для затвердевания в наклонном положении. На агаровые косяки наслаивали культуру No HIL-008003 с помощью проволочной петли и инкубировали при (28±1)^oС до тех пор, пока не достигался хороший рост. Хорошо выращенные культуры хранили в холодильнике при 8^oС.

Пример 3. Ферментация культуры HIL-008003 в колбах со встряхиванием
Композиция среды для инокулята, г:
Глюкоза - 15,0
Мука из соевых бобов - 15,0
Кукурузный экстракт - 5,0
NaCl - 5,0
СаСО₃ - 2,0
Деминерализованная вода - 1,0 л
рН - 7,0
Вышеуказанную среду для инокулята разливали в количестве 80 мл в колбы Эрленмейера объемом 500 мл и автоклавировали при 121^oС в течение 20 минут. Колбы охлаждали до комнатной температуры и затем в каждую колбу с помощью петли вносили вышеуказанную хорошо выращенную культуру из примера 2 и перемешивали с помощью ротационного встряхивателя в течение 72 часов при 240 об/мин при (27±1)^oС с получением инокулята.

Композиция среды для продуцирования, г:
Глюкоза - 20,0
Мука соевых бобов - 10,0
СаСО₃ - 0,2
Хлорид кобальта - 0,001
Деминерализованная вода - 1,0 л
рН - 7,0
Среду для продуцирования разливали по 60 мл в колбы Эрленмейера объемом 500 мл и автоклавировали при 121^oС в течение 20 минут. Колбы охлаждали до комнатной температуры и затем в них вносили вышеуказанный инокулят (1% об/об). Ферментацию выполняли на ротационном встряхивателе при 240 об/мин при температуре (27±1)^oС в течение 40-48 часов.

Продуцирование мумбайстатина контролировали с помощью определения степени ингибирования глюкозо-6-фосфат транслоказы. После харвестирования клеток бульонную культуру центрифугировали и выделяли мумбайстатин из культурального фильтрата и очищали, как описано в примере 5.

Пример 4. Ферментация культуры HIL-008003 в ферментерах
Стадия 1: Получение инокулята в колбах со встряхиванием Среду для инокулята из примера 3 разливали по 160 мл в колбы Эрленмейера объемом 1 литр и автоклавировали в течение 20 минут. Инокулят выращивали в этих колбах, как описано в примере 3.

Стадия 2: Получение инокулята в ферментере
80 л Среды для инокулята, которая описана в примере 3, стерилизовали in situ в ферментере Marubishi емкостью 100 литров в течение 45 минут при 121^oС, охлаждали до (27±1)^oС и вносили 4,5 литра инокулята, упомянутого выше.

Ферментацию проводили в режиме со следующими параметрами:
Температура - 27^oС (±0,5^oС)
Перемешивание - 80 об/мин
Аэрация - 50 л/мин
Время харвестирования клеток - 24 ч
Стадия 3: Ферментация в большом масштабе
700 л Среды для продуцирования, описанной в примере 3, вместе со 150 мл ®Десмофена (окись пропилена) в качестве противовспенивающего агента стерилизовали in situ в ферментере Marubishi емкостью 1000 л в течение 45 минут при 121^oС, охлаждали до (27±1)^oС и вносили 75 л инокулята со стадии 2.

Ферментацию проводили в режиме со следующими параметрами:
Температура - (27±0,5)^oС
Перемешивание - 50 об/мин
Аэрация - 450 л/мин
Время харвестирования клеток - 40-44 ч
Продуцирование соединения контролировали путем измерения степени ингибирования глюкозо-6-фосфат транслоказы. По окончании ферментации рН бульонной культуры был 6,0-7,0. Бульонную культуру центрифугировали после наращивания клеток и ингибитор глюкозо-6-фосфат транслоказы, мумбайстатин, выделяли из культурального фильтрата, как описано в примере 5.

