Способ обработки тканей трансплантатов для сердечно- сосудистой хирургии

 

Изобретение относится к медицине, а именно к сердечно-сосудистой хирургии. Способ включает инкубацию в растворе с агентами, вызывающими гибель клеток донора, инкубацию в питательной среде для смывки агентов. Инкубацию проводят при 37°С в течение суток в 0,02% растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты или этилендиаминтетрауксуснокислого натрия в растворе Хэнкса, гентамицина - 400 мг/л, флуканазола - 20 мг/л с последующей инкубацией при 37°С в течение суток в минимальной питательной среде Игла без кальция с добавлением 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты или этилендиаминтетрауксуснокислого натрия. Технический результат - снижение способности ткани и кальцификации в сочетании с уменьшением иммунной реакции на имплантат. 1 табл., 2 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к сердечно-сосудистой хирургии. Из литературы известно о негативной роли клеток донора в тканях аллографтов и ксенографтов для сердечно-сосудистой хирургии, вызывающих атаку со стороны иммунной системы реципиента. При использовании тканей ксенографтов, например клапанов сердца, применяется обработка тканей агентами, вызывающими гибель клеток и образующими кросс-сшивки в тканевом матриксе. Преимущество такой обработки состоит в подавлении иммунного ответа против ткани имплантата, что обусловлено гибелью ксеногенных клеток. Недостаток состоит в том, что после обработки кросс-сшивающими агентами происходит кальцификация ткани после имплантации и ткань не способна к ее заселению клетками реципиента. При использовании тканей аллографтов, например клапанов сердца, также встает вопрос о необходимости удаления клеток донора, особенно при имплантации детям раннего возраста. Поэтому в последние годы стали разрабатываться методы обработки тканей в первую очередь ксенографтов для сердечно-сосудистой хирургии, способные вызывать гибель клеток донора при сохранении целостности тканевого матрикса и его способности к заселению клетками реципиента (O'Brien M.F., Goldstein S., Walsh S., Black K.S., Elkins R., Clarke D. The SynerGraft valve: a new acellular (nonglutaraldehyde-fixed) tissue heart valve for autologous recellularization. First experimental studies before clinical implantation. Sem Thorac Cardiovasc Surg 1999; 4(Suppl 1): 194-200; Teebken O.E., Bader A., Steinhoff G., Haverich A. Tissue engineering of vascular grafts: human cell seeding of decellularised porcine matrix. Eur J Vase Endovasc Surg 2000; 19: 381-386).

Известен способ обработки тканей алло- и ксенографтов для сердечно-сосудистой хирургии, исключающий использование кросс-сшивающих агентов, при котором для снижения иммуногенности ткани путем удаления клеток донора применяют инкубацию в гипотонической среде (дистиллированная вода) с последующей обработкой нуклеазами (Sem Thorac Cardiovasc Surg 1999, vol.4, Suppl 1, p.194-200).

Недостатком способа является то, что при такой обработке сохраняется высокая способность к кальцификации стенок кровеносных сосудов, например аорты.

Известен способ обработки тканей алло- и ксенографтов для сердечно-сосудистой хирургии, исключающий использование кросс-сшивающих агентов, включающий многоступенчатую инкубацию в растворах, содержащих протеолетический фермент трипсин и хелатирующий агент этилендиаминтетрауксусную кислоту, с последующей обработкой нуклеазами (Eur. J Vasc. Endovasc. Surg., 2000, vol.19, p.381-386).

Недостатком способа является то, что при такой обработке происходит нарушение структуры тканевого матрикса, что способствует значительной кальцификации стенок кровеносных сосудов, например стенок аорты клапанов сердца.

