Рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая биосинтез человеческого альфа 2-интерферона, и способ его получения

 

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии. Путем встройки в вектор pQE30 гена α2-интерферона и инвертированного гена htpR сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pASIF62. Также предложен способ биосинтеза α2-интерферона в клетках E.coli с последующей очисткой целевого продукта, заключающийся в том, что E. coli трансформируют плазмидной ДНК pASIF62, а культивирование проводят до достижения мутности 0,4-0,6 ОД, после чего в среду добавляют 0,1-0,3 мМ изопропил-b-тиогалактозида. Применение изобретения обеспечивает повышенный выход α2-интерферона. 2 с. и 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 1 табл.

Изобретение относится к генетической инженерии, конкретно к генетической конструкции, кодирующей синтез α2-интерферона человека, и которая может быть использована для его промышленного получения в штаммах E.coli.

Интерфероны впервые привлекли внимание благодаря своей способности вмешиваться в репликацию и продукцию разного рода вирусов. Это семейство мультифункциональных цитокинов, среди которых наиболее изученными являются интерферон-альфа (IFN-α), -бета (IFN-β), -гамма (IFN-γ).

Все интерфероны - продукты различных генов. IFN-α представляет целое семейство, белки которого кодируются как минимум 23 различными генами. Это 19-23 кДа полипептиды длиной от 156 до 172 аминокислот. Все IFN-α высокогомологичны и различаются лишь одной-двумя аминокислотами. В белковой последовательности имеются сайты потенциального гликозилирования, однако большинство подтипов IFN-α негликозилированы. Пространственная структура интерферонов состоит исключительно из альфа-спиралей и относится к классу "четырехспиральный бочонок". Биологической активностью обладают мономеры этого белка.

Интерфероны обладают множеством активностей, которые способствуют активации Т-клеточного иммунитета, что необходимо для естественной защиты организма от вирусных и бактериальных инфекций. Эти цитокины активирут другие иммунокомпетентные клетки - Т-клетки, NK-клетки, активированные макрофаги, стимулируя ранний неспецифический иммунный ответ. Они усиливают экспрессию рецепторов и антигенов эффекторными клетками, регулируют транскрипцию новых генов, стимулируют экспрессию белков комплекса гистосовместимости класса II (МНС II). Интерфероны обнаруживают антипролиферативную, цитостатическую и цитотоксическую активности на некоторых опухолевых клетках.

Эти белки также принимают участие в регуляции гемопоэза, в результате чего усиливается продукция и активация нейтрофилов, моноцитов, тромбоцитов, что, в свою очередь, является ключевым событием воспалительного процесса. И это лишь малая часть активностей, которыми обладают интерфероны.

Суммируя вышесказанное, можно сделать вывод, что использование экзогенных интерферонов для лечения многих заболеваний - воспалительных, опухолевых и многих других, где необходима иммуномодулирующая активность, более чем оправдано. В связи с вышеописанными свойствами интерферона многими исследователями были разработаны штаммы-продуценты для наработки рекомбинантного аналога этого белка (патенты WO 01/42301 А1, WO 01/25438 А2, WO 00/69913, WO 01/57217 A1, WO 87/06616, WO 88/09673, EP 0032134 В1, ЕР 0626448 А2, ЕР 0538300 B1, US 5710027, SU 1092176 A).

Наиболее близкой по технической сущности является рекомбинантная ДНК, ее штамм-продуцент на базе Е.соli, которые пригодны для промышленного получения α2-интерферона (US 5710027, кн. 435-69.51, 1998).

Рекомбинантная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, α2-интерферон-гена, слитую с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида теплоустойчивого энтеротоксина E.coli, под контролем Е.соli фосфотазного промотора (phoA).

Вектор, содержащий рекомбинантную ДНК, устойчиво экспрессируется в E.coli, обеспечивает стабильную секрецию белка в преплазматическое пространство клетки и дает правильно сформированный с аутентичным N-терминаторным концом и правильными дисульфидными связями α2-интерферон (то есть биологически активный α2-интерферон) с промышленно пригодным выходом - 15-20% от общего клеточного белка.

