Днк(варианты), способ получения апомиктичных семян, способ получения сортов растений и способ получения эмбриогенных клеток в растительном материале

 

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано при селекции растений. Растительный материал трансформируют ДНК, кодирующей протеин, который может представлять собой рецептороподобную киназу. Наличие в протеине богатого лейцином повтора, модифицированного таким образом, чтобы лигандсвязывающий домен был устранен или был функционально неактивным, придает клеткам растения способность к эмбриогенезу. 5 с. и 32 з.п. ф-лы, 6 ил.

Текст описания в факсимильном виде (см. графический материал)е

Формула изобретения

1. ДНК, содержащая последовательность, которая кодирует протеин, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:33, или протеин с аминокислотной последовательностью, подобной аминокислотной последовательности указанного протеина по крайней мере на 90%, присутствие которого в активной форме в клетке или в ее мембране придает клетке способность к эмбриогенезу.

2. ДНК по п.1, кодирующая протеин, который представляет собой рецепторподобную киназу, содержащую богатый лейцином повтор, и содержит лигандсвязывающий домен, пролиновый блок, трансмембранный домен, киназный домен и протеинсвязывающий домен, причем лигандсвязывающий домен в случае необходимости может отсутствовать или быть функционально неактивным.

3. ДНК по п.1 или 2, содержащая последовательность ДНК, кодирующую N-концевой фрагмент протеина, имеющий следующую аминокислотную последовательность: Gln Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn.

4. ДНК по п.3, содержащая последовательность ДНК, кодирующую N-концевой фрагмент протеина, имеющий следующую аминокислотную последовательность: Val Xaa Gin Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn, где Xaa представляет собой вариабельную аминокислоту, но предпочтительно Leu или Val.

5. ДНК по п.4, содержащая последовательность ДНК, кодирующую N-концевой фрагмент протеина, который имеет следующую аминокислотную последовательность: Val Xaa Gin Ser Trp Asp Pro Thr Leu Val Asn Pro Cys Thr Trp Phe His Val Thr Cys Asn Xab Xac Xad Xae Val Xaf Arg Val Asp Leu Gly Asn Xag Xah Leu Ser Gly His Leu Xai Pro Glu Leu Gly Xaj Leu Xak Xal Leu Gln, где Xaa-Xak представляют собой вариабельные аминокислоты, но предпочтительно Xaa означает Leu или Val, Xab означает Asn или Gln, Xac означает Glu или Asp или His, Xad означает Asn или His, Xae означает Ser или Arg или Gln, Xaf означает Ilе или Thr, Xag означает А1а или Ser, Xah означает Glu или Asn, Xai означает Val или А1а, Xaj означает Val или Lys, Xak означает Lys или Glu, Xal означает Asn или His.

6. ДНК по п.1, содержащая последовательность, кодирующую протеин, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, или протеин, имеющий последовательность, гомологичную указанной по крайней мере на 90%, который способен связываться с мембраной и обладает киназной активностью.

7. ДНК по п.1, содержащая последовательность, кодирующую протеин, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:21, или протеин, имеющий последовательность, гомологичную указанной по крайней мере на 90%, который способен связываться с мембраной и обладает киназной активностью.

8. ДНК по п.1, содержащая последовательность, кодирующую протеин, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:33, или протеин, имеющий последовательность, гомологичную указанной по крайней мере на 90%, который способен связываться с мембраной и обладает киназной активностью.

9. ДНК по п.1, содержащая последовательность, кодирующую протеин, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:23, 25, 27, 29 и 31, или протеин, имеющий последовательность, гомологичную указанной по крайней мере на 90%, который способен связываться с мембраной и обладает киназной активностью.

10. ДНК по любому из предыдущих пунктов, содержащая ДНК, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:1 или 2, или комплементарную последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с указанными последовательностями и кодирует связанный с мембраной протеин, обладающий киназной активностью.

11. ДНК по любому из предыдущих пунктов, содержащая ДНК, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:20, или комплементарную последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с указанными последовательностями и кодирует связанный с мембраной протеин, обладающий киназной активностью.

12. ДНК по любому из предыдущих пунктов, содержащая ДНК, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:32, или комплементарную последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с указанными последовательностями и кодирует связанный с мембраной протеин, обладающий киназной активностью.

13. ДНК по любому из предыдущих пунктов, содержащая ДНК, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO:22, 24, 26, 28 и 30, или комплементарную последовательность, которая гибридизуется строгих условиях с указанными последовательностями и кодирует связанный с мембраной протеин, обладающий киназной активностью.

14. ДНК по любому из предыдущих пунктов, которая дополнительно кодирует последовательность, направляющую перенос в клеточную мембрану.

15. ДНК по любому из предыдущих пунктов, где экспрессия, в которой область, кодирующая протеин, находится под контролем регулируемого стадией развития или индуцибельного промотора.

