Способ получения белкового изолята из содержащего белок вещества

 

Изобретение относится к способу получения белкового изолята из содержащего белок вещества. Вещество прежде всего размалывают до муки. Муку затем суспендируют в водном растворе. После этого белок из муки растворяют при использовании, по меньшей мере одной, вводимой противотоком протеазы. Затем при использовании неорганической кислоты белок осаждают из раствора и нейтрализуют. Белок переводят в раствор путем, по меньшей мере, двухстадийной обработки с помощью, по меньшей мере, одной протеазы, значений рН выше, чем 8, и нагревания при температуре 30-60°С. Муку на первой стадии обрабатывают при более низкой концентрации, по меньшей мере, одной протеазы, в расчете на массу белка, более низком значении рН и более высокой температуре, чем во второй стадии. После первой стадии от содержащей муку фракции отделяют первую надосадочную жидкость, из которой осаждают белок. После второй стадии от содержащей муку фракции отделяют вторую надосадочную жидкость, которую возвращают на первую стадию. Изобретение позволяет повысить выход белка без снижения качества белкового изолята. 8 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к способу получения белкового изолята из содержащего белок вещества.

Известно несколько способов экстракции белка из растительного сырья, причем основой этих способов является щелочная экстракция белка при значении рН от 7 до 9 и температуре 40-50°С. Экстрагированный белок затем очищают путем центрифугирования и подкисляют с помощью неорганической кислоты вплоть до достижения изоэлектрической точки белка. Осаждающийся в изоэлектрической точке белок снова концентрируют и очищают путем центрифугирования. Выход составляет 70% в расчете на содержащийся в сырье белок. Однако существенным недостатком является использование только сырья, в котором белок незначительно денатурирован. Непосредственно для получения самого важного растительного белкового изолята, соевого белкового изолята, ограничиваются так называемыми "белыми хлопьями" в качестве сырья, что является недостатком с точки зрения рентабельности. Белые хлопья образуются только за счет особой сушки сырья для получения соевого масла. Как правило, сырье менее осторожно высушивают, и тогда оно находится в форме так называемых "слегка поджаренных хлопьев", в которых белок сильно денатурирован.

Из патента DE-1203588 известно, что процессу щелочной экстракции при получении белка из содержащего белок вещества способствует предварительная обработка водной суспензии пероксидом водорода в щелочной области и протеолитическими ферментами. Для этого сначала повышают значение рН суспензии содержащего белок вещества, затем добавляют пероксид водорода и повышают температуру для инициирования перекисного окисления. Затем устанавливают значение рН 4-9 и к суспензии добавляют ферменты, минимум активности которых находится в этой области значений рН. После этого суспензию перемешивают в течение двух часов. Предпочтительно находят применение растительные ферменты, как бромелин, фицин и папаин. После ферментативного гидролиза белок растворяется благодаря тому, что значение рН повышают до 9-12. Одновременно используют высокие температуры, между тем известно, что они непосредственно в сочетании с высоким значением рН приводят к повреждению белка. Многократное изменение значения рН в случае этого известного способа делает дорогостоящим применение в промышленном масштабе и приводит к высокому расходу щелочи и кислоты, сопровождающемуся сильным солеобразованием.

Из патента DE-4429787-C2 также известно использование протеолитических ферментов для повышения растворимости белков. В этом случае исходное вещество подвергают экстракции сначала с помощью спирта, лишь после этого механически размельчают и затем ферментативно расщепляют с помощью эндо- и экзопротеаз в области значений рН от кислой до нейтральной. При этом осуществляют экстракцию примесей белка методом противотока. В случае этого известного способа после экстракции белка можно осуществлять обработку с помощью пероксида водорода. За счет использования спирта для экстракции способ является дорогостоящим и поэтому убыточным. Нужно постоянно учитывать взрывоопасность суспензий, а также инактивацию используемых ферментов за счет имеющегося спирта. Согласно определению в случае известного способа протеолиз ограничен областью значений рН<9,5, причем в патенте DE-4429787-C2 конкретно указана только область значений рН<7,5. Специалисту, однако, напротив, известно, что растворимость белка становится особенно высокой, если значение рН находится выше 9. В целом, коэффициент полезного действия известного способа по отношению к затратам на его осуществление незначителен, так что полученные белковые изоляты неконкурентноспособны.

