Производные пурина, обладающие противовирусной активностью

 

Изобретение относится к производным пурина, обладающим противовирусной активностью в отношении цитомегаловируса человека и вируса иммунодефицита человека типа 1, общей формулы:

где n = 0 – 4; m = 0 – 3; R¹ = Н, ОН или NH₂; R² = ОН, NH₂, ацетиламино или бензоиламино; R³ = Н или низший алкил C₁–С₄; R⁴ = Н, низший алкил C₁-С₄ или фенил; Х = СН₂, О, S, NH или С(O)O; Y = СН₂, СН=СН, С(O), О или ординарная связь; Ar = фенил, пиридил, нафтил или замещенный фенил формулы

где независимо R⁵–R⁹ = алкил С₁–C₈, циклоалкил C₅–С₆, 1-адамантил, аллил, фенил, бензил, F, Cl, Br, J, трифторметил, алкокси C₁–С₅, фенокси, бензилокси, бензоилокси, циано, карбокси, ацетил или нитро, противовирусное действие наиболее активных веществ в отношении цитомегаловируса человека in vitro проявляется в концентрациях 0,01-0,0005 μМ и характеризуется селективностью 1-400 тысяч. 5 табл.

Изобретение относится к области медицины и химии азотсодержащих гетероциклических соединений, в частности к новым производным пурина общей формулы

где n=0-4;

m=0-3;

R¹=Н, ОН или NH₂;

R²=ОН, NH₂, ацетиламино или бензоиламино;

R³=Н или низший алкил C₁-С₄;

R⁴=Н, низший алкил С₁-С₄ или фенил;

Х=СН₂, О, S, NH или С(O)O;

Y=СН₂, СН=СН, С(O), О или ординарная связь;

Аr = фенил, пиридил, нафтил или замещенный фенил формулы

где независимо R⁵-R⁹ = алкил C₁-C₈, циклоалкил С₅-С₆, 1-адамантил, аллил, фенил, бензил, F, Cl, Br, J, трифторметил, алкокси C₁-С₅, фенокси, бензилокси, бензоилокси, циано, карбокси, ацетил или нитро, которые обладают противовирусной активностью, в том числе в отношении цитомегаловируса человека и вируса иммунодефицита человека типа 1, и могут найти применение в медицине в качестве лекарственных веществ в лекарственных средствах, применяющихся в комплексной терапии СПИД и оппортунистических вирусных инфекций.

Цитомегаловирусы (ЦМВ), или вирусы герпеса человека типа 5, чрезвычайно широко распространены в человеческой популяции. В промышленно развитых странах мира, прежде всего в США и Европе, большинство населения инфицировано этим вирусом. По статистике, свыше 50% сельского и до 90% городского населения в возрасте до 40 лет являются вирусоносителями [Stevens J.G. Human herpesviruses: a consideration of the latent state // Microbiol. Rev. - 1989. - Vol. 53. - No. 3. - P. 318-332]. У людей с нормальным иммунным статусом ЦMB инфекция может протекать бессимптомно и находится в организме в латентном состоянии. При ослаблении иммунитета ЦМВ проявляются в виде мононуклеоза или в виде генерализованной формы, при которой могут поражаться практически все органы (печень, почки, надпочечники, селезенка, поджелудочная железа, пищевод, кишечник, легкие, головной мозг, периферическая нервная система). По статистике ВОЗ, среди других вирусных заболеваний генерализованная ЦМВ инфекция является причиной наибольшего количества смертей в мире после гриппа и ОРЗ. Достаточно часто ЦМВ поражают мочеполовую систему, особенно у женщин.

При серьезном ущербе иммунной системы в организме развивается угрожающая жизни ЦМВ манифестация. Лучевая и химиотерапия при онкологических заболеваниях, применение больших доз кортикостероидов, иммуносупрессивная терапия при пересадке органов и, наконец, СПИД создают чрезвычайно благоприятные условия для развития ЦМВ. При трансплантации органов ЦМВ инфекция возникает в целом в 70% случаев, сопровождается бактериальной инфекцией с отторжением имплантанта и характеризуется высокой смертностью. При пересадке костного мозга ЦМВ инфекция развивается приблизительно в 15% случаев, половина из которых заканчивается летальным исходом. ЦМВ гепатит возникает в 55% случаев пересадки печени и также характеризуется высокой летальностью [Rubin R.H. Impact of cytomegalovirus infection on organ transplantant recipients // Rev. Infect. Dis. - 1990. - Vol. 12. - P. 754-766].

