Синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может применяться для лечения наркоманий, отравлений различными ядами в промышленности и быту, при техногенных катастрофах и т.п. Сущность изобретения заключается в том, что синтетический иммуноген представляет собой конъюгат в виде носителя - природного или искусственного белка (яичный альбумин, или человеческий гамма-глобулин, или микробные токсины) и гаптена - наркотического или психотропного соединения из следующих групп низкомолекулярных соединений: ароматические пропанамины, или изохинолины, или дифенилметаны, или индоламины, или производные барбитуровой кислоты, или производные замещенных пиперидинов. Конъюгат модифицирован иммунокомпетентным полиэлектролитом - полиоксидонием при соотношении, вес.%: конъюгат:полиоксидоний = 1:1,5-5,0. Преимущество изобретения заключается в высокой иммунологической активности, сокращении доз и сроков лечения. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано при лечении наркомании, отравлении различными ядами в промышленности и быту, при техногенных катастрофах и т.п.

В настоящее время широко используются в отечественной медицинской практике синтетические иммуногены, состоящие из носителя - полиоксидония (N-оксидированного производного полиэтиленпиперазина с высоким молекулярным весом) и гаптена - высокомолекулярного соединения, например фермента гиалуронидазы, или смеси гемагглютина и нейрамидазы, или холерного токсина, или тритонового экстракта (гликопептида) клеточных стенок микробактерий БЦЖ, или др.

[см., например, з. №97103034, МПК А 61 К 38/43, заявл. 28.02.1997, опубл. 10.09.1998; п. №1580617, МПК А 61 К 39/145, заявл. 13.05.1988, опубл. 10.02.1997; п. №2021816, МПК А 61 К 39/106, з. 05.06.1991, опубл. 30.10.1994; п. №2153354, МПК А 61 К 39/04, завл. 31.03.1999, опубл. 27.07.2000; ж. “Иммунология” №6, 2002, с.324-333; ж.“Лечащий врач” №4, 1998].

Несмотря на то, что входящий в состав известных иммуногенов полиоксидоний обладает уникальными свойствами (воспроизводимостью химической структуры, отсутствием балластных примесей, ярко выраженной иммуностимулирующей активностью, выраженными детоксицирующими, антиоксидантными и мембраностабилизирующими свойствами), описанные выше препараты могут быть применены только для лечения острых и хронических бактериальных или вирусных инфекций из-за наличия в них специфических гаптенов.

Известен наиболее близкий по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими веществами (в частности, опиатной зависимости), представляющий собой конъюгат в виде носителя - природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения. Причем в качестве носителя он содержит бычий сывороточный альбумин или синтетические полипептиды и гликопротеины, а в качестве гаптена - морфин, или кодеин, или героин, или метадон, или т.п.

[см. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. “Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям”, М.: Наука, 1985].

Недостатки прототипа следующие:

- наличие балластных примесей;

- низкая терапевтическая (иммуностимулирующая) активность;

- необходимость применения больших доз (до 20 мг/кг) и продолжительность иммунизации (до 6 месяцев);

- невозможность достижения стабильного и/или пролонгированного иммунитета.

Задачей настоящего изобретения является создание легковоспроизводимого, доступного и безвредного синтетического иммуногена, способного защитить человека от действия широкого спектра токсических веществ, формирующего в его организме стойкий, пролонгированный иммунный ответ.

Поставленная задача решается тем, что в известном синтетическом иммуногене для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами, представляющем собой конъюгат в виде носителя - природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения, согласно изобретению, конъюгат модифицирован иммунокомпетентным полиэлектролитом-полиоксидонием при соотношении, вес.%: конъюгат:полиоксидоний = 1:1,5-5,0,

причем он содержит в качестве носителя - яичный альбумин, или человеческий гамма-глобулин, или микробные токсины, а в качестве гаптена - низкомолекулярные соединения из следующих групп: ароматические пропанамины, или изохинолины, или дифенилметаны, или индоламины, или производные барбитуровой кислоты, или производные замещенных пиперидинов.