Способ согласно ограничительной части п.1 формулы изобретения известен из патента DE-4339743-C1. Этот способ осуществляют без использования спирта. Для растворения белков, однако, необходимы значения рН выше 11,5, в особенности значение рН, равное 12,5, что связано с высоким расходом щелочи и кислоты для осуществляемой в дальнейшем нейтрализации. Перед протеолизом содержащее белок вещество обрабатывают с помощью протеазы при значении рН<10,5. Предварительная обработка при этом требует относительно больших количеств используемого фермента, что отрицательно сказывается на себестоимости производства. В случае этого способа отрицательным является также относительно высокое содержание соли в конце экстракции белка, которое на практике требует дополнительных стадий.

Из заявки на патент JP-2076597-A также известен способ экстракции белков из содержащего белок вещества, при котором работают с высокими количествами фермента. При этом к щелочной суспензии содержащего белок вещества, значение рН которой составляет 10-13, добавляют щелочную протеазу и осуществляют инкубацию при температуре 30-50°С в течение 1-20 часов. Затем осуществляют нейтрализацию и фильтрацию суспензии. Эти очень жесткие условия экстракции белка приводят к большим повреждениям белка. Так, хотя с помощью известного способа, можно получать гидролизаты для косметических применений, однако он непригоден для получения белковых изолятов для пищевого продукта.

В качестве общей стадии описанных выше способов можно указать использование расщепляющих белок ферментов перед щелочной экстракцией, которое повышает экстрагируемость белков при последующей щелочной экстракции.

Задачей настоящего изобретения является разработка способа согласно ограничительной части п.1 формулы изобретения, который, как в случае содержащих белок веществ с высокой, так и с низкой растворимостью белка, приводит к повышенному выходу белка при одновременно меньшем использовании вспомогательных средств, как вода, щелочь, кислота и фермент, без ухудшения качества полученного белкового изолята.

Согласно изобретению эта задача решается благодаря способу с отличительным признаком по п.1 формулы изобретения.

Предпочтительные варианты осуществления этого способа описаны в зависимых пунктах 2-10 формулы изобретения.

В случае нового способа с помощью щелочной экстракции по методу противотока осуществляют растворение белка за счет температурных градиентов, различных значений рН и одновременного воздействия расщепляющих белок ферментов во время каскада экстракций. В отдельном случае этой экстракции способствует использование пероксида водорода и/или спиртов.

Исходное вещество, если оно не имеет уже такого маленького размера частиц, размалывают до получения муки с размером частиц 50-100 мкм и смешивают с водой в соотношении от 1:5 до 1:8, причем суспензию доводят до температуры 30-60°С, в особенности до примерно 50°С. Значение рН суспензии устанавливают 8-10, в особенности примерно 9, с помощью гидроксидов щелочных или щелочноземельных металлов. Для повышения растворимости белка во время этой первой стадии экстракции уже можно добавлять протеазу. Предпочтительно, однако, добавляют осветленную надосадочную жидкость, соответственно фильтрат следующей стадии экстракции. Достигаемое при этом соотношение фермент/белок должно составлять от 1:2000 до 1:6000. После инкубации в течение 10-60 минут, в особенности примерно 20 минут, осуществляют первую сепарацию. Для этого в принципе пригодны все общепринятые технологии разделения. Предпочтительным является использование сепаратора фирмы Flottweg, с помощью которого для сепарации создается силовое поле 6000×g. При сепарации можно в значительной степени избегать ценообразования за счет создания вакуума. Пригодный вакуум находится в области абсолютного давления 300-500 мбар. Таким образом удается перерабатывать суспензию белка без антивспенивателя. Когда невозможно осуществлять сепарацию в вакууме, то нужно принимать меры в отношении достаточной дегазации суспензии перед сепарацией, если не могут быть использованы никакие антивспениватели.