Пример 5. Выделение и очистка мумбайстатина
Приблизительно 1000 л бульонной культуры наращивали и отделяли от мицелия (12 кг) центрифугированием. Было обнаружено, что целевое соединение, мумбайстатин, находится, главным образом, в культуральном фильтрате. Культуральный фильтрат (730 л) пропускали через колонку ®Diaion HP-20 (28 л, 3-4% об/об). Колонку тщательно промывали деминерализованной водой (250 л) и, затем элюировали с помощью ступенчатого градиента МеОН в воде. Таким образом, элюирование проводили с помощью 10% МеОН (120 л) и 40% МеОН (300 л). Фракции собирали в объеме 15 л. Активные элюаты (15х16 л), полученные элюцированием 40% МеОН, объединяли, концентрировали при пониженном давлении 10-100 мм рт. ст. при 35^oС и лиофилизировали с получением 240 г активного сырого материала, имеющего IC₅₀, равную 5 мкг/мл.

Сырой материал (240 г) пропускали через вторую колонку HP-20. Колонку тщательно промывали деминерализованной водой (150 л) и затем элюировали с помощью ступенчатого градиента МеОН в воде. Таким образом, элюирование проводили с помощью 20% МеОН (80 л и 40% МеОН (100 л). Фракции собирали объемом 10 и 2 л, соответственно. Активные элюаты (2•30 л), полученные элюированием 40% МеОН, объединяли, концентрировали при пониженном давлении 10-100 мм рт.ст. при 35^oС и лиофилизировали с получением 20 г обогащенного материала, имеющего IC₅₀, равную 1 мкг/мл.

Таким образом полученный обогащенный материал очищали с помощью двух последовательных гель-проникающих хроматографий на ®Sephadex LH-20 с различными соотношениями субстрата к гелю. Таким образом, вышеуказанный обогащенный материал пропускали отдельно в 4 партии, каждую по 5 г, через стеклянную колонку 4х120 см ®Sephadex LH-20 (1,5 л). Подвижной фазой была вода, а скорость потока поддерживали 2,5 мл/мин. Фракции собирали объемом по 25 мл. Активные элюаты контролировали с помощью ВЭЖХ на колонке ®Lichrocart 100 RP-18 (250х4 мм), используя градиент от 0,1% водной трифторуксусной кислоты до CH₃CN в течение 20 минут при скорости потока 1 мл/мин и детектировании при 270 нм.

Активные элюаты с целевым компонентом объединяли и концентрировали при пониженном давлении 10-100 мм рт.ст. при 35^oС и лиофилизировали с получением 1 г высокоочищенного материала, имеющего IC₅₀, равную 0,1-0,3 мкг/мл.

Указанный выше материал в дальнейшем очищали в 2 партии по 500 мг каждая пропусканием через стеклянную колонку (2,5х110 см) ®Sephadex LH-20. Подвижной фазой была вода, а скорость потока поддерживали при 0,5 мл/мин. Фракции собирали объемом по 6 мл. Фракции объединяли на основании ВЭЖХ (условия указаны выше). Активные фракции с целевым соединением объединяли, концентрировали при пониженном давлении 10-100 мм ртутного столба при 35^oС и лиофилизировали с получением 160 мг частично очищенного соединения, имеющего IC₅₀, равную 0,06 мкг/мл.

Полуочищенный материал очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на колонке ®Eurosphere 100 С18, 10 микрон (250х16 мм), используя градиент от 5% метанола в воде до 40% метанола в воде в течение 30 минут. Скорость потока поддерживали 6 мл/мин и детектирование осуществляли при 270 нм с получением чистого мумбайстатина (70 мг).

Мумбайстатин давал плохое качество спектров ¹H ЯМР и ¹³С ЯМР. Характеристика родительского соединения мумбайстатина была основана, главным образом, на спектральном анализе лактона L970860, который был получен путем обработки мумбайстатина трифторуксусной кислотой, используя способ, описанный в примере 6.