Однако известная рекомбинантная ДНК, вектор, ее содержащий, и используемый штамм дают продукт, который требует многостадийной очистки, включающей последовательную хроматографию на силикагеле, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, катионно-обменную и анионно-обменную хроматографии.

Изобретательской задачей является повышение выхода и упрощение очистки биологически активного (то есть с сохраненными структурными особенностями, отмеченными выше) α2-интерферона.

Изобретательская задача решается тем, что предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pASIF-62, кодирующая синтез α2-интерферона, которая имеет размер 4200 т.п.о. и состоит из следующих элементов: lac-промотор, АТГ-кодон, ген α2-интерферона размером 642 нуклеотида, инвертированный фрагмент ДНК-гена htpR размером 350 нуклеотидов, ген устойчивости к ампициллину и сайты для рестриктаз Pst, Hind III, BamHI, а также содержит 18 нуклеотидных остатков, оперативно связанных с lac-промотором и геном интерферона и кодирующих 6 гистидиновых остатков.

Предлагается также способ получения человеческого α2-интерферона экспрессией его гена в составе рекомбинантной ДНК в Е.соli, отличием которого является то, что экспрессию осуществляют в рекомбинантной плазмиде pASIF-62 в ростовой среде до ее мутности 0,4-0,6 ОД, после чего в нее добавляют 0,1-0,3 мМ изопропил-b-тиогалактозида - индуктора lас-промотора (ИПТГ) и экспрессию продолжают под контролем индуцированного lac-промотора рекомбинантной плазмиды. Очистку целевого продукта, полученного в плазмидной ДНК pASIF-62 осуществляют в одну стадию методом катионно-обменной хроматографии на агарозном носителе. В способе предполагается в виде предпочтительного варианта использовать штаммы Е.соli, дефектные по гену htpR.

По предлагаемому способу экспрессия интерферона осуществляется в цитоплазматическую среду Е.соli, что создает определенные трудности в правильном фолдинге белка, а также в подборе лидера стабильной экспрессии, который не должен менять аутентичность терминаторного конца.

Другой проблемой цитоплазматической экспрессии гетерологичных белков в E.coli является проблема многостадийной очистки, требующей на первой стадии дорогостоящей очистки с помощью иммуноаффинной хроматографии (ЕР 396555).

Предложенная рекомбинантная плазмида для получения α2-интерферона и способ получения с ее использованием обходят все эти проблемы за счет использования Заявителем нового подхода, предложенного ниже и доказывающего “изобретательский уровень” предложенного изобретения.

Известно, что за агрегацию чужеродных рекомбинантных полипептидов в клетках E.coli отвечают “шапероны”, то есть белки “теплового шока” (БТШ). К их числу относятся белки DNAK, groES и groEL, которые вызывают агрегацию чужеродных полипептидов, и Lon-протеаза, осуществляющая их избирательную деградацию. Регуляция транскрипции генов, кодирующих белки “теплового шока”, осуществляется белком htpR, который является альтернативной δ-субъединицей РНК-полимеразы и при встраивании в голофермент обеспечивает избирательную транскрипцию генов БТШ в условиях синтеза аномальных белков. Ранее нами было установлено, что в клетках E.coli, дефектных по БТШ, наблюдается более интенсивное накопление рекомбинантных белков, а из “телец включения”, полученных в этих штаммах, существенно выше выход белков с природной конформацией (с правильным фолдингом).

Эти наблюдения позволяют сделать вывод, что нарушение функции шаперонов в клетках E.coli придает клеткам весьма полезные с биотехнологической точки зрения свойства, так как значительно повышается “выход” рекомбинантных продуктов.

Однако известные мутации, которые нарушают функцию шаперонов и снижают протеолитическую активность клеток, существенно нарушают ростовые свойства клеток E.coli, стимулируют образование слизи, что затрудняет промышленное культивирование рекомбинантных штаммов.