После осуществленной сепарации нерастворившееся твердое вещество диспергируют в воде, затем гомогенизируют и после этого подвергают новой щелочной экстракции. Для этого устанавливают температуру при 30-45°С, в особенности примерно 40°С, значение рН при 10,5-11,5, в особенности примерно 11,2. В принципе, гомогенизацию можно осуществлять на любой стадии экстракции. Особенно эффективно, однако, проводить гомогенизацию перед описанной здесь стадией экстракции, которая вместе с тем должна быть предусмотрена как достаточная для осуществления нового способа. Важным является введение осветленной надосадочной жидкости или фильтрата из нижеследующей стадии экстракции в описываемую здесь стадию экстракции, так что соотношение фермент/белок составляет от 1:500 до 1:2000, в особенности примерно 1:1250. После экстракции в течение 10-60 минут осуществляют вторую сепарацию.

Затем твердое вещество в третий раз суспендируют в воде. При этом в зависимости от качества воды значение рН устанавливают 10,2-10,5. Температуру устанавливают при 25-40°С, в особенности примерно 35°С. К этой суспензии первоначально добавляют протеазу. Соотношение фермент/белок при этом составляет от 1:100 до 1:500, в особенности примерно 1:400. После добавления протеазы, в случае которой речь может идти также о смеси протеаз, осуществляют ферментативный гидролиз в течение 3-30 минут. В отношении продолжительности гидролиза руководствуются используемым количеством фермента, соответствующей ферментативной активностью и родом протеазы. Пригодные протеазы выбирают из групп серин-протеаз, цистеин-протеаз, аспарагин-протеаз и/или металлопротеаз.

Различные содержащие белок вещества в качестве сырья для нового способа обладают сенсорикой, которая делает непригодным к употреблению в пищу образующийся белковый изолят без принятия особых мер. Поэтому оказывается предпочтительным добавление пероксида водорода во время второй стадии щелочной экстракции. При этом его количество, в расчете на 35%-ный раствор пероксида водорода, может составлять 5-50 мл на кг белка, в особенности 20 мл/кг белка. Концентрацию нужно подбирать так, чтобы не происходило повреждения используемых протеаз.

Если в содержащем белок исходном веществе могут содержаться органические вещества, которые невозможно удалить путем предварительной водной обработки, то щелочную экстракцию преимущественно осуществляют в присутствии 5-20% спирта, в особенности 10% спирта. За счет этого повышается растворимость органических веществ, что приводит к тому, что они при осаждении белка в изоэлектрической точке в основном остаются в водном растворе. Также в случае использования спирта достаточно добавлять его на второй стадии экстракции, причем нужно обращать внимание на то, что желательная концентрация спирта после рециркуляции декантата второй сепарации на первую стадию экстракции должна составлять не менее 5%.

Декантат первой стадии сепарации в случае нового способа получают само по себе известным образом с помощью неорганических или органических кислот в зависимой от продукта изоэлектрической точке белка, которая обычно находится в области значений рН от 4,2 до 4,6. При этом белок осаждается и его отделение можно осуществлять с помощью известных технологий сепарации, в особенности с помощью декантаторов. Таким образом полученный творожистый белковый изолят перед его высушиванием можно промывать и нейтрализовать для установления желательного значения рН конечного продукта.

Последовательно проводимая щелочная экстракция при использовании протеаз с рециркуляцией вспомогательных для экстракции средств неожиданно приводит к качеству белка, которое отчетливо выше такового продуктов, получаемых известными способами. Это относится как к выходу, так и к сенсорике получаемых продуктов. Одновременно, в случае нового способа, его можно осуществлять с расходом воды, составляющим примерно 8 л свежей воды на кг используемого сырья на всех стадиях способа. Из них должно быть только примерно 25% горячей воды. Отработанная вода составляет примерно 5 л на используемый кг сырья.