Наибольшую опасность ЦМВ инфекция представляет для ВИЧ-инфицированных. Смертность от ЦМВ пневмонии составляет в США у ВИЧ-инфицированных до 90%. Около 70% больных СПИД страдают ЦМВ ретинитом, который в 20% случаев приводит к полной потере зрения [Kestelyn P.O., Cunningham Е.Т. HIV/AIDS and blindness // Bull. World Health Org. - 2001. - Vol. 79. - N 3. P. - 208-213]. Кроме того, очень часто ЦМВ инфекция проявляется у серопозитивных к ВИЧ пациентов в виде колитов (длительная диарея, лихорадка, потеря веса и аппетита) и энцефалитов [Peters B.S., Beck E.J., Anderson S., Coleman D., Coker R., Main J., Migdal C., Harris J.R.W., Pinching A.J. Cytomegalovirus infection in AIDS. Patterns of disease, response to therapy and trends in survival // J. Infect. - 1991. - Vol. 23. - P. 129-137].

Наконец, очень опасна ЦМВ инфекция, если она возникает у матери впервые в жизни во время беременности, особенно в течение первых 12 недель. Инфицирование плода приводит в этом случае к выкидышам, врожденным уродствам, анацефалии, гидроцефалии. ЦМВ являются частой причиной женского бесплодия [Agut H. Le cytomegalovirus en pediatrie // Sem. Hop. Paris. - 1988. - Vol.64. - No. 16. - P. 1103-1109].

Современный арсенал анти-ЦМВ лекарственных средств включает три основных препарата: фосфономуравьиную кислоту (фоскарнет) [Masur H., Lane Н.С. A randomized, controlled trial of foscamet in the treatment of cytomegalovirus retinitis in patient with AIDS // Ann. Intern. Med. - 1991. - Vol. 115. - P. 665-673], ганцикловир [Shepp D.H., Dandliker P.S., de Miranda P., Burnette T.C., Cederberg D.M., Kirk L.E., Meyers J.D. Activity of 9-[[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethoxy]methyl]guanine in the treatment of cytomegalovirus pneumonia // Ann. Intern. Med. - 1985. - Vol. 103. - No. 3. - P. 368-373] и цидофовир [Snoeck R., Sakuma Т., De Clercq E., Rosenberg I., Holy A. (S)-1-(3-hydroxy-2-phosphonyl-methoxypropyl)cytosine, a potent and selective inhibitor of human cytomegalovirus replication // Antimicrob. Agents Chemother. - 1988. - Vol. 32. - P. 1839-1844]. Указанные лекарственные средства при применении per os имеют низкую биодоступность (не более 5-6% для ганцикловира и цидофовира), по причине чего они применяются в основном внутривенно. Необходимость внутривенного введения этих препаратов 1 или 2 раза в день, очень большие дозы (90-120 мг/кг для фоскарнета) и серьезные побочные эффекты значительно понижают качество жизни больных. Кроме того, и ганцикловир, и цидофовир имеют очень высокую стоимость.

В 2001 г. был зарегистрирован новый, более эффективный анти-ЦМВ препарат, предложенный для лечения ЦМВ ретинита, - валганцикловир, являющийся пролекарственной формой ганцикловира, его эфиром с L-валином [Curran M., Noble S. Valganciclovir // Drugs. - 2001. - Vol. 61. - N 8. - Р. 1145-1150; Cocohoba J.M., McNicholl I.R. Valganciclovir: an advance in cytomegalovirus therapeutics // Ann. Pharmacother. - 2002. - Vol. 36. - N 6. - P. 1075-1079]. Препарат более эффективен, чем ганцикловир, при приеме внутрь, и его можно принимать per os всего 2 раза в сутки. Однако валганцикловир сохраняет все другие недостатки, свойственные ганцикловиру, - достаточно низкую анти-ЦМВ активность, высокую токсичность и выраженную способность угнетать иммунитет.

