Способ количественного определения гликогемоглобина

 

Изобретение относится к клинико-диагностическим и биохимическим исследованиям. Способ количественного определения гликогемоглобина заключается в том, что анализируемую пробу крови обрабатывают антикоагулянтом, гемолитиком, выделяют на сорбенте агароза-привитая 4-аминометилфенилборная кислота последовательной обработкой 0,5 молярным калийфосфатным буферным раствором с рН 8,0-8,4 и 0,1 молярным раствором уксусной кислоты и нейтрализацией кислого элюента первым элюентом, предварительно добавляемым в сборник элюента. Способ позволяет сократить время анализа с 2 часов до 30 минут, колонка с сорбентом не требует регенерации для повторного анализа в соответствии с изобретением (исключаются стадии регенерации и консервации колонки с сорбентом), а сам сорбент может долго храниться без потери его качеств, используются более простые и доступные элюенты.

Настоящее изобретение предназначено для количественного определения относительного содержания гликозилированного гемоглобина (HbA_1c) в капиллярной крови человека в клинико-диагностических и биохимических лабораториях.

Известен способ количественного определения гликогемоглобина, включающий обработку анализируемой пробы крови антикоагулянтом и гемолитиком, выделение на колонке с сорбентом агароза-привитая 3-аминофенилборная кислота с использованием на стадии уравновешивания колонки и элюции негликозилированного гемоглобина буферного раствора - аммоний ацетат, магний хлорид, натрий азид с рН 8,1±0,1 и элюции гликозилированного гемоглобина буферным раствором аммоний ацетат, магний хлорид, сорбитол, натрий азид, измерение и расчет, регенерацией колонки 0,5%-ной уксусной кислотой и водой, консервацией сорбента колонки раствором азида натрия (Инструкция по применению Набора для определения гликозилированного гемоглобина “ДИАБЕТ-ТЕСТ” М., 1996 г.).

Недостатками способа являются его длительность (порядка 2 часов), связанная с большими объемами элюентов и необходимостью регенерации колонки для удаления сорбитола и консервации колонки, малая стабильность сорбента агароза-привитая 3-аминофенилборная кислота при хранении.

К тому же аммоний ацетатный буфер относится к категории летучих буферных растворов и в жарком климате теряет аммиак, что приводит к снижению рН и искажению результатов анализа.

Задачей изобретения является сокращение длительности способа количественного определения гликолизированного гемоглобина и использование стабильных сорбента и элюента.

Указанная задача решается способом, заключающимся в том, что анализируемую пробу крови обрабатывают антикоагулянтом, гемолитиком, выделяют на сорбенте агароза-привитая 4-аминометилфенилборная кислота последовательной обработкой 0,5 молярным калийфосфатным буферным раствором с рН 8,0-8,4 и 0,1 молярным раствором уксусной кислоты и нейтрализацией кислого элюента первым элюентом, предвательно добавляемым в сборник элюента.

Практически способ осуществляют следующим образом.

В пластмассовую пробирку вносят 0,05 мл (или 1 каплю) антикоагулянта (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,1 М; натрий хлорид 0,9%) и 0,2 мл (или 3-4 капли) крови, перемешивают, дают отстояться и отбирают 0,02 мл эритроцитарной массы, затем переносят в пробирку, содержащую 0,2 мл гемолитика (Тритон Х-100, 0,1%; натрий азид, 8 мМ), в микроколонку на верхний фильтр вносят 0,1 мл гемолизата, после впитывания гемолизата в фильтр вносят по 0,1 мл 0,5 М калий фосфатного буфера с рН 8,0-8,4, дают впитаться в сорбент и вносят еще 2 мл этого же буфера, дают жидкости стечь. К полученному элюенту добавляют 4 мл дистиллированной воды и перемешивают (фракция А). В колонку вносят 2,0 мл 0,1 М раствора уксусной кислоты, дают жидкости стечь в пробирку, содержащую 1 мл первого буфера (фракция Б). Далее измеряют оптическую плотность элюента, разбавленного 4 мл дистиллированной воды, при длине волны 414 нм (или в пределах 405-420 нм), используя в качестве образца сравнения дистиллированную воду, и рассчитывают содержание гликированного гемоглобина.

Пример 1.

Для образца крови здорового пациента получены значения:

ОП₄₁₄ фракция А=0,980

OП₄₁₄ фракция Б=0,100

% GHb=(0,10×100)/(0,10+2,07×0,98)=4,6%

% HbA_1c=(4,6×0,56)+3,4=6,0%

Пример 2.

Для образца крови больного сахарным диабетом получены значения:

ОП₄₁₄ фракция А=0,80

OП₄₁₄ фракция Б=0,28

% GHb=(0,28×100)/(0,28+2,07×0,80)=14,5%

% HbA_1c=(14,5×0,56)+3,4=11,5%,

где ОП₄₁₄ - оптическая плотность растворов при длине волны 414 нм;

% GНb - процент общего гликогемоглобина;

2,07 - коэффициент соотношения объемов фракции А (6,2 мл) и фракции Б (3,0 мл);

0,56 и 3,4 - коэффициенты линейной регрессии предлагаемого и референсного методов калибровочного графика.

Способ по изобретению позволяет сократить время анализа с 2 часов до 30 минут, колонка с сорбентом не требует регенерации для повторного анализа в соответствии с изобретением (исключаются стадии регенерации и консервации колонки с сорбентом), а сам сорбент может долго храниться без потери его качеств. По предлагаемому способу используются более простые и доступные элюенты.

Формула изобретения

Способ количественного определения гликогемоглобина, включающий обработку анализируемой пробы антикоагулянтом и гемолитиком, выделение на сорбенте агароза - привитое производное фенилборной кислоты, измерение и расчет, отличающийся тем, что выделение проводят на агароза - привитая-4-аминометилфенилборная кислота последовательно 0,5 молярным калийфосфатным буфером с рН 8,0-8,4 и 0,1 молярным раствором уксусной кислоты с рН 2,8-3,0 и нейтрализацией кислого элюента первым элюентом, предварительно добавляемым в сборник элюента.