Способ получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов

 

Описан способ получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов, включающий взаимодействие в среде органического растворителя аминосодержащего нерастворимого носителя с пептидным лигандом и конденсирующим агентом, отличающийся тем, что в качестве пептидного лиганда используют антибиотик - полипептид-полимиксин М или модифицированный полипептид, имитирующий структурные мотивы цепей молекулы коллагена, имеющий последовательность Z-Gly-DL-Pro-Gly-, Pro-Gly-Gly- или (Pro-OH)-Gly-Gly-, процесс ведут при рН 5,5-8,0, причем на 1 г носителя берут 9-80 мг пептидного лиганда и 10-500 мг конденсирующего агента. Технический результат: возможность использования для выделения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, используемых в медицине, биохимии, пищевой промышленности, в ферментативном синтезе пептидов, а также для исследовательских целей. 6 з.п. ф-лы, 2 табл., 3 ил.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения афинного сорбента для очистки коллагеназ, и может быть использовано для выделения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые используются в медицине, биохимии, пищевой промышленности, в ферментативном синтезе пептидов, а также для исследовательских целей.

Наиболее перспективным для избирательной очистки ферментов является метод афинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфичным аналогам субстрата или ингибиторам - лигандам, ковалентно связанным с нерастворимыми носителями, что позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности и достигать высокой степени очистки.

Известен сорбент для очистки протеолитического фермента биоспецифической хроматографией на основе полиакриламидного или агарозного геля, содержащий в качестве лиганда гемоглобин, иммобилизованный на биогеле. Биогель активируется глутаровым альдегидом (авт. свид. СССР №962302, C 12 N 9/50, 1982 г.).

Однако производные агарозы неустойчивы в кислой среде и могут разрушаться в процессе хроматографии. Кроме того, указанный сорбент не специфичен к коллагеназам.

Известен способ получения афинного сорбента для очистки протеиназ, включающий взаимодействие аминосодержащего нерастворимого носителя с антибиотиками - полипептидами и конденсирующим агентом с использованием в качестве носителя природных биополимеров, например хитина или хитозана, а в качестве конденсирующего агента - водный раствор глутарового альдегида, в качестве антибиотика - полипептида используют бацитрацин или грамицидин С. Обычно используют 10-25% водный раствор глутарового альдегида, а на 1 г природного биополимера берут 0,15-0,5 г антибиотика и 0,15-0,5 г глутарового альдегида. Синтез сорбента ведут при 15-37°С.

Сорбент получают следующим образом. Хитозан перемешивают с раствором глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере при рН 6,9 в течение 4 час, после чего смесь помещают в термостат при 37°С на 12 часов. После фильтрования сорбент промывают тем же буфером и помещают в раствор антибиотика - полипептида в том же буфере, выдерживают 12 час при 37°С, промывают буфером и водой. Определение включения антибиотика проводят по содержанию аминокислот. Выход сорбента - 21-94% (патент РФ 2065877, C 12 N 9/50, 1996 г.).

Недостатком данного способа является отсутствие специфичности лигандов бацитрацина и грамицидина к коллагеназам, практически важным протеолитическим ферментам, способным гидролизовать коллаген и неустойчивый выход сорбента.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения афинного сорбента для очистки протеолитических ферментов, включающий взаимодействие нерастворимого инертного носителя с раствором конденсирующего агента и лиганда. В качестве носителя используют аминопроизводные макропористого микросферического кремнезема типа Поросил, Диасорб или Силохром (обычно аминосилохром), имеющие внутри зерен крупные поры более или менее однородного размера.

В качестве конденсирующего агента используют п-бензохинон, карбодиимид или гексаметилендиизоционат, а в качестве лиганда - п-(-аминометил)-фенилборную кислоту или антибиотик - полипептид: бацитрацин, бациллихин, грамицидин С.

Сорбент получают следующим образом. Аминосилохром обрабатывают смесью конденсирующего агента и лиганда, например смесью бензохинона и антибиотика - полипептида в 0,1 М NаНСО3, (рН 10,0) в диметилформамиде. Смесь осторожно перемешивают 4 часа и оставляют на 12 час при 5°С. Затем сорбент тщательно промывают 0,1 М NaHCO3, рН 10,0, водой, спиртом, а перед очисткой ферментов элюирующим раствором (авт. свид. СССР №942427, C 12 N 9/50, 1984 г.).