За счет относительно больших концентраций твердого вещества в обрабатываемых суспензиях в случае нового способа, несмотря на более высокие значения рН, не расходуется повышенных количеств кислоты и/или щелочи по сравнению с классическими способами экстракции. Напротив, по сравнению с современными, коммерчески используемыми способами получения белковых изолятов уменьшают количества кислоты и щелочи и высаливания на величину вплоть до 20%.

Получаемые с помощью предлагаемого согласно изобретению способа белковые изоляты имеют обычно содержание белка 90-94% в расчете на сухое вещество. В зависимости от типа осуществляемой сушки содержание остаточной влаги может составлять 4-8%. Выход, в расчете на содержание белка в исходном веществе, обычно составляет 80-87%. Вкус получаемых продуктов в случае выбранного способа является нейтральным.

Возможный, зависимый от исходного вещества собственный вкус может устраняться сразу. Повреждения белка очень незначительные, о чем свидетельствует очень незначительное содержание лизин-аланина, составляющее только 50-150 ч/млн, в расчете на белок в полученном белковом изоляте.

Согласно представленной на прилагаемом чертеже технологической схеме предлагаемого способа, в которой указаны предпочтительные значения рН и температурные зоны, исходят из мезги, получаемой путем смешения используемого в тонкоизмельченной форме, содержащего белок исходного вещества с декантатом стадии сепарации. В правой части чертежа представлены три стадии щелочной/ферментативной экстракции согласно предпочтительному варианту осуществления нового способа. В левой части представлена обработка надосадочной жидкости 1 сепарации 1, то есть сепарации после первой стадии экстракции. Эта надосадочная жидкость содержит белок прежде всего в растворенной форме. Нерастворившиеся вещества, присутствующие в надосадочной жидкости, удаляют путем осветления. Затем осуществляют осаждение белков в изоэлектрической точке. Преципитат от этого осаждения отделяют путем сепарации и снова суспендируют в воде. За счет последующей тепловой инактивации инактивируют ферменты, имеющиеся после экстракции белка. При последующей сепарации получают надосадочную жидкость, которую направляют в мезгу и которая не имеет более практически никакой ферментативной активности. Последовательно осуществляемые нейтрализация и высушивание приводят в получению желательного белкового изолята.

Ниже изобретение поясняется и описывается с помощью примеров:

1) Соевый белковый изолят

"Слегка поджаренный" соевый шрот сначала перерабатывают до получения белкового концентрата. Белковый концентрат, который имеет размер частиц примерно 50 мкм, обрабатывают с помощью нагретой до температуры 50°С воды, так что концентрация твердого вещества в образовавшейся суспензии составляет 12,5%. Это соответствует мезге, указанной на чертеже. Затем эту суспензию объединяют вместе с возвратом из подключенной второй стадии экстракции. После этого с помощью 25%-ного раствора гидроксида натрия устанавливают значение рН, равное 9. Соотношение фермент/белок составляет 1:5500. Суспензию перемешивают в течение 15 минут при температуре 45°С. После этого суспензию подвергают разделению в сепараторе при 6000×g, где преобладает вакуум, составляющий 300 мбар абсолютного давления. Надосадочная жидкость из сепаратора содержит уже растворенный белок, осадок содержит твердое вещество с еще связанным белком.

