Модифицированный полипептид с увеличенным временем полужизни, его получение и использование

 

Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в медицинской практике и касается полипептида, который выводится через почки и не содержит в своей исходной форме Fc-области IgG. Исходный полипептид модифицируют так, чтобы включить спасательный рецепторсвязывающий эпитоп Fc-области IgG и посредством этого увеличить циркуляторное время полужизни. Модифицированный полипептид содержит аминокислотную последовательность Ig-домена или Ig-подобного, который не является СН₂-доменом, и аминокислотную последовательность спасательного рецепторсвязывающего эпитопа Fc-области IgG, расположенную в пределах Ig-домена или Ig-подобного домена. Аминокислотная последовательность модифицированного полипептида, по меньшей мере, на 70% идентична таковой исходного полипептида. Раскрыт способ получения указанного полипептида с использованием ДНК (в конструкции вектора), кодирующей указанный полипептид. Полученный полипептид может использоваться для лечения опосредованного LFA-1 нарушения у млекопитающих, в том числе человека. Изобретение позволяет увеличить время полужизни полипептида, за счет чего повышается эффективность лечения. 8 с. и 17 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.

Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть)н

Формула изобретения

1. Модифицированный полипептид, обладающий увеличенной продолжительностью времени полужизни in vivo и характеризующийся тем, что он получен на основе представляющего интерес полипептида, который не содержит Fc-область IgG и выводится через почки, причем аминокислотная последовательность представляющего интерес полипептида модифицирована таким образом, что она содержит а) аминокислотную последовательность Ig-домена или Ig-подобного домена, который не является СН₂-доменом, и б) аминокислотную последовательность спасательного рецепторсвязывающего эпитопа Fc-области IgG, которая расположена в пределах Ig-домена или Ig-подобного домена, где аминокислотная последовательность модифицированного полипептида, по меньшей мере, на 70% идентична аминокислотной последовательности представляющего интерес полипептида и его биологическая активность сохраняется.

2. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что Ig-домен или Ig-подобный домен содержит домен CH₁.

3. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп происходит из одной или двух петель Fc-области и расположен в Ig-домене или Ig-подобном домене.

4. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп происходит из СН₂-домена Fc-области, модифицированный полипептид дополнительно включает CH₁-, СН₃- или V_H-область и указанный эпитоп расположен в CH₁-, СН₃- или V_н-области или в нескольких таких областях Ig-домена или Ig-подобного домена.

5. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп происходит из СН₂-домена Fc-области и расположен в Ig-домене или Ig-подобном домене.

6. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является Fab, (Fab’)₂, диантителом, Fv-фрагментом, одноцепочечным Fv-фрагментом или рецептором.

7. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является антагонистом LFA-1.

8. Модифицированный полипептид по п.7, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является Fab или (Fab’)₂ антитела против LFA-1.

9. Модифицированный полипептид по п.8, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является анти-CD18 Fab или анти-CD18(Fab’)₂.

10. Модифицированный полипептид по п.9, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является человеческим или гуманизированным.

11. Модифицированный полипептид по любому одному из пп.1-10, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп содержит последовательность PKNSSMISNTR (SEQ ID NO:3).

12. Модифицированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп дополнительно содержит последовательность HQSLGTQ (SEQ ID NO:11).

13. Модифицированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп дополнительно содержит последовательность HQNLSDGK (SEQ ID NO:1).

14. Модифицированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп дополнительно содержит последовательность HQNISDGK (SEQ ID NO:2).

15. Модифицированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп дополнительно содержит последовательность VISSHLGQ (SEQ ID NO:31).

16. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп содержит последовательности HQNLSDGK (SEQ ID NO:1), HQNISDGK (SEQ ID NO:2), HQSLGTQ (SEQ ID NO:11) или VISSHLGQ (SEQ ID NO:31) и последовательность PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:3).

17. Модифицированный полипептид по п.16, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп слит с представляющим интерес полипептидом.

18. Молекула ДНК, кодирующая модифицированный полипептид по любому из пп.1-16.

19. Реплицируемый вектор, содержащий молекулу ДНК по п.18.

