Способ получения суспензионного диагностикума (варианты)

 

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены способы получения суспензионного диагностикума путем сенсибилизации кремнеземной матрицы иммуноглобулинами, в качестве носителя используют суспензию окрашенных частиц аэросила, во втором случае - частицы алюмосиликата. Данные способы позволяют упростить и сократить время приготовления диагностикума и время исследования. 2 с.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве суспензионных диагностикумов для выявления антигенов при экспресс-диагностике инфекционных заболеваний.

В последние годы усилилась тенденция использования инертных материалов в качестве носителей лигандов, что привело к возможности разработки и применения реакции суспензионной агглютинации (РСА) для выявления возбудителей различных заболеваний.

Известен способ получения диагностикума эритроцитарного [1], включающий сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов лигандом в присутствии коньюгирующего агента с последующим их отмыванием. Сенсибилизацию проводят при температуре 54-57°С, а в качестве конъюгирующего агента используют смесь растворов меди сернокислой, хромовокислого калия и хлористого хрома.

Способность эритроцитарных препаратов ограничена, прежде всего особенностью самого биологического носителя и характером взаимодействия между сенситином и матрицей. Большое значение имеет качество самих эритроцитов, зависящее от многих условий, таких как пол, возраст, гормональный статус животного-продуцента, время взятия крови. В связи с этим, воспроизводимость результатов может варьировать. Недостатком является также длительность получения диагностикумов эритроцитарных и то, что окончательный учет результатов реакции проводят через 16-18 часов.

Перспективным является создание диагностикума на синтетической основе.

Известен способ получения диагностикума для серологических реакций на синтетических частицах за счет использования в качестве носителя суспензии окрашенных полиакролеиновых частиц, обработанных раствором казеина, активированных сшивающим агентом и сенсибилизированных иммуноглобулинами при рН 7,2-7,6 [2]. Используют диагностикум для определения антигенов в реакции суспензионной агломерации (РСА) в лунках U-образных микропланшет. Приготовление диагностикума занимает 7-8 ч, учет результатов производится через 1,5-2 ч.

Целью изобретения является упрощение, сокращение времени приготовления диагностикума, уменьшение времени, необходимого для получения конечного результата реакции при высокой чувствительности диагностикума.

Поставленная цель достигается способом получения диагностикума для серологической индикации возбудителей особо опасных инфекций путем связывания иммуноглобулинового сенситина с матрицей на основе соединений кремния в буферном растворе при рН (7,2+0,2), в котором в качестве матрицы предлагается использовать аэросил (пирогенная форма двуокиси кремния) или алюмосиликат с добавлением красителя (аурамина или фуксин), взятых в весовом соотношении 2:1, в качестве активатора поверхности - 1% вторичного алкилсульфата натрия. Сенситин - иммуноглобулины класса G из иммунной сыворотки. Сенсибилизацию ведут при температуре (37+1)°С в течение 2 часов.

Выбор в качестве матрицы аэросила и алюмосиликата обусловлен тем, что для них характерна высокая реакционная способность поверхностных групп при взаимодействии со многими органическими и неорганическими соединениями. Введение в матрицу красителя обуславливает цветовой эффект, в результате чего повышается наглядность серологического теста.

Активирование матрицы вторичным алкилсульфатом натрия приводит к предотвращению сближения частиц, их агрегирования, а на поверхности образуется мономолекулярный адсорбционный слой.

Выбранные соотношения между компонентами обеспечивают получение сорбентов заданного состава и строения и эффективное выявление возбудителей особо опасных инфекций.

При увеличении кислотности буферного раствора во время сенсибилизации снижается процент связывания сенситнна.

В течение 2 часов происходит максимальное связывание иммуноглобулинов. Суспензия комплекса матрица-антитело не должна давать агглютинацию при взаимодействии с гетерологичными антигенами. Для блокировки свободных активных центров матрицы используют бычий сывороточный альбумин (БСА) до 1%.

По сравнению с прототипом [2] по предлагаемому способу сокращается время приготовления диагностикума в 2 раза и учет результатов - 1-5 мин, по предлагаемому способу нет необходимости в планшетах, а реакция также наглядна.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. 100 мг аэросила, 50 мг аурамина растирают в фарфоровой ступке, просеивают. Из этого порошка готовят 2% суспензию в 0,1 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ), рН (7,2+0,2). Далее проводят активирование матрицы, добавляя 0,075 мл вторичного алкилсульфата натрия, инкубируя в течение 30 мин при температуре (37+1)°С. Для сенсибилизации используют иммуноглобулины туляремийные в концентрации 0,5 мг/мл, в объеме 3 мл, инкубируют в течение 2 ч при температуре (37+1)°С, отмывают от несвязавшихся антител и красителя 0,1 М ФСБ, центрифугируя трижды при 5000 об/мин в течение 10 мин, последний осадок растворяют в растворе БСА до 1% взвеси диагностикума и добавляют 1% формалина.