Осадок снова обрабатывают водой, так что устанавливается содержание твердого вещества 8%. Вода может быть холодной. Таким образом полученную суспензию гомогенизируют за счет падения давления 80 бар и объединяют с осветленной надосадочной жидкостью третьей стадии экстракции. Установившаяся температура составляет 38°С, соотношение фермент/белок составляет 1:1250. Затем значение рН снова устанавливают равным 11,2 с помощью 25%-ного раствора гидроксида натрия и перемешивают в течение 15 минут. После этого осуществляют вторую сепарацию с помощью сепаратора под вакуумом. Надосадочную жидкость из этого сепаратора направляют на первую стадию экстракции. Выгрузку твердых веществ, то есть осадок, диспергируют в холодной воде и устанавливают содержание твердых веществ, равное 6%. Температура должна составлять ниже 40°С. К этой суспензии теперь добавляют протеазы с общей активностью 6 Anson-единиц/кг белка, что соответствует соотношению фермент/белок 1:400. Эта суспензия реагирует в течение 5 минут и затем ее центрифугируют в третьем процессе сепарации в сепататоре под вакуумом. Надосадочную жидкость направляют на вторую стадию экстракции. Выгрузку твердых веществ, соответственно нижний сход, можно нейтрализовать и использовать, например, в качестве агента набухания содержащего волокна. В описанном способе его далее не применяют.

В надосадочной жидкости с первой стадии экстракции устанавливают значение рН, равное 4,3, с помощью 15%-ной соляной килоты и его центрифугируют с помощью сепаратора при давлении 300 мбар. Температура притока в сепаратор составляет 45°С. Выгрузка твердых веществ содержит 28% сухого вещества, то есть осадок сепаратора содержит белок, надосадочная жидкость содержит примеси и растворимый белок, который направляют в отработанную воду. Твердое вещество теперь разбавляют водой высшего качества до концентрации 15% и кратковременно нагревают при температуре 110°С. Таким образом твердое вещество промывают и инактивируют содержащиеся в нем ферменты. После охлаждения до температуры 50°С отделяют твердое вещество от добавленной воды в обычном декантаторе примерно при 4000×g. Надосадочную жидкость этой сепарации используют путем смешения с мезгой для первой стадии экстракции. Осадок снова разбавляют водой до содержания сухого вещества 15%, нейтрализуют с помощью раствора гидроксида натрия и затем подвергают распылительной сушке.

2) Картофельный белковый изолят

Образующиеся при получении крахмала содержащие белок побочные продукты сначала размалывают до размера частиц 50 мкм и затем обрабатывают нагретой до температуры 50°С водой таким образом, что получают суспензию с содержанием сухого вещества 15%. К этой суспензии добавляют протеазу с активностью 5 Anson-единиц/кг белка. После перемешивания в течение 5 минут устанавливают значение рН, равное 8,5, и затем перемешивают в течение следующих 10 минут. После этого устанавливают значение рН суспензии, равное 4,2, с помощью соляной кислоты, и суспензию центрифугируют в декантаторе при 4000×g. Надосадочную жидкость отбрасывают, твердое вещество снова обрабатывают нагретой до температуры 50°С водой и затем обрабатывают согласно представленным на чертеже стадиям способа. Для этого к находящемуся в воде твердому веществу добавляют надосадочную жидкость второй стадии экстракции. Соотношение фермент/белок после этого составляет 1:6500. Концентрация твердого вещества составляет 10%. Значение рН устанавливают равным 9 и затем перемешивают в течение 15 минут. При этом температура должна составлять 45°С. После этого осуществляют центрифугирование в сепараторе при 6000×g. При этом надосадочная жидкость содержит растворенный белок. Осадок, то есть выгружаемое твердое вещество с содержанием сухого вещества 26%, обрабатывают холодной водой и объединяют с надосадочной жидкостью нижеследующей третьей стадии экстракции. Температура при этом устанавливается равной 38°С. Значение рН повышают до 11,2 с помощью 25%-ного раствора гидроксида натрия. Соотношение фермент/белок составляет 1:1600. Эту суспензию перемешивают в течение 15 минут, причем спустя 10 минут добавляют 20 мкл 25%-ного пероксида водорода на кг твердого вещества. После перемешивания в течение 15 минут суспензию гомогенизируют за счет падения давления 80 бар и затем разделяют во втором сепараторе при пониженном давлении 300 мбар. Надосадочную жидкость направляют на первую стадию экстракции; осадок с твердым веществом снова обрабатывают холодной водой. Температура диспергированного твердого вещества устанавливается 32°С. Значение рН достигает 10,5. Добавляют протеазы с активностью 4 Anson-единицы/кг белка, что приводит к соотношению фермент/белок 1:500. Спустя 5 минут эту дисперсию третий раз снова центрифугируют в сепараторе при вакууме 300 мбар абсолютного давления. Надосадочную жидкость этой сепарации направляют на вторую стадию экстракции. Выгрузку твердого вещества, то есть осадок, отбрасывают.