Указанный сорбент позволяет с выходом 75-100% очищать протеолитические ферменты с увеличением активности в 1,4-100 раз в зависимости от чистоты исходного препарата, однако не обладают специфичностью к коллагеназам. К недостаткам указанного способа получения сорбента следует также отнести необходимость проведения элюции при последующем применении сорбентов для очистки ферментов в жестких условиях, что приводит к инактивации некоторых ферментов.

Задачей изобретения является создание способа получения новых сорбентов, специфичных к коллагенолитическим ферментам.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов, включающем взаимодействие в среде органического растворителя аминосодержащего нерастворимого носителя с пептидным лигандом и конденсирующим агентом - п-бензохиноном или карбодиимидом, в качестве пептидного лиганда используют антибиотик - полипептид-полимиксин М или модифицированный полипептид, имитирующий структурные мотивы цепей молекулы коллагена, процесс ведут при рН 5,5-8,0, причем на 1 г носителя берут 9-80 мг пептидного лиганда и 10-500 мг конденсирующего агента.

При использовании в качестве модифицированного пептида, имитирующего структурные мотивы цепей коллагена, используют Z-Gly-DL-Pro-Gly-, причем на 1 г носителя берут 9-40 мг пептида и 20-23 мг водорастворимого карбодиимида и процесс ведут при рН 5,5.

При использовании в качестве модифицированного пептида, имитирующего структурные мотивы цепей коллагена используют Рrо-Gly-Gly-, (Pro-OH)-Gly-Gly-, причем на 1 г носителя берут 40-80 мг пептида и до 500 мг водорастворимого карбодиимида и процесс ведут при рН 5,5.

Обычно взаимодействие осуществляют в течение 0,5-1,0 часа в вакууме с использованием роторного испарителя.

Желательно в качестве растворителя использовать диметилформамид, этанол, а в качестве аминосодержащего нерастворимого носителя - аминосилохром, аминодиасорб.

Для облегчения стерических условий взаимодействия сорбента с высокомолекулярными ферментами сорбент предварительно можно обработать диаминокапроновой кислотой.

Пример 1.

2 г аминосилохрома ( 90-110 аминогрупп на 1 г) перемешивают в вакууме на роторном испарителе в течение 30-40 мин с рабочим буфером, включающим 0,05 М Трис НСl, рН 8 и 20% диметилформамид.

Готовят раствор 50 г полимиксина в 3 мл того же буфера и 200 мг п-бензохинона в 2 мл диметилформамида. Полученные растворы смешивают, перемешивают на роторном испарителе 2-4 часа.

Темноокрашенный сорбент отфильтровывают, промывают рабочим буфером, спиртом, водой.

Содержание полимиксина 1-8,2 мкМ/г, выход 6-33%. Для определения включения антибиотика в сорбент навеску 20 г гидролизуют 5,7 н НСl 48 час при 105°С и измеряют количественное содержание аминокислот на аминокислотном анализаторе.

Выход реакции рассчитывают по отношению количества присоединившегося антибиотика к количеству антибиотика, вводимого в реакцию, принимая за 100% исходное содержание антибиотика в реакционной смеси.

Примеры №2-7 сведены в таблицу №1.

Из данных таблицы видно, что наибольший выход сорбента достигается при избытке конденсирующего агента - п-бензохинона.

При проведении афинной хроматографии на вышеназванных сорбентах оказалось, что лучшими из них являются сорбенты, полученные в примерах 4 и 5. Степень очистки коммерческого препарата коллагеназы камчатского краба составила 2-6 раз, неспецифичная сорбция мала. Потерь активности в процессе очистки не наблюдалось.

Схемы №1-3 иллюстрируют синтезированные афинные сорбенты с использованием синтетических пептидных лигандов, строение которых имитируют структурные мотивы цепей молекул коллагана: Z-Gly-DL-Pro-Gly-аминосилохром (схема 1), Pro-Gly-Gly-аминосилохром (схема 2), (Pro-OH)-Gly-Gly-аминосилохром (схема 3).