Известно, что многие производные пурина, в том числе нуклеозидные и ненуклеозидные производные пуриновых оснований аденина и гуанина, обладают выраженной противовирусной активностью. Ациклический аналог гуанозина 9-(2-гидроксиэтоксиметил)гуанин (ацикловир) стал первым эффективным антигерпетическим противовирусным средством пуриновой природы, внедренным в клиническую практику [Schaeffer H.J., Beauchamp L., De Miranda P., Elion G.B., Bauer D.J., Collins P. 9-(2-Hydroxyethoxymethyl)guanine activity against viruses of the herpes group // Nature. - 1978. - Vol. 272. - P. 583-585]. Ряд производных и аналогов ацикловира пуриновой природы также демонстрируют выраженную противогерпетическую активность [Пат. США №4294831 (1981), МКИ С 07 D 473/18 / Schaeffer H.J. Purine derivatives; Пат. США №4323573 (1982), МКИ А 61 К 31/52 / Schaeffer H.J. Adenine derivatives].

Близкими структурными аналогами ацикловира являются 9-[(1,3-дигидрокси-2-пропокси)метил] гуанин (ганцикловир), значительно превосходящий ацикловир по спектру противовирусной активности [Martin J.C., Dvorak C.A., Smee D.F., Matthews T.R., Verheyden J.P.H. 9-[(l,3-Dihydroxy-2-propoxy)methyl]-guanine: a new potent and selective antiherpes agent // J. Med. Chem. - 1983. - Vol. 26. - No. 5. - P. 759-761], и его разнообразные N-алкилпроизводные, также активные в отношении герпесвирусов [Пат. США №4579849 (1986), МКИ С 07 D 473/18, А 61 К 31/52 / MacCoss M., Tolman R.L., Strelitz R.A. N-Alkylguanine acyclonucleosides as antiviral agents].

Описаны изомерные аналоги ацикловира и ганцикловира, обладающие противовирусной активностью и имеющие принципиально иное строение ациклической цепи, соединенной с положением N⁹ пуринового цикла непосредственно через атом кислорода [Пат. США №4965270 (1990), МКИ С 07 D 473/18, А 61 К 31/52 / Hamden M.R., Wyatt P.G., Bailey S. Purine derivatives].

Среди производных аденина, демонстрирующих выраженное антивирусное действие, известен 9-(S)-(2,3-дигидроксипропил)аденин, обладающий широким спектром противовирусной активности [De Clercq E., Descamps J., De Somer P., Holy A. (S)-9-(2,3-Dihydroxypropyl)adenine: an aliphatic nucleoside analog with broad-spectrum antiviral activity // Science. - 1978. - Vol. 200. - P. 563], а также ациклические фосфонатные аналоги адениновых нуклеотидов [Balzarini J., De Clercq E. 5-Phosphoribosyl 1-pyrophosphate synthetase converts the acyclic nucleoside phosphonates 9-(3-hydroxy-2-phosphonylmethoxypropyl)adenine and 9-(2-phosphonylmethoxyethyl)adenine directly to their antivirally active diphosphate derivatives // J. Biol. Chem. - 1991. - Vol. 266. - No. 4341. - P. 8686-8689].

Однако все описанные выше производные пурина, за исключением ганцикловира, не обладают уровнем анти-ЦМВ действия, достаточным для создания на их основе лекарственных средств для лечения ЦМВ инфекции.

Среди активных анти-ЦМВ агентов, имеющих иную, не цуриновую химическую природу, следует выделить производные 1,6-нафтиридина, проявляющие ингибиторные свойства в отношении ЦМВ in vitro в минимальной концентрации 0,0004 μг/мл и имеющие индекс селективности, достигающий 7500 [Chan L., Jin H., Stefanac Т., Lavallee J.-F., Falardeau G., Wang W., Bedard J., May S., Yuen L. Discovery of 1,6-naphthyridines as a novel class of potent and selective human cytomegalovirus inhibitors // J. Med. Chem. - 1999. - Vol. 42. - No. 16. - P. 3023-3025], и производные индолокарбазола, имеющие почти такой же уровень анти-ЦМВ активности in vitro [Slater M.J., Baxter R., Bonser R.W., Cockerill S., Gohil K., Parry N., Robinson J.E., Randall R., Yeates C., Snowden W., Walters A. Synthesis of N-alkyi substituted indolocarbazoles as potent inhibitors of human cytomegalovirus replication//Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2001. - Vol. 11. - N 15. - P. 1993-1995]. Существенным недостатком соединений этих классов является сложная химическая структура, низкая растворимость в воде и выраженная способность угнетать некоторые клеточные ферменты, в частности протеин-киназу, что значительно понижает потенциал этих соединений каквероятных анти-ЦМВ лекарственных средств.