Известен способ химической обработки тканей для сердечно-сосудистой хирургии без использования детергентов или энзимов для получения бесклеточного тканевого каркаса (Патент США №5993844, 11-30-1999). Способ предназначен для содержащих коллаген тканей, которые обрабатывают, чтобы удалить неколлагеновые компоненты, такие как клетки, клеточный дебрис и другие компоненты внеклеточного матрикса, такие как протеогликаны и гликозаминогликаны. Обработка тканей щелочами, хелатирующими агентами, кислотами и солями удаляет неколлагеновые компоненты из коллагенового тканевого матрикса, в то время как сам коллагеновый матрикс сохраняет структурную организацию, целостность и способность к биоремоделируемости, т.е. не препятствует миграции в него миофибробластов, ответственных за поддержание нативности тканевого матрикса. Процесс не требует необходимости использования детергентов и ферментов, которые отрицательно влияют на биосовместимость и биоремоделирование коллагенового матрикса, предназначенного для имплантации.

Недостатком этого способа является применение жесткой обработки, которая вызывает не только гибель клеток, но и удаление из матрикса остатков клеток, а также гликозаминогликанов, которые необходимы для подавления кальцификации на коллагеновом матриксе. Поэтому такая обработка способствует усилению кальцификации ткани, что ограничивает возможность биовосстановления нативной структуры ткани.

Задачей настоящего способа является снижение способности ткани к кальцификации в сочетании с уменьшением иммунной реакции на имплантант.

Поставленная задача достигается за счет использования агентов, вызывающих гибель клеток донора путем апоптоза. В частном случае в качестве агента, вызывающего апоптоз, используют раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты или ее соли.

Обработка агентами, вызывающими апоптотическую гибель клеток, способствует лучшему сохранению тканей трансплантатов. Под апоптозом понимается такая форма гибели клеток, которая связана с запуском каскада реакций, запрограммированных на медленную элиминацию клетки, включающих фрагментацию ДНК, активацию рестриктазной, эндонуклеазной, протеазной активности внутри клетки. В ходе апоптоза происходит фрагментация ядра и клетки с образованием апоптозных телец, которые могут быть фагоцитированы макрофагами или соседними клетками. То есть при апоптозе происходят деструкция и саморазрушение клеток при сохранении целостности плазматической мембраны. Это имеет принципиальное значение для предотвращения воспалительных процессов. В отличие от этого при некротической гибели происходит быстрое повреждение плазматической мембраны и внутриклеточные компоненты, включая лизосомальные ферменты, вытекают в межклеточный матрикс и способны вызывать повреждение соседних клеток и самого матрикса. Другими словами, при апоптозе клетки угасают, создавая минимум повреждений микроокружению, при некрозе клетка не успевает погибнуть “аккуратно” и погасить комплекс внутриклеточных ферментативных активностей, которые способны вызывать повреждения ее микроокружения и воспалительные процессы.

Соответственно этому при обработке тканей аллографтов и ксенографтов агентами, вызывающими некротическую клеточную гибель, будут происходить значительные повреждения матрикса, связанные с воздействием клеточных гликозидаз на гликозаминогликаны матрикса, протеаз на белки матрикса, в результате чего на коллагене открываются места отложения фосфатов кальция, которые будут ответственны за кальцификацию после имплантации. При обработке тканей агентами, вызывающими апоптозную гибель клеток, внутриклеточная ферментативная активность угасает в ходе апоптоза внутри клетки, и после нарушения целостности плазматической мембраны не происходит таких повреждений матрикса, как при некрозе, сохраняется нативная организация матрикса, препятствующая его кальцификации.

В настоящее время разработаны как методы идентификации апоптотической гибели клеток, так и способы инициации апоптоза. Однако для достижения поставленной цели необходимо применять такие способы инициации апоптоза, которые не вызывают повреждений межклеточного матрикса, способных усилить кальциноз.

В частном случае предлагается способ обработки тканей трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии, в котором в качестве агента, вызывающего апоптотическую гибель клеток донора, используют этилендиаминтетрауксусную кислоту или ее соли. Для этого трансплантат (аллографт или ксенографт) после забора у донора или после криоконсервации помещают в раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты или ее соли. После этого ткань отмывают от этилендиаминтетрауксусной кислоты или ее соли питательной средой и имплантируют реципиенту либо отправляют на криоконсервацию.