Нами предложено другое решение этой проблемы, состоящее в том, что рекомбинантная плазмида, кодирующая синтез α2-интерферона, за последовательностью гена IFN содержит короткую инвертированную последовательность гена htpR-регулятора экспрессии генов БТШ. Молекулы РНК, синтезирующиеся при транскрипции этой последовательности, имеют структуру, комплиментарную структуре mРНК гена htpR и могут выполнять функцию антисмысловой РНК, блокируя синтез БТШ посредством инактивации белка HtpR.

Сделанный Заявителем выбор лидерной последовательности из шести гистидиновых остатков отвечает в наибольшей степени основным биотехнологическим требованиям, которые могут быть к нему предъявлены.

Это, в первую очередь, надежная экспрессия слитого вместе с ним α2-интерферона, отсутствие необходимых в таких случаях точечных замен для адаптации к белоксинтезирующему аппарату клетки-хозяина, упрощение конечного выделения и очистки слитого белка, а также отсутствие препятствий для корректного фолдинга зрелого белка.

Для получения рекомбинантной ДНК был использован вектор pQE30, содержащий lac-промотор, участок инициации трансляции, область, кодирующая 6 гистидиновых остатков, и полилинкер, содержащий 6 сайтов рестрикции.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Клонирование гена α2-интерферона человека.

В качестве источника генов α2-интерферона были использованы:

1. Библиотека генов человека

2. Плазмида из промышленного штамма-продуцента α2-интерферона на основе Pseudomonas Putida

3. Плазмида из промышленного штамма-продуцента α2-интерферона на основе Escherichia coli.

Фрагмент гена IFN2, соответствующий зрелой части белка, был выделен из трех выше перечисленных источников методом амплификации с помощью праймеров:

IFNA2-L gc gga tcc atg tgt gat ctg cct caa ace

IFNA2-R ccc aag ctt tea ttc ctt act tct taa.

Фрагмент был обработан рестриктазами BamHI+HindIII и клонирован между BamHI и HindIII сайгами трех типов векторов для экспрессии.

В каждом случае получено и проанализировано по 20 независимых клонов.

Индукция синтеза интерферона оценивалась в 10 мл IPTG-индуцированных культур (выращивание до OD600=0.5, внесение IPTG до 0.2 мМ, затем 3 часа при 37С на качалке). Продукция белка ожидаемого размера проверена по SDS-PAGE.

В качестве клеток-“хозяев” были использованы штаммы E.coli BL21, DLT1270, DSK-41. Штамм DSK-41 получен в лаборатории молекулярной биологии ВНЦМДЛ путем внесения мутации в ген htpR, в результате чего в штамме наблюдается пониженный уровень протеолиза, что повышает выход любых рекомбинантных белков. Другая особенность штамма DSK-41 состоит в том, что в стационарной фазе роста в этом штамме наблюдается спонтанная дерепрессия генов, находящихся под контролем lac-промотора и lac-репрессора, вероятно, за счет деградации lac-репрессора.

Праймеры:

IFNA2-L gc gga tcc atg tgt gat ctg cct caa асc

IFNA2-R ccc aag ctt tca ttc ctt act tct taa

На фиг.1 показана последовательность гена human IFNA2, где начало гена - 69 нт (ATG), конец - 635 нт (TGA), зрелая часть белка соответствует участку 138-635 нт. Начало гена, начало зрелой части и стоп-кодон подчеркнуты. Для экспрессии взята зрелая часть. Вставляли между BamHI/HindIII сайтами pQE30.

Пример 2.

Клонирование последовательности гена htpR.

Фрагмент гена htpR выделяли из плазмиды pKV3, содержащей полимеразный ген htpR из генома E.coli. Плазмидную ДНК обрабатывали рестриктазами Hind III и Pst I и после фракционирования в агарозном геле выделяли фрагмент гена htpR размером 350 нуклеотидных пар. Фиг.2 представляет собой гипотетическую схему взаимодействия мРНК гена htpR с антисмысловой РНК.