В надосадочной жидкости первой стадии экстракции с помощью соляной кислоты устанавливают значение рН, равное 4,3. Затем центрифугируют с помощью сепаратора при пониженном давлении 300 мбар абсолютного давления. Надосадочную жидкость из сепаратора отбрасывают. В осадке, который является творожистым, устанавливают содержание твердого вещества 15% с помощью деминерализованной воды. Эту дисперсию кратковременно нагревают при температуре 110°С, затем охлаждают до температуры 50°С и центрифугируют в декантаторе при 4000×g. Образующийся при этом декантат, соответственно надосадочная жидкость, служит для получения мезги из муки исходного вещества для первой стадии экстракции. Выгрузку твердого вещества, то есть осадок, нейтрализуют и высушивают.

При получении картофельного белкового изолята вместо пероксида водорода также можно использовать этанол для экстракции нежелательных органических примесей.

Формула изобретения

1. Способ получения белкового изолята из содержащего белок вещества, при этом вещество размалывают до муки, муку суспендируют в водном растворе, белок из муки переводят в раствор путем использования, по меньшей мере, одной вводимой противотоком протеазы, белок при использовании неорганической кислоты осаждают из раствора и нейтрализуют, отличающийся тем, что белок переводят в раствор путем, по меньшей мере, двухстадийной обработки с помощью, по меньшей мере, одной протеазы, значений рН выше, чем 8, и нагревания при температуре 30-60°С, причем муку на первой стадии обрабатывают при более низкой концентрации, по меньшей мере, одной протеазы, в расчете на массу белка, более низком значении рН и более высокой температуре, чем на второй стадии; после первой стадии от содержащей муку фракции отделяют первую надосадочную жидкость, из которой осаждают белок, и после второй стадии от содержащей муку фракции отделяют вторую надосадочную жидкость, которую возвращают на первую стадию, при этом, по меньшей мере, одной протеазой является серин-, цистеин-, аспарагин- или металлопротеаза.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что содержащее белок вещество размалывают до муки со средним размером частиц от 30 до 100 мкм.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что до начала второй стадии муку гомогенизируют в растворе при подводе энергии.

4. Способ по пп.1, 2 или 3, отличающийся тем, что белок переводят в раствор путем трехстадийной обработки с помощью, по меньшей мере, одной протеазы, значений рН выше, чем 8, и нагревания при температуре 30-60°С, причем на третьей стадии муку обрабатывают при более высокой концентрации, по меньшей мере, одной протеазы, в расчете на массу белка, и при более низкой температуре, чем на второй стадии, и после третьей стадии от содержащей муку фракции отделяют третью надосадочную жидкость, которую возвращают на вторую стадию.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одну протеазу добавляют в раствор на третьей стадии.

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одну протеазу в белке инактивируют тепловой обработкой.

7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что белок из муки переводят в раствор при использовании, по меньшей мере, одного спирта и/или пероксида водорода.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что муку перед внесением в раствор белка подвергают предварительной обработке при использовании щелочей, кислот и/или ферментов.

9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одну из надосадочных жидкостей отделяют от содержащей муку фракции тем, что суспендированную в растворе муку центрифугируют под вакуумом или декантируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1