Производные 5-имино-13-дезокси антрациклина и способ их получения (варианты), фармацевтическая композиция, способ лечения рака, аутоиммунных заболеваний или иммунодефицитных нарушений

 

Изобретение относится к производным 5-имино-13-дезокси антрациклина формулы

где R1, R2 и R3 являются Н, ОН или ОСН3 группой и R4 представляет собой следующие группы:

Предложена фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая по крайней мере одно производное 5-имино-13-дезокси антрациклина. Предложен способ лечения рака, аутоиммунных заболеваний или иммунодефицитных нарушений, включающий введение эффективного количества по крайней мере одного производного 5-имино-13-дезокси антрациклина. Также предложены способы (варианты) получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина. Способ осуществляют путем восстановления антрациклин 13-тозилгидразона цианборгидридом натрия в безводном метаноле при рН около 7,0 или ниже в присутствии п-толуолсульфокислоты посредством осторожного кипячения раствора с обратным холодильником в атмосфере азота при температуре приблизительно 75°С. Затем реакционную смесь охлаждают, обрабатывают водой и хлороформом, сушат, осушитель отфильтровывают. Фильтрат разделяют на колонке с силикагелем, промываемой градиентом хлороформ/метанол, при этом продукт 13-дезокси антрациклина элюируют метанолом. Проводят дальнейшую очистку метанольного элюата с помощью препаративной ВЭЖХ, затем к раствору очищенного 13-дезокси антрациклина в смеси метиленхлорида и воды добавляют гидрокарбонат калия и ди-трет-бутил-дикарбонат. Выделяют полученный 3’-N-Вос-дезокси антрациклин, растворяют его в безводном метаноле, охлаждают полученный раствор и проводят аминирование 3’-N-Boc-13-дезокси антрациклина посредством насыщения раствора аммиаком при температуре около 0-4°C. Удаляют растворитель и аммиак, растворяют остаток в безводном метаноле, удаляют 3’-N-Вос-группу и с помощью препаративной ВЭЖХ выделяют целевой продукт, который при необходимости превращают в гидрохлорид 5-имино-13-дезокси антрациклина. Технический результат - производные 5-имино-13-дезокси антрациклина, обладающие меньшим побочным эффектом кардиотоксичности. 6 н. и 7 з.п.ф-лы, 4 табл., 12 ил.

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к производным 5-имино-13-дезокси антрациклина, медицинскому использованию 5-имино-13-дезокси антрациклина и способам получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Уровень техники

Наиболее известными противораковыми лекарствами антрациклинового типа являются доксорубицин и даунорубицин, которые содержат 13-кетогруппу и 5-кетогруппу. Доксорубицин, описанный в патенте США 3590028, обладает широким диапазоном применения при лечении раковых заболеваний и используется при лечении лейкозов, лимфом и твердых опухолей. Даунорубицин, описанный в патенте США 3616242, используется при лечении острых лейкемий. Однако, применение этих лекарств ограничено серьезным побочным эффектом кардиотоксичности, так что общее количество лекарства, которое может быть предписано пациенту, не может превышать 550 мг/М2 (Е.А.Lefrak с соавт., Cancer, 32:302, 1973). Даже при данной или близкой к рекомендованному количеству максимальной общей кумулятивной дозе (430-650 мг/М 2) у 60% пациентов наблюдается значительная и устойчивая сердечная дисфункция и у 14% развивается застойная сердечная недостаточность (A.Dresdale с соавт., Cancer, 52:51, 1983). Таким образом, в то время как эти лекарства являются полезными при торможении роста раковых опухолей, пациент может умереть от застойной сердечной недостаточности из-за тяжелого кардиотоксического побочного эффекта лекарств.

Некоторые исследователи полагают, что кардиотоксичность является результатом генерирования свободных радикалов хиноновой частью антрациклиновой молекулы (J.Dorowshow с соавт., J.Clin. Invest., 68:1053, 1981; D.V. Unverferth с соавт., Cancer Treat. Rev, 9:149, 1982; J.Goodman с соавт., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77:797, 1977; J.L.Zweier, J.Biol. Chem., 259:6056, 1984). С другой стороны, существует четкое доказательство того, что генерирование свободных радикалов может являться не единственным механизмом кардиотоксичности, потому что в присутствии ловушек свободных радикалов лекарства все еще продуцируют сердечные повреждения (J.F.VanVleet c coaвт., Am.J.Pathol., 99:13, 1980; D.V.Unverferth с соавт., Am.J.Cardiol., 56:157, 1985; С.Myers с соавт., Seminars in Oncology, 10:53, 1983; R.H.M. Julicher c соавт., J. Pharm. Pharmacol., 38:277, 1986; E.A. Porta с соавт., Res. Comm. Chem. Pathol. Pharmacol., 41:125, 1983).