Пример 3

Исследование протеолитической активности в штаммах E.coli, содержащих плазмиду pASIF62.

Для конструирования плазмиды, кодирующей синтез α2-интерферона, использовали вектор pQE30, куда встраивали ген IFN под контроль lас-промотора, таким образом, что на N-концевой последовательности белка синтезировались 6 остатков гистидина. Затем в 3’-концевую область гена после терминирующих кодонов встраивали фрагмент гена htpR в обратной ориентации, описанный в примере 2. Общая схема генетической конструкции представлена на фиг.3 (Рекомбинантная плазмида pASIF62).

Предполагается, что в результате индукции синтеза интерферона в клетках E.coli в присутствии IPTG будет образовываться антисмысловой транскрипт инвертированного фрагмента гена htpR, который при взаимодействии с mРНК htpR будет блокировать синтез БТШ и, следовательно, снижать уровень протеолиза в клетках E.coli.

Определение протеолитической активности штаммов

Скорости протеолитической деградации белков измеряли согласно методу Гольдберга. Бактериальные клетки выращивали при 30°С в минимальной среде М9, содержащей необходимые добавки. При достижении оптической плотности культуры при 550 нм = 0,4-0,5 в среду вносили пуромицин до конечной концентрации 300 мкг/мл и спустя 15 мин L-³Н-лейцин до конечной концентрации 0,2 Ки/мл. После этого клетки выращивали еще в течение 10 мин, собирали центрифугированием, отмывали дважды в среде М9, содержащей “холодный” лейцин в концентрации 75 мкг/мл для предупреждения повторного включения ³H-лейцина, высвобождающегося из белков. Клетки суспендировали в концентрации 2,5×10⁵ мл. Скорость деградации аномальных пуромициновых полипептидов определяли по накоплению меченых свободных аминокислот в ТХУ-растворимой фракции. Как следует из результатов, представленных на фиг.4А и 4Б (скорость деградации ³H-пуромициновых полипептидов в штаммах: -BL21c плазмидой pASIF62, -BL21 без плазмиды pASIF62) - в штамме Е.соli BL21, не содержащем плазмиду pASIF62, наблюдается значительное усиление протеолиза при температуре +42°С, тогда как в штамме, содержащем плазмиду, уровень протеолиза в аналогичных условиях существенно ниже.

Пример 4

Синтез α2-интерферона человека в штаммах E.coli

Уровень синтеза α2-интерферона определяли в штаммах E.coli, содержащих плазмиду pIF62 (не содержащую последовательность гена htpR и имеющую нормальный уровень протеолиза) и плазмиду pASIF62, ингибирующую синтез протеаз.

Клетки E.coli выращивали до плотности ОД-05, вносили IPTG до концентрации 0,2 мМ для индукции синтеза интерферона. Клеточные белки фракционировали в 13% SDS ПААГе.

Из данных, представленных на фиг.5, следует, что в идентичных условиях роста клетки E.coli, содержащие плазмиду pASIF62, синтезируют рекомбинантный α2-интерферон. На фиг.5 представлен электрофорез белков штаммов E.coli в полиакриламидном геле, где

1 - маркеры молекулярного веса,

2 - штамм E.coli, содержащий рекомбинантную плазмиду pIF62 с геном α2-интерферон,

3 - штамм E.coli с рекомбинантной плазмидой.

Пример 5

Выделение рекомбинантного α2-интерферона

Клетки Е.coli штамма DLT1270 трансформировали плазмидой pASIF62 и выращивали в течение ночи при 37°С в среде LB с добавлением ампициллина (100 мкг/мл) и глюкозы (0,2%). Затем разбавляли ночную культуру в 25 раз свежей средой LB с ампициллином и подращивали 2-3 часа до мутности около 0,5, после чего добавляли раствор ИПТГ до 0,2 мМ. Растили еще 3 часа, центрифугировали культуру при 5 тыс. об/мин 10 мин, супернатант отбрасывали.