Наиболее близкими по химическому строению к предлагаемым соединениям являются их известные пиримидиновые аналоги - производные урацила, тимина, цитозина и их 5-замещенных производных [Новиков М.С., Озеров А.А., Брель А.К., Солодунова Г.Н., Озерова Т.П. Синтез ациклических аналогов пиримидиновых нуклеозидов с ароматическим ядром в боковой цепи // Химия гетероциклич. соед. - 1996. - Вып.3. - С. 380-385; Озеров А.А., Новиков М.С., Брель А.К., Солодунова Г.Н. Синтез 1-(арилоксиалкил)-5-(ариламино)-урацилов // Химия гетероциклич. соед. - 1998. - Вып.5. - С. 691-697]. Однако все эти соединения не проявили заметной противовирусной активности.

Целью предлагаемого изобретения является создание новых, высокоэффективных, селективных и малотоксичных антивирусных агентов для лечения ЦМВ и других вирусных инфекций.

Сущность изобретения заключается в синтезе новых производных пурина, в том числе аденина, гуанина, гипоксантина и 2,6-диаминопурина, содержащих в качестве заместителя незамещенное или замещенное ароматическое ядро (фенил, нафтил или пиридил), соединенное с атомом азота N⁹ пуриновой гетероциклической системы ациклической цепью, состоящей из 1-5 атомов углерода, которая может дополнительно включать атомы кислорода, серы или азота, и отвечающих указанной выше общей формуле.

Синтез новых соединений был осуществлен путем алкилирования соответствующего пуринового основания (аденина, гуанина, гипоксантина или 2,6-диаминопурина) тозилатами ω-арилалканолов или ω-арилалкилбромидами в среде безводного диметилформамида в присутствии безводного карбоната калия или гидрида натрия по схеме:

где n=0-4;

m=0-3;

R¹=Н, ОН или NH₂;

R²=ОН, NH₂, ацетиламино или бензоиламино;

R³=Н или низший алкил C₁-С₄;

R⁴=Н, низший алкил C₁-С₄ или фенил;

Х=СН₂, О, S, NH или С(O)O;

Y=СН₂, СН=СН, С(O), О или ординарная связь;

Аr = фенил, пиридил, нафтил или замещенный фенил формулы

где независимо R⁵-R⁹ = алкил C₁-C₈, циклоалкил С₅-С₆, 1-адамантил, аллил, фенил, бензил, F, Cl, Br, J, трифторметил, алкокси C₁-С₅, фенокси, бензилокси, бензоилокси, циано, карбокси, ацетил или нитро.

Химическое строение, выход и физико-химические свойства синтезированных соединений 1-130 представлены в таблицах 1-3. Структура и элементный состав соединений доказаны методами ПМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, чистота и индивидуальность - методом тонкослойной хроматографии.

Пример 1. 9-[2-(4-Изопропилфенокси)этил]аденин (11, VMA-99-82).

2-(4-Изопропилфенокси)этанол.

К раствору 40,0 г (0,294 моль) 4-изопропилфенола в 200 мл воды, содержащей 30,0 г (0,535 моль) КОН, при температуре 75-80°С и интенсивном перемешивании в течение 30 мин добавляют 20,6 мл (0,307 моль) 2-хлорэтанола. Реакционную массу перемешивают при той же температуре еще 2 ч и оставляют на ночь при комнатной температуре. Органическую фазу отделяют, водную фазу экстрагируют хлороформом (4·25 мл), органическую фазу и экстракты объединяют, сушат Na₂SO₄, фильтруют и упаривают в вакууме водоструйного насоса на кипящей водяной бане. Остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию, кипящую при 157-162°С (3 мм рт.ст.). Получают 39,0 г бесцветной вязкой жидкости, n²⁰_D 1,5246, выход 74%.