Модификация предлагаемого конъюгата полиоксидонием обеспечивает отсутствие в синтетическом иммуногене балластных примесей, при этом заявляемое соотношение конъюгат: полиоксидоний необходимо и достаточно для достижения высокой иммуностимулирующей активности стабильного пролонгированного действия.

Использование в предлагаемом синтетическом иммуногене конкретных носителей и гаптенов защищает организм человека от действия широкого спектра токсических веществ (в том числе наркотиков, промышленных ядов, различных канцерогенов).

Заявляемый синтетический иммуноген стимулирует процессы в рамках иммунной системы: миграцию и взаимодействие Т- и В-лимфоцитов, продукцию антител в ответ на чужеродные антигены, функционирование NK-клеток и макрофагов. Под его влиянием усиливается синтез антител, количество которых возрастает в геометрической прогрессии уже в течение первых двух недель, а к концу второго месяца от начала введения в организме накапливаются антитела, способные связывать дозы наркотических или других токсических веществ, в 5-10 раз превышающие летальные. В частности, наряду с продукцией антигероиновых антител, индуцируется образование мононуклеарных клеток селезенки, связывающих героин. Таким образом, иммунизация пациента предлагаемым препаратом приводит к развитию продолжительной толерантности к конкретным веществам при отсутствии любых отрицательных явлений.

Анализ известных технических решений позволяет сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение не известно из уровня исследуемой техники, что свидетельствует о его соответствии критерию “новизна”.

Сущность настоящего изобретения для специалистов не следует явным образом из уровня техники, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию “изобретательский уровень”.

Возможность приготовления синтетического иммуногена из доступных промышленно выпускаемых компонентов на традиционном оборудовании с помощью известных методик свидетельствует о соответствии изобретения критерию “промышленная применимость”.

Для приготовления заявляемого синтетического иммуногена использовали промышленно выпускаемые или самостоятельно синтезированные компоненты, приведенные в табл. 1.

Приготовление синтетического иммуногена осуществляли по известным традиционным методикам (см. в конце описания).

Методика 1.

К смеси 1,2 г бензидина, 2 мл муравьиной кислоты и 70 мл воды при минус 10°С добавляли 1 г нитрата натрия в 2 мл воды. Реакционную смесь выдерживали при охлаждении и перемешивании в течение одного часа. Затем полученный раствор добавляли при 0°С к раствору 2 г фентанила (карфентанила, метадона, кокакина, никотина, героина и т.п.) в 15 мл воды, поддерживая рН 7,0-8,0 добавлением 10%-ного раствора едкого натра. Осадок отфильтровывали, промывали водой и многократно хлороформом.

К 200 мг приготовленного пара-аминодифенилазофентанила (-карфентанила, - метадона, - кокакина, - никотина, -героина и т.п.) и 10 мл концентрированной соляной кислоты при минус 10°С добавляли 29 мг нитрита натрия в 2 мл воды. Реакционную смесь выдерживали при охлаждении и перемешивании в течение 30 минут. Полученный раствор прибавляли на холоде к раствору человеческого гамма-глобулина или синтетического полипептида в воде, поддерживая рН 7,0-8,0 добавлением едкого натра. Смесь оставляли на 12 часов в холодильнике. Очистку полученного конъюгата проводили через полупроницаемые мембраны против тока дистиллированной воды в течение 5 дней или на сефадексе. Конъюгат модифицировали полиоксидонием, предварительно активированным известным путем (см., например, п. №1580617) при соотношении конъюгат:полиоксидоний = 1:1,5-5,0.

Структурная формула полученного синтетического иммуногена представлена в конце описания.

Методика 2.

Брали стехиометрические количества налтрексона (морфина, кодеина, и т.п.) 0,01 моль (3,8 г) в пиридине 0,01 моль (0,8 г) и сукцинилдихлорида 0,01 моль (1,6 г). Пиридин использовали в реакции как элиминатор хлороводорода, выделяющегося в процессе присоединения налтрексона к одной из хлоркарбоксигрупп сукцинилдихлорида. Вторая же подобная группа оставалась свободной для последующего присоединения к белку - человеческому гамма-глобулину или синтетическому полипептиду. Очистку конъюгата и его модификацию полиоксидонием осуществляли так же, как описано в методике 1.