Осадок после центрифугирования суспендировали в буфере 20 мМ трис-НСl, рН 8, 0,3 М NaCl (1 мл на осадок из 50 мл культуры) и озвучивали 6 импульсов по 15 сек. Центрифугировали 10 тыс. об/мин, 10 мин, осадок промывали тем же буфером с добавлением 0,1% Тритон Х-100 (0,5 мл), после чего суспендировали с помощью гомогенизатора в 5 мл буфера А (10 мМ трис-НСl, рН 8, 6М мочевина, 0,4М NaCl, 10 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ имидазол). Перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре, отделяли супернатант центрифугированием при 10 тыс. об/мин 10 мин, осадок отбрасывали.

Колонку с IDА-агарозой (1 мл) заряжали раствором NiSO₄, уравновешивали буфером А с 5 мМ имидазолом. Супернатант наносили на колонку, промывали 5 мл буфера А, затем 10 мл буфера В (буфер А с 20 мМ имидазола). Элюцию проводили буфером С (10 мМ трис-HCl, рН 8, 2М мочевина, 0,4М NaCl, 10 мМ р-меркаптоэтанол, 0,3 М имидазол). Этот буфер добавляли по 0,5 мл, собирая соответствующие фракции. Обычно белки HI 6 и HI 8 обнаруживались во фракциях 1-3.

Объединенные фракции диализовали в течение ночи против 100-кратного объема буфера 10 мМ трис-HCl, рН 8, 150 mM NaCl.

Выделенный α2-интерферон был охарактеризован методом жидкостной хроматографии и электрофорезом в ПААГе. На фиг.6 представлены данные электрофоретического анализа рекомбинантного α2-интерферона в полиакриламидном геле, где М - маркеры; INF-α2-интерферон.

На фиг.7 представлена хроматографическая характеристика рекомбинантного α2-интерферона человека.

Предлагаемое изобретение поясняется таблицей.

Выход составил 30% от общей массы клеточного белка.

Как следует из представленных данных, описанный метод выделения позволяет получить гомогенный белок, лишенный дополнительных примесей.

Пример 6

Иммунохимическая характеристика рекомбинантного α2-интерферона.

С целью идентификации рекомбинантного белка были проведены иммунологические исследования методом непрямого иммуноферментного анализа, с помощью моноклональных антител к α2-интерферону человека. В качестве стандарта был использован коммерческий препарат α2-интерферона (Интрон), производимый фирмой Шеринг-Плау (США). На фиг.8 приведены результаты экспериментов, подтверждающие полную идентичность двух белков.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pASIF62, кодирующая биосинтез человеческого α2-интерферона, которая характеризуется тем, что она имеет размер 4200 т.п.о. и представляет собой вектор рQЕ30 с lac-промотором, геном устойчивости к ампицилину и последовательностью из 18 нуклеотидов, кодирующей 6 гистидиновых остатков, в который оперативно встроены ген интерферона размером 642 нуклеотида (между сайтами для рестриктаз BamHI и HindIII) и инвертированный фрагмент ДНК гена htpR размером 350 нуклеотидов (между сайтами для рестриктаз HindIII и PstI).

2. Способ получения человеческого α2-интерферона путем экспрессии его гена в составе рекомбинантного вектора в E.coli с последующей очисткой целевого белка, отличающийся тем, что экспрессию гена осуществляют в составе рекомбинантной плазмидной ДНК pASIF62, клетки E.coli культивируют до мутности 0,4-0,6 ОД, после чего в среду добавляют 0,1-0,3 мМ изопропил-b-тиогалактозида (ИПТГ) и продолжают культивирование до накопления целевого продукта.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что используют мутантные по гену htpR штаммы E.coli.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что очистку целевого продукта осуществляют в одну стадию методом катионно-обменной хроматографии на агарозном носителе.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9