Примеры использования способа.

Пример 1.

Сегменты стенки аортального клапана сердца свиньи помещали в 0,02% раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в растворе Хэнкса, гентамицина (400 мг/л), флуканазола (20 мг/л) и инкубировали при 37°С в течение 1 суток. Затем сегменты переносили в минимальную питательную среду Игла без кальция с добавлением 0,02% ЭДТА и инкубировали при 37°С в течение 1 суток. После такой инкубации наблюдали активную пикнотизацию ядер клеток в ткани, фрагментацию ядер, образование апоптозных телец, используя для наблюдения прижизненный метод люминесцентной микроскопии и ядерные красители. Это подтверждает апоптотический характер гибели клеток. Другие сегменты аортальных стенок этих же клапанов инкубировали 1 сутки в дистиллированной воде, чтобы вызвать у них гипотонический шок и некротическую гибель, а затем ткани инкубировали в физиологическом растворе, содержащем рибонуклеазу (20 мкг/мл) и дезоксирибонуклеазу (0,2 мг/мл) в течение 1 суток, как описано в работе (Sem Thorac Cardiovasc Surg 1999, vol.4 (Suppl 1), p.194-200). Другую часть таких же сегментов обрабатывали согласно другому известному методу путем инкубации в течение 24 часов в растворе, содержащем протеолитическоий фермент трипсина (0,25%), ЭДТА (0,02%), с последующей обработкой в физиологическом растворе, содержащем рибонуклеазу (20 мкг/мл) и дезоксирибонуклеазу (0,2 мг/мл), в течение 2 часов, а затем в течение 24 часов в указанной смеси растворов трипсина и ЭДТА (Eur. J Vase. Endovasc. Surg., 2000, vol.19, р.381-386). Согласно данным люминесцентного анализа при таких известных способах обработки происходит некротическая гибель клеток в ткани.

Способность к кальцификации сегментов ткани, обработанных агентом, вызывающим апоптотическую гибель, некротическую гибель и не подвергавшихся обработке, в которых 90% клеток донора оставались живыми, определяли методом подкожной имплантации в крысу. Для этого участки ткани, отмытые после обработки от агентов физиологическим раствором, помещали в пористые камеры из нержавеющей стали с размером 40 мкм (для уменьшения образования капсулы вокруг ткани) и имплантировали крысам линии Wistar под кожу в области спины. После 2 месяцев образцы ткани эксплантировали, высушивали и методом атомной абсорбционной спектроскопии определяли содержание в них кальция. На фиг.1 приведены данные о содержании кальция после 60 суток подкожной имплантации крысам в эксплантированных сегментах стенок аортального клапана сердца свиньи, не подвергавшихся обработке, обработанных известными способами, вызывающими некротическую гибель клеток донора, и заявляемым способом, вызывающим апоптотическую гибель клеток. Видно, что при обработке агентами, вызывающими некротическую гибель клеток, кальцификация усиливается в сравнении с необработанными тканями, а при обработке заявляемым способом кальцификация значительно меньше, чем в обработанных известными способами и в необработанных тканях. Таким образом предложенный способ не только обеспечивает гибель клеток донора, что необходимо для снижения иммуногенности имплантата, но и снижает кальцификацию ткани после имплантации.

Пример 2.

Сегменты мышечной ткани аортального клапана сердца свиньи помещали в 0,02% раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в растворе Хэнкса, гентамицина (400 мг/л), флуканазола (20 мг/л) и инкубировали при 37°С в течение 1 суток. Затем сегменты переносили в минимальную питательную среду Игла без кальция с добавлением 0,02% ЭДТА и инкубировали при 37°С в течение 1 суток. Как указано выше, при такой обработке мы наблюдали признаки апоптотической клеточной гибели. Затем ткани отмывали в физиологическом растворе от агента. Способность к кальцификации мышечной ткани, обработанной предлагаемым способом и необработанной, определяли методом подкожной имплантации в крысу, как описано в примере 1. Было обнаружено, что необработанная ткань кальцифицируется в течение 2 месяцев значительно, отложения кальция достигают 60-70 мг/г сухого веса, а ткань, обработанная предлагаемым способом, практически не кальцифицируется и содержание в ней кальция остается на уровне, близком к тому, который характерен для тканей перед имплантацией (таблица). Таким образом, предлагаемый способ обработки, примененный к мышечной ткани ксенографтов клапанов сердца, радикально снижает их способность к кальцификации после имплантации.