Пример 6. Получение лактона L970860
К 70 мг мумбайстатина, растворенного в метаноле (5 мл), добавляли 0,1% TFA (50 мл) и реакционную смесь нагревали в течение 1 часа при 50^oС. Затем смесь упаривали досуха при пониженном давлении 10-100 мм рт.ст. при 35^oС. Полученный таким образом реакционный продукт очищали с помощью препаративной ВЭЖХ на колонке ®Eurosphere 100, С18, 10 микрон (250x16 мм), используя градиент от 30% СН₃СN в 0,1% TFA до 80% CH₃CN в 0,1% TFA за 20 минут при скорости потока 6 мл/мин и детектировании при 270 нм с получением чистого L970860 (55 мг).

Физико-химические и спектральные свойства мумбайстатина и лактона L970860 суммированы в таблице. Спектроскопические данные соединений представлены на фиг. 2 (a, в, c), 3 и от 5 (a, в, c) до 10. На фиг. 1 и 4 представлены хроматограммы ВЭЖХ. Содержание индивидуальных изображений указано в таблице.

Фармакологическая характеристика мумбайстатина и лактона L 970860.

Мумбайстатин в значительной степени ингибирует активность глюкозо-6-фосфат транслоказы микросом печени крыс с IC₅₀, приблизительно равной 25 нмоль. В сравнении с этим, мумбайстатин ингибирует активность фосфатазы в разрушенных с помощью детергента микросомах с IC₅₀, составляющей больше 100 мкмоль, что указывает на высокую степень специфичности по отношению к транслоказе. Кроме того, мумбайстатин не воздействует на активность фосфат/пирофосфат транслоказы. Мумбайстатин является обратимым и конкурентным ингибитором глюкозо-6-фосфат транслоказы.

Кроме того, оценивали действие мумбайстатина в выделенных гепатоцитах крысы на продукцию глюкозы. Он ингибирует как опосредованный фруктозой глюконеогенез, так и опосредованный глюкагоном гликогенолиз с величинами IC₅₀ приблизительно 0,3 и 0,6 мкмоль, соответственно.

L070860 ингибирует активность глюкозо-6-фосфат транслоказы микросом печени крысы с IC₅₀, приблизительно равной 1,8 мкмоль.

Формула изобретения

1. Мумбайстатин, его фармацевтически приемлемые соли или простые и сложные эфиры, причем мумбайстатин относится к классу хинонов, имеет молекулярную формулу С₂₈Н₂₀О₁₂ и характеризуется ¹Н ЯМР и ¹³С ЯМР спектрами, представленными на фиг. 9 и фиг. 10 соответственно.

2. Мумбайстатин, его фармацевтически приемлемые соли или простые и сложные эфиры, полученный путем культивирования штамма Streptomyces Litmocidini HIL-008003, DSM 11641 в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, выделения и очистки известным способом.

3. Лактон L 970860, сложный эфир мумбайстатина по п.1, причем лактон L970860 имеет молекулярную формулу С₂₈Н₁₈О₁₁ и характеризуется ¹Н ЯМР и ¹³С ЯМР спектрами, представленными на фиг. 7 и фиг. 8 соответственно.

4. Способ получения мумбайстатина или лактона L970860 или его фармацевтически приемлемой соли, простого или сложного эфира, включающий культивирование штамма Streptomyces Litmocidini HIL-008003, DSM 11641 в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, с последующим выделением и очисткой целевого продукта известным способом и, необязательно, превращением в лактон L970860, или фармацевтически приемлемую соль или простой или сложный эфир мумбайстатина или лактона.

5. Штамм Streptomyces Litmocidini HIL-008003, DSM 11641 - продуцент мумбайстатина.

6. Фармацевтический препарат для лечения и профилактики сахарного диабета, включающий соединение по любому из пп.1-3.

7. Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики сахарного диабета, содержащая эффективное количество соединения по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель.

8. Мумбайстатин и его производное, охарактеризованный по любому из пп.1-2, - ингибитор глюкозо-6-фосфатазы.

9. Лактон, сложный эфир мумбайстатина, охарактеризованный по п.3, ингибитор глюкозо-6-фосфатазы.

10. Способ лечения и профилактики сахарного диабета, включающий введение эффективного количества соединения по любому из пп.1-3.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 16.06.2007

Извещение опубликовано: 20.07.2010        БИ: 20/2010

---