Для синтеза сорбентов могут быть использованы готовые пептиды или пептиды, синтезированные известными методами. Согласно приведенным схемам пептидный лиганд конденсировали непосредственно с аминогруппами аминосилохрома.

Известно, что для улучшения сорбции белков, которая обеспечивается гидрофобной вставкой, предпочтительно присоединять спейсер из 6-8 метиленовых групп, в качестве которой обычно используют остаток -аминокапроновой кислоты, обеспечивая таким образом более протяженную длину спейсерной области сорбента.

Это обстоятельство особенно важно для хроматографии ферментов, активный центр которых глубоко "утоплен" внутрь, или для облегчения стерических условий взаимодействия с высокомолекулярными фрагментами.

Пример 8.

Синтез Z-Glу-DL-Рrо-Clу-аминосилохрома.

К 10 г аминосилохрома, замоченного в 35 мл воды, добавляют раствор 91 мг (250 мкмоль) Z-Gly-DL-Pro-Gly в 5 мл этанола и 212 мг (500 мкмоль) карбодиимида (CMC) - [N-циклогексил, N-2-(N'-метилморфолино) этилкарбодиимид в 10 мл воды. Подкисляют реакционную смесь до рН 5,5 с помощью конц. НСl и медленно перемешивают в течение 20 ч. Помутневшую желтоватую жидкость над сорбентом удаляют декантацией, после чего модифицированный сорбент промывают от остатков исходных веществ этанолом, затем - большим количеством воды. Непрореагировавшие аминогруппы аминосилохрома блокируют ацетилированием. Для этого к сорбенту добавляют раствор 10 мл уксусного ангидрида в 50 мл воды и выдерживают смесь в течение 40 мин, после чего добавляют раствор 10 г ацетата натрия в 10 мл воды. Сорбент отмывают большим количеством воды и высушивают. Для определения включения пептидного лиганда навеску (100 мг) сухого сорбента гидролизуют 600 мкл 5,7М НСl в течение 24 ч при 105°С. Гидролизат анализируют на аминокислотном анализаторе. Масса сухого модифицированного сорбента - 12,6 г. Включение Z-Gly-DL-Pro-Gly - 5,3 мкмоль/г.

Пример 9.

Синтез Pro-Gly-Gly-аминосилохрома.

Смесь 1 г сухого аминосилохрома (100 мкмоль аминогрупп на г сорбента), замоченного в 3 мл воды, перемешивают в вакууме на роторном испарителе в течение 30-40 мин для удаления воздуха из пор сорбента, добавляют раствор 40 мг (0,3 ммоль) Gly-Gly в 2 мл воды. Избыток глицилглицина в молярном соотношении NH2 (аминосилохрома):СОО (глицилглицина)=1:3 используется для забивки всех возможных сайтов связывания (иначе сорбент будет работать как ионообменник).

Затем прибавляют 0,5 г (1,2 ммоль) водорастворимого карбодиимида CMC, предварительно растворенного в 5 мл воды. Смесь медленно перемешивают на роторном испарителе 2 ч при 20°С. Модифицированный сорбент отделяют от водной фазы декантацией и промывают водой, этанолом, затем большим количеством воды. Далее сорбент высушивают. Масса сухого модифицированного сорбента - 1,17 г.

К такому сухому модифицированному сорбенту, растворенному в 3 мл воды, прибавляют 69 мг (0,6 ммоль) L-пролина (шестикратный избыток) в 12 мл дистиллированной воды. Смесь медленно перемешивают на роторном испарителе 2 ч. при 20°С. Модифицированный сорбент отделяют от водной фазы декантацией и промывают водой, этанолом, затем большим количеством воды. Далее сорбент высушивают. Масса сухого модифицированного сорбента - 2,21 г.

Для определения включения пептидного лиганда в сорбент навеску 20 мг гидролизуют 5,7 н НСl 48 ч при 105°С и измеряют количественно содержание аминокислот в гидролизате на аминокислотном анализаторе Hitachi-835. Выход реакции рассчитывают по отношению количества присоединившихся аминокислот к количеству аминокислот, вводимых в реакцию, принимая за 100% исходное содержание аминокислот в реакционной смеси. Включение пептидных лигандов составило 26 мкмоль/г сухого сорбента соответственно, выход 4-10%.