1-(4-Изопропилфенокси)-2-(n-толуолсульфонилокси)этан.

К раствору 30,0 г (0,166 моль) 2-(4-изопропилфенокси)этанола в 150 мл безводного дихлорметана и 40 мл пиридина при интенсивном перемешивании и охлаждении до 0°С добавляют порциями в течение 20 мин 38,0 г (0,199 моль) n-толуолсульфохлорида с такой скоростью, чтобы температура реакционной смеси не поднималась выше 5°С. После этого реакционную массу перемешивают при той же температуре еще 2 ч и оставляют на ночь при комнатной температуре. Реакционную массу последовательно промывают 2%-ным водным раствором соляной кислоты (2·100 мл), водой (2·80 мл), насыщенным раствором соды (2·100 мл) и вновь водой до нейтральной реакции, сушат Na₂SO₄, фильтруют и упаривают в вакууме водоструйного насоса. Остаток дополнительно вакуумируют при 40-50°С (5 мм рт.ст.) в течение 1 ч. Получают 47,4 г вязкого сиропообразного продукта светло-желтого цвета, выход 85%.

1-Бром-2-(4-изопропилфенокси)этан. Метод А.

К раствору 14,0 г (0,078 моль) 2-(4-изопропилфенокси)этанола в 100 мл безводного хлороформа и 10 мл пиридина при интенсивном перемешивании и охлаждении до -10°С прибавляют по каплям в течение 10 мин 2,7 мл (0,029 моль) трехбромистого фосфора. После этого реакционную массу перемешивают при 0°С еще 2 ч, затем 2 ч при комнатной температуре и оставляют на ночь. Реакционную массу выливают в 250 мл холодной воды, органический слой промывают насыщенным раствором соды (2·100 мл) и водой до нейтральной реакции, сушат Na₂SO₄, фильтруют и упаривают в вакууме водоструйного насоса. Остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию, кипящую при 158-162°С (3 мм рт.ст.). Получают 10,2 г бесцветной прозрачной жидкости, n²⁰_D 1,5112, выход 54%.

1-Бром-2-(4-изопропилфенокси)этан. Метод Б.

Смесь 15,0 г (0,110 моль) 4-изопропилфенола, 20,0 мл (0,232 моль) 1,2-дибромэтана и раствора 6,2 г (0,110 моль) КОН в 10 мл воды кипятят в течение 8 ч до нейтральной реакции. Реакционную массу разбавляют 100 мл хлороформа, органический слой промывают 3%-ным раствором NaOH (100 мл) и водой (2·100 мл) до нейтральной реакции, сушат Na₂SO₄, фильтруют, растворитель и избыток 1,2-дибромэтана отгоняют в вакууме водоструйного насоса на кипящей водяной бане. Остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию, кипящую при 158-163°С (3 мм рт.ст.). Получают 13,5 г бесцветной прозрачной жидкости, n²⁰_D 1,5118, выход 51%.

9-[2-(4-Изопропилфенокси)этил]аденин (11, VMA-99-82). Метод А.

Суспензию 15,0 г (0,111 моль) аденина и 17,3 г (0,125 моль) свежепрокаленного карбоната калия в 100 мл ДМФА перемешивают при температуре 80-85°С в течение 1,5 ч, добавляют раствор 37,0 г (0,111 моль) 1-(4-изопропилфенокси)-2-(n-толуолсульфонилокси)этана в 50 мл ДМФА и полученную смесь перемешивают при той же температуре еще 8 ч. Реакционную массу оставляют на ночь при комнатной температуре, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме, остаток обрабатывают 200 мл холодной воды и охлаждают при 0-5°С в течение суток. Закристаллизовавшийся остаток отфильтровывают и после сушки на воздухе перекристаллизовывают из смеси 100 мл ДМФА и 10 мл воды. Получают 22,1 г VMA-99-82 в виде белого мелкокристаллического продукта с выходом 67%. Rf (метиленхлорид - метанол, 10 : 1) 0,64. Т. пл. 231-233°С.