Структурная формула полученного синтетического иммуногена представлена в конце описания.

Заявляемый синтетический иммуноген синтезировали в условиях кафедры фармакологии Уральской медицинской академии, имеющей разрешение Минздрава России на научные работы с наркотическими и психотропными веществами в соответствии со следующими документами: Приказом МЗ СССР №1311 от 30.12.1982 г. и Федеральным законом “О наркотических средствах и психотропных веществах” №3 - ФЗ от 8.01.98. Синтезированные иммуногены многократно испытывали на мышах, а также на группах добровольцев в соответствии со ст.124 УК РФ, ст.43 Основ законодательства об охране здоровья граждан и ст.21, ч. 2 Конституции РФ.

Синтетический иммуноген вводили пациентам в виде раствора подкожно в качестве 0,5 мл. Через две недели процедуру повторяли и затем продолжали введение иммуногена 1 раз в неделю еще в течение шести недель. Время активной иммунной реакции определяли стандартными методами: РПГА, РТПГА, ИФА, РИА. Пациенты находились под регулярным наблюдением за изменением состояния их здоровья в течение 5 лет.

Пример 1. Синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами.

Синтетический иммуноген представляет собой конъюгат в виде носителя - природного белка - человеческого гамма-глобулина и гаптена - низкомолекулярного соединения из группы изохинолина-налтрексона.

Конъюгат модифицирован иммунокомпетентным полиэлектролитом-полиоксидонием при соотношении, вес.%: конъюгат:полиоксидоний = 1:1,5, 10,0 мг и 15,0 мг соответственно.

В примерах 2-8 представлен синтетический иммуноген с варьированием носителей, гаптенов и соотношения (конъюгат:полиоксидоний) в заявляемых пределах.

Составы предлагаемого синтетического иммуногена и известного, взятого за прототип [см. Ковалев И.Е., Полевая Ю.И. “Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям”, М.: Наука, 1985], а также их фармакологические действия приведены в табл. 2.

Как видно из примеров и данных таблицы, использование заявляемого синтетического иммуногена по сравнению с известным, взятым за прототип [см. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. “Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям”, М.: Наука, 1985], обеспечивает следующие технические и общественно-полезные преимущества:

- легкую воспроизводимость без балластных примесей;

- доступность и безвредность;

- высокую иммунологическую активность;

- сокращение доз и сроков лечения;

- стабильный пролонгированный иммунитет;

- защиту от действия широкого спектра токсических веществ (наркотических и психоактивных).

Доклинические исследования

В специальной серии опытов методом биологической пробы была выяснена возможность нейтрализации токсического действия героина на животных. Группе контрольных животных - четыре неиммунизированных кролика и опытной группе - четыре иммунизированных кролика внутривенно вводили абсолютно летальную дозу героина 100 мг/кг (LD100). Было установлено, что все четыре кролика контрольной группы погибли от указанных доз. Среди иммунизированных кроликов гибели не зарегистрировано ни в одном из четырех случаев, т.е. наблюдалась четкая иммунологическая защита.

Также проводили исследования сыворотки крови иммунизированных животных.

Восемь кроликов весом каждый по 2 кг иммунизировали препаратом 3-гемисукцинилналтрексон - человеческий гамма-глобулин - полиоксидоний, содержащий 45 молей 3-гемисукцинилналтрексона и 3 моля полиоксидония на молекулу белка, который вводили внутримышечно по 30 мг/кг два раза в неделю в течение 8 недель. В сыворотке крови животных до иммунизации и после нее определяли наличие антител к препаратам и изучали их специфичность в реакции торможения пассивной

Иммунизация кроликов препаратом по приведенной схеме приводила к появлению в сыворотке крови высоких титров антител к иммунокомплексу 3-гемисукцинилналтрексон - человеческий гамма-глобулин - полиоксидоний (1:2560). В реакции торможения пассивной гемагглютинации было установлено, что образующиеся антитела связывают героин и 3-гемисукцинилналтрексон: титр антител к иммунокомплексу уменьшался до 1:320 при использовании концентрации героина и 3-гемисукцинилналтрексона 0,001 моль, что свидетельствует о наличии антител к этим соединениям.