Пример 10.

Синтез (Рrо-ОН)-Glу-Glу-аминосилохрома.

Синтез Gly-Gly-аминосилохрома производится по той же методике, как описано в примере 4. Масса сухого модифицированного сорбента - 1,15 г. К такому сухому модифицированному сорбенту, растворенному в 3 мл воды, прибавляют 78,6 мг (0,6 ммоль) L-оксипролина (шестикратный избыток) в 12 мл дистиллированной воды. Смесь медленно перемешивают на роторном испарителе 2 ч. при 20°С. Модифицированный сорбент отделяют от водной фазы декантацией и промывают водой, этанолом, затем большим количеством воды. Далее сорбент высушивают. Масса сухого модифицированного сорбента - 2,25 г.

Для определения включения пептидного лиганда в сорбент навеску 20 мг гидролизуют 5,7 н НСl 48 ч при 105°С и измеряют количественно содержание аминокислот в гидролизате на аминокислотном анализаторе Hitachi-835. Выход реакции рассчитывают по отношению количества присоединившихся аминокислот к количеству аминокислот, вводимых в реакцию, принимая за 100% исходное содержание аминокислот в реакционной смеси. Включение пептидных лигандов составило 30 мкмоль/г сухого сорбента соответственно, выход 5-15%.

Следует отметить, что степень включения пептидного лиганда в синтезированных нами аффинных сорбентах (5-10 мкмоль/г) попадает в рабочий диапазон для аффинных сорбентов и значения от 0,5 до 10 мкмоль/г являются оптимальными для сорбции и особенно для последующего процесса элюции.

В таблице 2 приведены данные сорбции коллагеназ на афинных сорбентах, в частности, полученных в примерах 8-10.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что согласно этому способу можно применять сорбенты для выделения коллагеназ из разных источников - из животных, растений, микроорганизмов.

Таким образом, благодаря особому строению лигандов предлагаемые аффинные сорбенты позволяют избирательно выделять из природных источников ферменты с коллагеназным действием. Ранее коллагеназы выделяли стандартными методами, включая ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, ультрафильтрацию. Специфические аффинные сорбенты для коллагеназ неизвестны.

Формула изобретения

1. Способ получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов, включающий взаимодействие в среде органического растворителя аминосодержащего нерастворимого носителя с пептидным лигандом и конденсирующим агентом, отличающийся тем, что в качестве пептидного лиганда используют антибиотик-полипептид - полимиксин М или модифицированный полипептид, имитирующий структурные мотивы цепей молекулы коллагена, имеющий последовательность Z-Gly-DL-Pro-Gly-, Pro-Gly-Gly- или (Pro-OH)-Gly-Gly-, процесс ведут при рН 5,5-8,0, причем на 1 г носителя берут 9-80 мг пептидного лиганда и 10-500 мг конденсирующего агента.

2. Способ получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов по п.1, отличающийся тем, что в качестве модифицированного пептида, имитирующего структурные мотивы цепей коллагена, используют Z-Gly-DL-Pro-Gly-, причем на 1 г носителя берут 9-40 мг пептида и 20-23 мг конденсирующего агента.

3. Способ получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов по п.1, отличающийся тем, что в качестве модифицированного пептида, имитирующего структурные мотивы цепей коллагена, используют Pro-Gly-Gly-, (Pro-OH)-Gly-Gly-, причем на 1 г носителя берут 40-80 мг пептида и до 500 мг конденсирующего агента.

4. Способ получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов по п.1, отличающийся тем, что взаимодействие осуществляют в течение 0,5-1,0 ч в вакууме с использованием роторного испарителя.

5. Способ получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов по п.1, отличающийся тем, что в качестве растворителя используют диметилформамид, этанол.

6. Способ получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве конденсирующего агента используют п-бензохинон или карбодиимид.