Пример 3.

Сегменты стенки легочного клапана сердца свиньи помещали в 0,02% раствор этилендиаминтетрауксуснокислого натрия (ЭДТА-Na) в растворе Хэнкса, гентамицина (400 мг/л), флуканазола (20 мг/л) и инкубировали при 37°С в течение 1 суток. Затем сегменты переносили в минимальную питательную среду Игла без кальция с добавлением 0,02% ЭДТА-Na и инкубировали при 37°С в течение 1 суток. Как и в первом примере, после такой обработки наблюдается апоптотический характер гибели клеток. Другую часть таких же сегментов обрабатывали согласно другому известному способу, описанному в примере 1, путем инкубации в течение 24 часов в растворе трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,02%) с последующей обработкой в физиологическом растворе, содержащем рибонуклеазу (20 мкг/мл) и дезоксирибонуклеазу (0,2 мг/мл) в течение 2 часов, а затем в течение 24 часов в указанном растворе трипсина и ЭДТА (Eur. J Vasc.Endovasc.Surg., 2000, vol.19, p.381-386). Как и в примере 1, при такой обработке известным способом происходит некротическая гибель клеток в ткани.

Способность к кальцификации сегментов ткани, обработанных агентами, вызывающими апоптотическую гибель (согласно изобретению), некротическую гибель (согласно известному способу) и не подвергавшихся обработке, в которых 90% клеток оставались живыми, определяли методом подкожной имплантации в крысу, как в примере 1. Участки ткани, отмытые после обработки агентами, помещали в сетку из нержавеющей стали и имплантировали крысам линии Wistar под кожу в области спины. После 2 месяцев ткани эксплантировали, высушивали и методом атомной абсорбционной спектроскопии определяли содержание в них кальция. На фиг.2 приведены данные о содержании кальция в эксплантированных сегментах стенок легочного клапана сердца свиньи после 60 суток подкожной имплантации крысам, не подвергавшихся обработке, обработанных известными способами, вызывающими некротическую гибель клеток донора, и предлагаемым способом, вызывающим апоптотическую гибель клеток. Видно, что при обработке агентами, вызывающими некротическую гибель клеток, кальцификация несколько меньше в сравнении с необработанными тканями, а при обработке заявляемым способом кальцификация значительно меньше, чем в обработанных известными способами и в необработанных тканях. Следовательно, предлагаемый способ не только обеспечивает гибель клеток донора, что необходимо для снижения иммуногенности имплантата, но и значительно снижает кальцификацию стенок легочных клапанов свиньи после имплантации.

Таким образом, предлагаемый способ обработки тканей аллографтов и ксенографтов для сердечно-сосудистой хирургии, обеспечивая гибель клеток донора и уменьшая тем самым иммунную реакцию на имплантат, позволяет добиться снижения кальцификации тканей после их имплантации.

Формула изобретения

Способ обработки тканей трансплантатов для сердечно-сосудистой хирургии, включающий инкубацию в растворе с агентами, вызывающими гибель клеток донора, инкубацию в питательной среде для смывки агентов, отличающийся тем, что инкубацию проводят при 37°С в течение суток в 0,02%-ном растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты или этилендиаминтетрауксуснокислого натрия в растворе Хэнкса, гентамицина - 400 мг/л, флуканазола - 20 мг/л с последующей инкубацией при 37°С в течение суток в минимальной питательной среде Игла без кальция с добавлением 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты или этилендиаминтетрауксуснокислого натрия.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2