Таким образом, синтезированный иммунокомплекс специфически связывает героин не только in vitro, но и в целом организме.

Полученные из сыворотки крови кроликов антитела изучены на специфичность связывания опиатов фенантренового ряда. Исследование специфичности антител, т.е. способности связываться с морфином, героином и другими лигандами опиатных рецептов, проводили ингибиторным иммуноферментным анализом. В качестве ингибиторов использовали морфин, героин, кодеин, N-аллилморфин и метадон. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при активной иммунизации животных иммунокомплексом 4-гемисукцинилналтрексон - человеческий гамма-глобулин - полиоксидоний индуцируются антитела, специфически связывающие морфин, героин, кодеин, N-аллилморфин и практически не реагирующие с метадоном.

Специфичность антител против героина в кроличьей иммунной сыворотке.

Из полученных данных видно, что связывание опиатов зависит от наличия в их молекулах определенных функциональных групп и радикалов. Так, в частности, высокая специфичность антител к героину обусловлена наличием в иммунокомплексе сложной эфирной связи налтрексона с янтарной кислотой, а к N-аллилморфину - с присоединенным к атому азота циклопропилиетильным радикалом в химической структуре налтрексона. Таким образом, образующиеся антитела обладают высокой специфичностью только к опиатам фенантренового ряда (героину и его структурным аналогам).

Учитывая результаты экспериментов, авторы пришли к выводу о том, что 3-гемисукцинилналтрексон пригоден для синтеза иммуногена. Его химическая структура содержит разветвленные радикалы для формирования иммунного ответа и синтеза высокоаффинных антител к опиатам фенантренового ряда.

Клинические исследования.

Аналогичные исследования специфичности были проведены с антителами, выделенными из сыворотки крови добровольцев - больных наркоманией, иммунизированных синтезированным иммуногеном.

Иммуноген вводили 22 добровольцам, страдающим опийной наркоманией, возраст: 21-36 лет. Продолжительность приема наркотиков: 2-13 лет. Иммуноген вводили подкожно в верхнюю треть плеча правой и левой руки попеременно, один раз в неделю, 8-10 инъекций на курс.

Из исходных 22 сывороток наркоманов антиопиатные антитела выделены во всех образцах. По данным ИФА в сыворотках содержатся антитела IgG- и IgM-класса против морфина, героина и кодеина, реагирующие в одинаковой степени с каждым из метаболитов.

Специфичность антител против героина в человеческой иммунной сыворотке

Как и в случае иммунных кроличьих антиопиатных антител, антитела, выделенные из сыворотки крови наркоманов, практически не взаимодействовали с наркотическими веществами нефенантренового ряда. Антитела, выделенные из сыворотки крови больных наркоманией, по сравнению с антителами из кроличьих иммунных сывороток обладают более широким спектром специфичности.

Для подтверждения данных, приведенных в таблице “Составы синтетических иммуногенов и их фармакологическое действие”, приведены дополнительные сведения.

Конкретные примеры применения синтетических иммуногенов, представленных в табл. 2.

Пример 9 (соответствует составу 1 таблицы)

Пациент - 25 лет, 7 лет опийная наркомания.

Исходные лабораторные данные: 1 мл плазмы крови - 2570 пмоль героиносвязывающих антител, определяемых радиоиммунным анализом (РИА).

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном - человеческий гамма-глобулин-налтрексон (гаптен из группы изохинолинов) - полиоксидоний.

Лабораторные данные (через 9 недель от начала лечения иммуногеном): РИА 1 мл - 77550 пмоль - синтез героиносвязывающих антител. Через 8 недель созревают Т-лимфоциты и стимулируется образование антител, вызывающих созревание В-лимфоцитов, возникает пожизненный клеточный иммунитет; отсутствуют аллергические реакции.

Контрольные лабораторные данные (через 12 месяцев от начала лечения иммуногеном): РИА 1 мл - 50120 пмоль.

Пример 10. (2)

Пациент - 32 года, 9 лет опийная наркомания.