7. Способ получения афинного сорбента для очистки ферментных препаратов по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве аминосодержащего нерастворимого носителя используют аминосилохром, аминодиасорб.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии ферментных препаратов, может быть использовано для очистки и фракционирования целлюлолитических ферментов и касается способов получения аффинного адсорбента

Изобретение относится к области медицины, биологии и ветеринарии

Изобретение относится к cпособу иммобилизации белковых молекул на поверхности магнитоуправляемых наночастиц железа, покрытых углеродной оболочкой. Способ включает взаимодействие порошка с растворенным в воде 4-карбоксибензолдиазоний тозилатом для формирования ковалентной связи органических функциональных групп с поверхностью порошка наночастиц железа, покрытых углеродной оболочкой. Дополнительно проводят карбодиимидную активацию с использованием систем: дициклогексилкарбодиимида с N-гидроксисукцинимидом в диметилсульфоксиде (DCC/NHS в ДМСО) или 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлориде с N-гидроксисукцинимидом в воде (EDC/NHS в H2O) или фосфатном буферном растворе. Осуществляют ковалентную «сшивку» белковых молекул с активированной COOH-группой в водной или буферной среде. Изобретение позволяет осуществить иммобилизацию биомолекул на поверхности магнитоуправляемых наночастиц железа, покрытых углеродной оболочкой. 3 ил., 8 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ печати биологических лигандов, представляющих собой олигосахариды, и/или полисахариды, и/или пептиды, и/или гликопептиды, и/или биотин. Предварительно на подложку наносят слой гидрофобной нелетучей жидкости, не смешивающейся с растворителем биологических лигандов и имеющей удельную массу меньше, чем удельная масса раствора биологических лигандов. Затем бесконтактным методом осуществляют печать биологических лигандов. В качестве гидрофобной нелетучей жидкости используют вазелин, минеральное масло или высшие предельные углеводороды или их смесь. Толщина слоя гидрофобной нелетучей жидкости предпочтительно составляет 50-200 мкм. Техническим результатом изобретения является повышение равномерности высыхания капель раствора биологических лигандов на подложке при одновременном обеспечении защиты биологических лигандов от преждевременного гидролиза и улучшении морфологии спотов. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и трансплантационной медицины и представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:40. При этом пептид обладает способностью регенерировать костную ткань и специфически связываться с поверхностью минерала апатит. Пептид способен стабильно иммобилизоваться на поверхности апатита для сохранения полезной активности и оказания воздействия на регенерацию кости в течение длительного времени. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 4 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению меченых антител, и может быть использовано для диагностики. Антитела конструируют с заменой одной или нескольких аминокислот исходного антитела на не являющиеся перекрестно связанными, высокореакционноспособные цистеиновые аминокислоты. Сконструированные антитела с цистеиновыми заменами (Ab) конъюгируют с одной или несколькими метками с комплексом циркония (Z) через линкер (L) для получения конъюгатов меченных цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами, обладающих формулой I: Ab-(L-Z)p, где p представляет собой 1-4. Изобретение позволяет повысить эффективность диагностики за счет использования меченных радиоактивным цирконием сконструированных антител с цистеиновыми заменами для получения изображений. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 29 ил., 12 табл., 23 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению производных фактора свертывания крови VII и VIIa, их конъюгатов с полимерами, способными увеличивать время полувыведения из кровотока, комплексов с ними, полученных путем связывания носителя с конъюгатом, к генам, кодирующим производные, к экспрессирующим векторам, содержащим эти гены, трансформантам с введенными экспрессирующими векторами, к способам их получения, фармацевтическим композициям и способам лечения, и может быть использовано в медицине для предупреждения или лечения гемофилии или улучшения свертываемости крови. Получают производное FVII, соединенное по своему С-концу с пептидным линкером для связи с непептидильным полимером, способным увеличивать время полувыведения FVII или FVIIa из кровотока. При этом пептидный линкер представляет собой частичную последовательность супероксиддисмутазы SOD1, ее мутированную последовательность или последовательность GGGGSC. Изобретение позволяет получить производное FVII, способное связываться с носителем, увеличивающим время полувыведения из кровотока при сохранении активности FVII. 17 н. и 25 з.п. ф-лы, 8 ил., 3 табл., 8 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения афинного сорбента для очистки коллагеназ, и может быть использовано для выделения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые используются в медицине, биохимии, пищевой промышленности, в ферментативном синтезе пептидов, а также для исследовательских целей

Наверх