16. ДНК по п.15, где промотор представляет собой один из следующих промоторов: промотор, регулирующий экспрессию генов SERK в растениях, промотор гена DcEP3-1 хитиназы моркови, промотор гена AtChitIV Arabidopsis, промотор гена LTP-1 Arabidopsis, промотор гена bel-1 Arabidopsis, промотор гена fbp-7 петуньи, промотор гена ANT Arabidopsis, промотор гена 0126 Phalaenopsis; промотор AtDMCl Arabidopsis, индуцибельный промотор рТА7001.

17. ДНК по любому из предыдущих пунктов, представляющая собой рекомбинантную ДНК.

18. ДНК по любому из предыдущих пунктов, последовательность которой модифицирована удалением из нее известных мотивов нестабильности мРНК или сигналов полиаденилирования, и/или использованием кодонов, предпочтительных для растения, в которое ДНК должна быть встроена с получением при экспрессии модифицированной указанным образом ДНК протеина, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 90% гомологична последовательности протеина, который получают при экспрессии немодифицированной ДНК в организме, для которого этот протеин является эндогенным.

19. ДНК, которая комплементарна ДНК, которая гибридизуется в строгих условиях с ДНК по любому из пп.1-14.

20. Способ получения апомиктичных семян, включающий следующие стадии: (I) трансформацию растительного материала с помощью нуклеотидной последовательностей по любому из пп.1-19; (II) регенерацию такого трансформированного материала в растения или в их части, содержащие плодолистик, и (III) экспрессию последовательности в области зародышевого мешка.

21. Способ по п.20, где апомиктичные семена отличаются типом адвентициальной эмбрионии.

22. Способ по любому из пп.20 и 21, где экспрессия последовательности позволяет получить протеин с активностью киназы, обладающий способностью связываться с мембраной растительной клетки.

23. Способ по п.22, где киназа обладает способностью к автофосфорилированию.

24. Способ по любому из пп.20-23, где протеин представляет собой рецепторподобную киназу, содержащую богатый лейцином повтор, и содержит лигандсвязывающий домен, пролиновый блок, трансмембранный домен, киназный домен и протеинсвязывающий домен.

25. Способ по п.24, где у протеина отсутствует функционально активный лигандсвязывающий домен, но он содержит пролиновый блок, трансмембранный домен, киназный домен и протеинсвязывающий домен.

26. Способ по любому из предыдущих пунктов, где протеинсвязывающий домен в случае, когда он включен в клеточную мембрану, локализован внутриклеточно.

27. Способ по любому из пп.20-26, где последовательность дополнительно кодирует последовательность, направляющую перенос в клеточную мембрану.

28. Способ по любому из пп.20-27, где последовательность представляет собой таковую, приведенную в SEQ ID NO:1 или 2, или комплементарную последовательности, которая гибридизуется в строгих условиях с указанными последовательностями и кодирует связанный с мембраной протеин, обладающий киназной активностью.

29. Способ по любому из пп.20-28, где последовательность модифицируют таким образом, что из нее удаляют известные мотивы нестабильности мРНК, или сигналы полиаденилирования, и/или кодоны, которые предпочтительны для растения, в которое последовательность должна быть встроена, применяют таким образом, чтобы экспрессия модифицированной таким путем последовательности в этом растении приводила к получению протеина, имеющего последовательность, гомологичную по крайней мере на 90% получаемой при экспрессии немодифицированной последовательности в организме, для которого этот протеин является эндогенным.

30. Способ по любому из пп.20-29, где экспрессия последовательности находится под контролем индуцибельного или регулируемого стадией развития промотора.

31. Способ по п.30, где экспрессия последовательности находится под контролем одного из следующих промоторов: промотора, регулирующего экспрессию генов SERK в растениях, промотора гена DcEP3-1 хитиназы моркови, промотора гена AtChitIV Arabidopsis, промотора гена LTP-1 Arabidopsis, промотора гена bel-1 Arabidopsis, промотора гена fbp-7 петуньи, промотора гена ANT Arabidopsis, промотора гена 0126 Phalaenopsis.

32. Способ по любому из пп.20-31, где последовательность экспрессируют в соматических клетках зародышевого мешка, в стенке завязи, нуцеллусе или интегументах.

33. Способ по любому из пп.20-32, где эндосперм внутри апомиктичного семени получают в результате слияния полярных ядер внутри зародышевого мешка с происходящим из пыльцы ядром мужской гаметы.

34. Способ по п.33, где последовательность, кодирующую протеин, экспрессируют до слияния полярных ядер с ядром мужской гаметы.

35. Способ получения сортов растений, включающий опыление растений пыльцой растений, трансформированных ДНК по любому из пп.1-19.

36. Способ получения эмбриогенных клеток в растительном материале, включающий трансформацию материала последовательностью рекомбинантной ДНК по любому из пп.1-19, ДНК, содержащей рекомбинантную ДНК по любому из пп.1-19, или вектором по п.35, содержащим ДНК по любому из пп.1-19, экспрессию последовательности в материале или в его производных и обработку материала или производных соединением, которое действует в качестве лиганда для продукта экспрессии гена этой последовательности.

37. Способ по п.36, где последовательность кодирует рецепторподобную киназу, содержащую богатый лейцином повтор, а соединение представляет собой фитогормон.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93