Масс-спектр: M⁺ 297 (6%), 282 (2%), 254 (2%), 178 (9%), 163 (81%), 149 (84%), 134 (100%), 119 (30%), 107 (50%), 105 (47%), 92 (99%), 91 (80%).

9-[2-(4-Изопропилфенокси)этил]аденин (11, VMA-99-82). Метод Б.

Суспензию 5,0 г (0,037 моль) аденина и 6,3 г (0,045 моль) свежепрокаленного карбоната калия в 60 мл ДМФА перемешивают при температуре 105-110°С в течение 1,5 ч, добавляют раствор 9,0 г (0,037 моль) 1-бром-2-(4-изопропилфенокси)этана в 20 мл ДМФА и полученную смесь перемешивают при той же температуре еще 2 ч. Выделение и очистка аналогична описанному выше. Получают 6,1 г VMA-99-82 в виде белого мелкокристаллического продукта, выход 55%.

Пример 2. 9-[2-(3,5-Диметилбензилокси)этил]аденин (61, VMA-99-56).

2-(3,5-Диметилбензилокси)этанол.

К раствору 210 мл (1,509 моль) мезитилена и 100 мл ССl₄ при кипячении и облучении светом добавляют в течение 30 мин раствор 14,0 мл (0,272 моль) брома в 25 мл ССl₄. Реакционную массу упаривают в вакууме водоструйного насоса на водяной бане, к остатку прибавляют раствор 16,0 г (0,285 моль) КОН в 100 мл (1,793 моль) этиленгликоля и полученную смесь перемешивают на водяной бане при температуре 80-90°С в течение 10 ч. Реакционную массу разбавляют 250 мл холодной воды, органическую фазу отделяют, водную фазу экстрагируют мезитиленом (3·30 мл), органическую фазу и экстракты объединяют, промывают солевым раствором (100 мл), сушат Na₂SO₄, фильтруют и упаривают в вакууме водоструйного насоса. Остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию, кипящую при 168-172°С (3 мм рт.ст.). Получают 27,3 г бесцветной жидкости, n²⁰_D 1,5227, выход 56%.

1-(3,5-Диметилбензилокси)-2-(n-толуолсульфонилокси)этан.

К раствору 51,0 г (0,283 моль) 2-(3,5-диметилбензилокси)этанола в 250 мл безводного хлороформа и 80 мл пиридина при интенсивном перемешивании и охлаждении до 0°С добавляют порциями в течение 30 мин 64,7 г (0,339 моль) n-толуолсульфохлорида с такой скоростью, чтобы температура реакционной смеси не поднималась выше 5°С. После этого реакционную массу перемешивают при той же температуре еще 2 ч и оставляют на ночь при комнатной температуре. Затем реакционную массу последовательно промывают 2%-ным водным раствором соляной кислоты (2·150 мл), водой (2·100 мл), насыщенным раствором соды (2·100 мл) и вновь водой до нейтральной реакции, сушат Na₂SO₄, фильтруют и упаривают в вакууме водоструйного насоса. Остаток растворителя удаляют в вакууме при 40-50°С (5 мм рт.ст.) в течение 1 ч. Получают 77,6 г вязкого сиропообразного продукта светло-желтого цвета, выход 82%.

1-Бром-2-(3,5-диметилбензилокси)этан.

К раствору 18,75 г (0,104 моль) 2-(3,5-диметилбензилокси)этанола в 100 мл безводного хлороформа и 10 мл пиридина при интенсивном перемешивании и охлаждении до 10°С добавляют в течение 10 мин 3,6 мл (0,0379 моль) трехбромистого фосфора. После этого реакционную массу перемешивают при 0°С еще 1 ч, 2 ч при комнатной температуре и оставляют на ночь. Затем реакционную массу выливают в 300 мл холодной воды, органический слой промывают насыщенным раствором соды (2·100 мл) и водой до нейтральной реакции, сушат Na₂SO₄, фильтруют и упаривают в вакууме водоструйного насоса. Остаток перегоняют в вакууме, собирая фракцию, кипящую при 167-173°С (3 мм рт.ст.). Получают 12,9 г бесцветной прозрачной жидкости, n²⁰_D 1,5391, выход 51%.

9-[2-(3,5-Диметилбензилокси)этил]аденин (61, VMA-99-56). Метод А.