Методика постановки реакции.

На обезжиренное стекло нанести по 2 капли взвеси туляремийного микроба в концентрации от 2×10⁷ до 1×10 ⁴ м.к./мл. На стекло с отрицательным контролем нанести 2 капли 0,1 М ФСБ. На стекла с опытом и отрицательным контролем добавить по 1 капле диагностикума суспензионного туляремийного иммуноглобулинового. Капли тщательно перемешивают и при легком покачивании стекла наблюдают в течение 1-5 мин в косопроходящем свете за изменением структуры суспензии. Благодаря интенсивной окраске суспензии (желтый цвет) значительно повышается демонстративность реакции и облегчается ее визуальный учет.

В отрицательном контроле агглютинация отсутствует, в то время как на стеклах со взвесями туляремийного микроба наблюдается полное просветление жидкости с крупнозернистыми хлопьями, т.е. четкая агглютинация. Чувствительность диагностикума составила 2,5×10⁶ м.к./мл.

Пример 2. Процесс ведут аналогично примеру №1, только в качестве матрицы используют алюмосиликат вместо аэросила. Результаты получены аналогичные.

Пример 3. Процесс ведут аналогично примеру №1, только в качестве сенситина используют иммуноглобулины холерные. Чувствительность диагиостикума составила 2×10⁷ м.к./мл.

Пример 4. Процесс ведут аналогично примеру №2, только в качестве сенситина используют иммуноглобулины холерные. Чувствительность диагностикума составила 2×10⁷ м.к./мл.

Пример 5. Процесс ведут аналогично примеру №1, только в качестве красителя используют фуксин вместо аурамина. Чувствительность диагностикума составила 2,5×10⁶ м.к./мл.

Пример 6. Процесс ведут аналогично примеру №2, только в качестве красителя используют фуксин вместо аурамина. Чувствительность диагностикума составила 2,5×10⁶ м.к./мл.

Испытано по 3 серии диагностикумов: туляремийного и холерного в 5 повторностях. Диагностикумы проверены В РСА на стекле с гомо- и гетерологичными взвесями. Для сравнения использован эритроцитарный туляремийный диагностикум в РНГА, приготовленный из тех же серий сывороток.

В результате испытаний препараты зарекомендовали себя как высокоактивные, специфичные, позволяющие провести экспресс-диагностику в течение 1-5 мин, по чувствительности не уступающие эритроцитарным диагностикумам, а по экспрессности значительно превосходящие последние, так как учет конечного результата РНГА через 16-18 ч.

Данный способ экономически выгоден, поскольку значительно сокращает как процесс получения препарата, так и время исследования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Г.Н.Хорват, А.А.Арзанов. Способ получения эритроцитарного диагностикума. Патент РФ N 1774872, А 61 К 47/00, опубликованный 07.11.92, бюллетень N 41.

2. Е.П.Ерохин, С.В.Прозоровский, И.С.Тартаковский, О.В.Радченко, Ю.В.Лукин, В.П.Зубов, Н.Д.Темежникова, Г.В.Гальцева, В.М.Костюковский, И.А.Базиков, А.А Зайцев, Д.Н.Авдеев и Н.К.Мисуренко. Способ получения антительного диагностикума. Авторское свидетельство №1596926 G 01 N 33/544, С 12 N 1/00, опубликованное 24.02.89.

Формула изобретения

1. Способ получения суспензионного диагностикума путем сенсибилизации кремнеземной матрицы иммуноглобулинами с последующей отмывкой целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве матрицы используют суспензию окрашенных частиц аэросила, активированных вторичным алкилсульфатом натрия, при этом соотношение матрицы к красителю по весу составляет 2:1, сенсибилизацию проводят при температуре 37+1°С, в течение 2 ч, при рН 7,2+0,2 и в соотношении 0,5 мг иммуноглобулинов на 50 мг матрицы.

2. Способ получения суспензионного диагностикума путем сенсибилизации кремнеземной матрицы иммуноглобулинами с последующей отмывкой целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве матрицы используют суспензию окрашенных частиц алюмосиликата, активированных вторичным алкилсульфатом натрия, при этом соотношение матрицы к красителю по весу составляет 2:1, сенсибилизацию проводят при температуре 37+1°С, в течение 2 ч, при рН 7,2+0,2 и в соотношении 0,5 мг иммуноглобулинов на 50 мг матрицы.