20. Способ получения модифицированного полипептида по любому из пп.1-17, включающий культивирование клеток, содержащих кодирующую указанный модифицированный полипептид нуклеиновую кислоту, в культуральной среде и извлечение указанного модифицированного полипептида из культуральной среды, клеток или как из культуральной среды, так и из клеток.

21. Способ получения модифицированного полипептида по любому из пп.1-15, включающий изменение представляющего интерес полипептида таким образом, что он содержит спасательный рецепторсвязывающий эпитоп Fc-области IgG и имеет увеличенное время полужизни in vivo.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что стадию изменения проводят с помощью сайт-направленного, кассетного или PCR-мутагенеза.

23. Способ получения модифицированного полипептида по п.1, включающий (а) идентификацию последовательности и конформации спасательного рецепторсвязывающего эпитопа Fc-области молекулы IgG, где указанный эпитоп происходит из СН₂-домена Fc-области; б) изменение последовательности указанного представляющего интерес полипептида, который выводится через почки и не содержит Fc-область IgG, с целью включения последовательности и конформации идентифицированного связывающего эпитопа; (в) проверку измененного полипептида со стадии (б) на предмет более длительного времени полужизни in vivo, чем у представляющего интерес полипептида; (г) если измененный полипептид не обладает более длительным временем полужизни in vivo, дальнейшее изменение последовательности представляющего интерес полипептида с целью дальнейшего включения последовательности и конформации идентифицированного связывающего эпитопа и проверку на предмет увеличения времени полужизни in vivo до тех пор, пока не получат более длительное время полужизни in vivo.

24. Способ лечения опосредованного LFA-1 нарушения, характеризующийся тем, что млекопитающему, нуждающемуся в лечении, вводят эффективное количество модифицированного полипептида по любому из пп.1-15.

25. Способ лечения опосредованного LFA-1 нарушения, характеризующийся тем, что пациенту, нуждающемуся в лечении, вводят эффективное количество модифицированного полипептида по любому из пп.1-15.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38, Рисунок 39, Рисунок 40, Рисунок 41, Рисунок 42, Рисунок 43, Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46, Рисунок 47, Рисунок 48, Рисунок 49, Рисунок 50, Рисунок 51, Рисунок 52, Рисунок 53, Рисунок 54, Рисунок 55, Рисунок 56, Рисунок 57, Рисунок 58, Рисунок 59, Рисунок 60, Рисунок 61, Рисунок 62, Рисунок 63, Рисунок 64, Рисунок 65, Рисунок 66, Рисунок 67, Рисунок 68, Рисунок 69, Рисунок 70, Рисунок 71, Рисунок 72, Рисунок 73, Рисунок 74, Рисунок 75, Рисунок 76, Рисунок 77, Рисунок 78, Рисунок 79, Рисунок 80, Рисунок 81, Рисунок 82, Рисунок 83, Рисунок 84, Рисунок 85, Рисунок 86, Рисунок 87, Рисунок 88, Рисунок 89, Рисунок 90, Рисунок 91, Рисунок 92, Рисунок 93, Рисунок 94, Рисунок 95, Рисунок 96, Рисунок 97, Рисунок 98, Рисунок 99, Рисунок 100, Рисунок 101, Рисунок 102, Рисунок 103, Рисунок 104, Рисунок 105, Рисунок 106, Рисунок 107, Рисунок 108, Рисунок 109, Рисунок 110, Рисунок 111, Рисунок 112, Рисунок 113, Рисунок 114, Рисунок 115, Рисунок 116, Рисунок 117, Рисунок 118, Рисунок 119, Рисунок 120, Рисунок 121, Рисунок 122, Рисунок 123, Рисунок 124, Рисунок 125, Рисунок 126, Рисунок 127, Рисунок 128, Рисунок 129, Рисунок 130, Рисунок 131, Рисунок 132, Рисунок 133, Рисунок 134, Рисунок 135, Рисунок 136, Рисунок 137, Рисунок 138, Рисунок 139, Рисунок 140, Рисунок 141, Рисунок 142, Рисунок 143, Рисунок 144, Рисунок 145, Рисунок 146, Рисунок 147, Рисунок 148, Рисунок 149, Рисунок 150