Суспензию 23,0 г (0,170 моль) аденина и 27,0 г (0,195 моль) свежепрокаленного карбоната калия в 250 мл ДМФА перемешивают при температуре 80-85°С в течение 1,5 ч, добавляют раствор 60,0 г (0,176 моль) 1-(3,5-диметилбензилокси)-2-(n-толуолсульфонилокси)этана в 50 мл ДМФА и полученную смесь перемешивают при той же температуре еще 8 ч. Реакционную массу оставляют на ночь при комнатной температуре, фильтруют, твердый осадок обрабатывают 0,5 л холодной воды, фильтруют и после сушки на воздухе получают 17,8 г белого кристаллического продукта-сырца. Фильтрат первичной реакционной массы упаривают в вакууме, к остатку добавляют 0,5 л холодной воды, перемешивают и охлаждают при 0-5°С в течение суток. Закристаллизовавшийся остаток отфильтровывают и после сушки на воздухе дополнительно получают 22,2 г целевого продукта-сырца. Обе партии продукта объединяют и перекристаллизовывают из смеси 100 мл ДМФА и 15 мл воды. Получают 29,6 г белого мелкокристаллического продукта с выходом 59%. R_f (метиленхлорид - метанол, 10:1) 0,60. Т.пл. 180-183°С.

Масс-спектр: M⁺ 297 (3%), 178 (14%), 163 (31%), 149 (22%), 134 (100%), 119 (67%), 105 (47%), 92 (64%), 91 (46%).

9-[2-(3,5-Диметилбензилокси)этил]аденин (61, VMA-99-56). Метод Б.

Суспензию 5,0 г (0,037 моль) аденина и 6,3 г (0,045 моль) свежепрокаленного карбоната калия в 60 мл ДМФА перемешивают при температуре 105-110°С в течение 1,5 ч, добавляют раствор 9,0 г (0,037 моль) 1-бром-2-(3,5-диметилбензилокси)этана в 20 мл ДМФА и полученную смесь перемешивают при той же температуре еще 2 ч. Выделение и очистка аналогична описанному выше. Получают 5,6 г VMA-99-56 в виде белого мелкокристаллического продукта, выход 51%.

Противовирусная активность in vitro синтезированных соединений 1-130 в отношении ЦМВ, ВИЧ-1 и ряда других ДНК- и РНК-содержащих вирусов была исследована в Rega Institute for Medical Research (Католический университет, Лювен, Бельгия). Результаты скрининга веществ в отношении ЦМВ и ВИЧ-1 представлены в таблице 4.

Анти-ЦМВ активность.

Производные 9-(2-феноксиэтил)аденина оказались исключительно активными ингибиторами репликации ЦМВ в культуре клеток HEL. В частности, соединения 11, 13, 27, 30, 36, 37, 43 и 54 ингибировали ЦМВ в концентрациях, равных или значительно ниже 0,01 μМ, хотя в случае некоторых веществ, например 11, 37, 43, не было достигнуто полного подавления вирусной репликации. Для ряда производных 9-(2-феноксиэтил)аденина была достигнута селективность противовирусного действия (отношение СС₅₀/IС₅₀), равная или значительно превышающая 1000 (таблица 5).

Среди производных 9-(2-бензилоксиэтил)аденина некоторые соединения также были высокоактивны против ЦМВ. В частности, соединения 67 и 72 проявляли ингибиторные свойства в концентрациях ниже наномолярного уровня.

Некоторые 9-замещенные производные пурина были высокоактивными в отношении репликации ЦМВ, в том числе соединения 91 (IС₅₀ 0,15 μM), 105 (IC₅₀ 0,005 μM), 106 (IC₅₀ 0,05 μM), 121 (IC₅₀ 0,01 μM) и 126 (IC₅₀ 0,05 μМ). В частности, соединения 105 и 106 показали резко выраженную селективность (свыше 1000).

Анти-ВИЧ-1 активность.