Исходные лабораторные данные: 1 мл - 1520 пмоль; сорбционная способность эритроцитов (ССЭ) - детоксикационная функция организма 64,1±5,7% (определение экспресс-методом поглощения эритроцитами витальных красителей - метиленовой сини, см. ж.“Лабораторное дело”, 1988 г., №9, ст. А.А.Тогайбаева, А.В.Кургузкина и др. “Способ диагностики эндогенной интоксикации”).

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном - человеческий гамма-глобулин-налтрексон - полиоксидоний.

Лабораторные данные: РИА 1 мл - 78610 пмоль, ССЭ - 44,1±5,8% - усиление детоксикационной функции организма. Другие характеристики аналогичны приведенным в примере 1.

Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл – 51100 пмоль.

Пример 11.(3)

Пациент 21 год, 4 года опийная наркомания.

Исходные лабораторные данные: РИА 1 мл – 1680 пмоль; ССЭ - 63,8±5,6%; определение опиатов (иммунохроматографические тесты мочи) - положительно.

Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном - человеческий гамма-глобулин-налтрексон - полиоксидоний.

Лабораторные данные: РИА 1 мл-78900 пмоль, ССЭ - 42,4±5,8%; определение опиатов - отрицательно, т.е. усиливается сорбция метаболитов и ксенобиотиков. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1 и 2.

Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл – 52600 пмоль.

Примечание к примерам 1-3: приведенные данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов.

Пример 12.(4)

Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном - яичный - альбумин-амфетамин (гаптен из группы ароматических пропанаминов) - полиоксидоний из расчета 50 мг/кг.

Вводили летальную дозу психоактивного вещества первитина.

Лабораторные данные: РИА 1 мл – 76500 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3.

Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл – 51200 пмоль.

Пример 13. (5)

Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном - яичный альбумин-метадон (гаптен из группы дифенилметана) - полиоксидоний из расчета 50 мг/кг.

Вводили летальную дозу наркотического вещества - героина.

Лабораторные данные: РИА 1 мл - 75300 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3.

Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл – 52600 пмоль.

Пример 14 (6)

Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном - дифтерийный токсин-гармин (гаптен из группы индоламинов) - полиоксидоний из расчета 50 мг/кг.

Вводили летальную дозу психоактивного вещества - первитина.

Лабораторные данные: РИА 1 мл - 77900 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3.

Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл - 54700 пмоль.

Пример 15 (7)

Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном - человеческий гамма-глобулин - фенобарбитал (гаптен из группы производных барбитуровой кислоты) - полиоксидоний из расчета 50 мг/кг.

Вводили летальную дозу снотворного - барбитурата.

Лабораторные данные: РИА 1 мл – 72300 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3.

Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл – 51100 пмоль.

Пример 16 (8)

Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном - дифтерийный человеческий гаммма-глобулин-карфентанил (гаптен из группы производных замещенных пиперидинов) - полиоксидоний из расчета 50 мг/кг.

Вводили летальную дозу наркотического вещества - морфина.

Лабораторные данные: РИА 1 мл - 75400 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3.

Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл – 57200 пмоль.

Прототип.

Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали иммуногеном дифтерийный бычий сывороточный альбумин-героин из расчета 50 мг/кг.

Вводили только внутривенно летальную дозу наркотического вещества - морфина.

Лабораторные данные: РИА 1 мл – 70100 пмоль. Высокая аллергенность, обусловленная образованием иммуноглобулинов реагинного типа класса IgE. Гибель животных через 3 месяца в результате анафилактического шока во время повторной иммунизации.

Формула изобретения

Синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами, представляющий собой конъюгат, состоящий из носителя - природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения, отличающийся тем, что конъюгат модифицирован иммунокомпетентным полиэлектролитом - полиоксидонием при соотношении, вес.%: конъюгат:полиоксидоний = 1:1,5-5,0, причем, он содержит в качестве носителя яичный альбумин, или человеческий гамма-глобулин, или микробные токсины, а в качестве гаптена - низкомолекулярные соединения из следующих групп: ароматические пропанамины, или изохинолины, или дифенилметаны, или индоламины, или производные барбитуровой кислоты, или производные замещенных пиперидинов.

РИСУНКИРисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8