За исключением соединения 2, которое имело индекс селективности около 10 в отношении ВИЧ-1 в культуре СЕМ-клеток, ни одно из производных 9-(2-феноксиэтил)аденина, имеющих заместитель в фенильном ядре и оказывающих высокую активность в отношении ЦМВ, не ингибировало репликацию ВИЧ-1 в культурах клеток СЕМ и МТ-4. Однако некоторые соединения (например, 14, 29, 30, 39, 40, 54 и 55) обладали высокой цитотоксичностью в использованных клеточных культурах (50%-ная цитотоксическая концентрация СС₅₀ находилась в диапазоне 1-10 μМ).

В противоположность этому, некоторые производные 9-(2-бензилоксиэтил)аденина показали выраженную и селективную анти-ВИЧ-1 активность. В частности, соединения 61, 67 и 76, проявили себя как наиболее мощные и селективные ингибиторы репликации ВИЧ-1 в культурах клеток СЕМ и МТ-4. Величина их ингибиторной концентрации ЕС₅₀ составляла 0,1-0,3 μг/мл, тогда как клеточная токсичность СС₅₀ была в пределах 13-75 μг/мл. В целом, цитостатическая активность была более выражена в культуре лимфоцитов МТ-4, чем в СЕМ клетках. Во всех трех случаях заместители (Me, трет-Bu или Вr) были в положениях 3 и 5 фенильного кольца. Перемещение указанных заместителей из положения 3 в положение 2 приводило к заметному понижению антивирусной активности соединений.

Соединения 108, 109 и 110, содержащие соответственно 2-(1-фенилэтокси)этильный, 2-(дифенилметокси)этильный и 2-(фенил-м-Сl-фенилметокси)этильный заместители, также проявили заметную активность в отношении ВИЧ-1 в культурах клеток СЕМ и МТ-4 (ЕС₅₀ 0,4-1,1 μг/мл, СС₅₀ 53-191 μг/мл). Таким образом, некоторые из синтезированных соединений продемонстрировали выраженную способность ингибировать цитопатический эффект ВИЧ-1 в клеточных культурах в наномолярных концентрациях и имели индекс селективности (СС₅₀/ЕС₅₀) в пределах от 200 до 750, в зависимости от природы клеточной линии, включенной в исследование.

Из изучения закономерности структура - противовирусная активность следует, что у полученных пуриновых производных однозначной корреляции между активностью против ВИЧ-1 и против ЦМВ нет. Некоторые соединения, которые показали мощную активность в отношении ВИЧ-1, были неактивными против ВИЧ-2 (данные не приводятся). У отдельных высокоактивных ингибиторов ЦМВ отсутствует какая-либо анти-ВИЧ активность (например, у соединений 30, 36, 37, 105). Другие соединения этого же химического ряда были заметно активны против обоих вирусов (например, соединения 61, 67, 68, 72, 76). Это в целом отличает синтезированный новый класс пуриновых производных от известных ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ. Вероятно, некоторые из полученных производных 9-замещенного аденина имеют новый механизм противовирусного действия.

Таким образом, открыт новый класс противовирусных агентов ненуклеозидной природы, которые проявляют выраженную активность в отношении ВИЧ-1 и ЦМВ in vitro и по эффективности анти-ЦМВ действия в десятки и сотни раз превосходят использующиеся в клинике современные лекарственные средства. Наличие у одних и тех же соединений одновременно высокой анти-ВИЧ-1 и анти-ЦМВ активности позволяет считать их перспективными для комплексного лечения СПИД и оппортунистических цитомегаловирусных инфекций.

Формула изобретения

Производные пурина общей формулы

где n = 0 – 4;

m = 0 – 3;

R¹ = Н, ОН или NH₂;

R² = ОН, NH₂, ацетиламино или бензоиламино;

R³ = Н или низший алкил C₁–С₄;

R⁴ = Н, низший алкил C₁-С₄ или фенил;

Х = СН₂, О, S, NH или С(O)O;

Y = СН₂, СН=СН, С(O), О или ординарная связь;

Ar = фенил, пиридил, нафтил или замещенный фенил формулы

где независимо R⁵–R⁹ = алкил С₁–C₈, циклоалкил C₅–С₆, 1-адамантил, аллил, фенил, бензил, F, CI, Br, J, трифторметил, алкокси C₁–С₅, фенокси, бензилокси, бензоилокси, циано, карбокси, ацетил или нитро, обладающие противовирусной активностью.