Было также найдено, что ингибирование процесса генерирования свободных радикалов не исключает кардиотоксичности этих антрациклинов (P.S. Mushlin с соавт., Fed. Proc., 45:809, 1986). Вместо этого, это исследование показало, что кардиотоксичность доксорубицина и даунорубицина, которая проявляется снижением сердечной сократительной способности, зависит также от метаболического восстановления 13-кето остатка до 13-гидрокси метаболита. В испытываемых системах, где доксорубицин не превращался в 13-дигидро соединение, кардиотоксические эфекты наблюдали только при очень высоких концентрациях (200-400 микрограмм/мл) (P.S. Mushlin с соавт., Fed. Proc., 44:1274, 1985; R.D. Olson с соавт., Fed. Proc., 45:809, 1986). В противоположность 13-дигидро метаболитам, доксорубицинол и даунорубицинол вызывают кардиотоксичность в тех же самых испытываемых системах при относительно низких концентрациях (1-2 микрограмма/мл, R.D. Olson с соавт., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 26:227, 1985; R.D. Olson с соавт., Proceed. Am. Assoc. Cancer Res., 28:441, 1987).

Если доксорубицину позволяют оставаться в испытываемой системе даже в течение очень короткого периода времени, то протекают некоторые метаболические превращения и образуется 13-дигидро метаболит в достаточных количествах, так что начинает развиваться кардиотоксичность (L. Rossini с соавт., Arch. Toxicol. Suppl., 9:474, 1986; M. Del Tocca с соавт., Pharmacol. Res. Commun., 17:1073, 1985). Таким образом, были накоплены существенные доказательства того, что кардиотоксичность таких лекарств, как доксорубицин и даунорубицин является результатом сильных кардиотоксических эффектов, вызываемых их 13-дигидро метаболитами ((Р. Mushlin с соавт., Rational Drug Therapy, 22:1, 1988; S. Kuyper с соавт., FASEP Journal, 2:A1133, 1988; R. Boucek с соавт., J. Biol. Chem., 262:15851, 1987; и R. Olson с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:3585, 1988).

В настоящем изобретении использован тот факт, что 13-дезокси формы доксорубицина и даунорубицина или других подобных антрациклинов не будут метаболически превращаться в кардиотоксичные 13-дигидро формы, и, таким образом, 5-кетогруппу модифицируют с образованием такого соединения, которое будет с меньшей вероятностью генерировать свободные радикалы, обеспечивая, таким образом, средство для введения соединений настоящего изобретения в некардиотоксических количествах без ограничения общей кумулятивной дозы.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения являются новые производные 5-имино-13-дезоксиантрациклина, которые обладают меньшими побочными эффектами.

Соответственно, объектом настоящего изобретения являются способы получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина.

В соответствии с этой и другими целями и преимуществами настоящего изобретения в предпочтительных объектах предложен способ получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Обычно, антрациклины формулы I

где R1, R2 и R3 являются Н, ОН или ОСН3 группой и R4 представляет собой остаток сахара, отличный от морфолинил замещенного остатка сахара, легко превращаются в 13-тозилгидразоны согласно известным методам. Антрациклин 13-тозилгидразоны восстанавливают натрий цианборгидридом в кислых условиях до производных 13-дезокси антрациклина. Конечно, под морфолинилом подразумеваются замещенные морфолинильные остатки. Затем продукты подвергают очистке с помощью препаративной хроматографии без стадий экстракции. Очищенные производные 13-дезокси антрациклина превращают в N-Вос производные и затем обрабатывают NН3 с получением N-Вос-5-имино-13-дезокси антрациклинов. Удаление N-Вос группы в кислых средах дает производные 5-имино-13-дезоксиантрациклина. Были найдены способы для того, чтобы получить выходы продукта от около 50% до около 60%.

Дополнительные предпочтительные объекты настоящего изобретения обеспечивают способ получения производных 5-имино-13-дезокси дезоксиантрациклина. Способ включает получение кислого раствора антрациклин 13-тозилгидразона с цианборгидридом. Раствор осторожно кипятят с обратным холодильником. Реакционную смесь охлаждают. К раствору добавляют небольшое количество воды с последующим добавлением галогенсодержащего углеродного растворителя. Смесь фильтруют. Фильтрат подвергают очистке с помощью препаративной хроматографии с выделением производных 13-дезокси антрациклина. Очищенные производные защищают с помощью трет-бутоксикарбонильной группы с образованием 3’-N-Вос производных, которые затем обрабатывают аммиаком с получением 3’-N-Вос-5-имино-13-дезоксиантрациклинов. Удаление в кислых условиях защиты с аминогруппы приводит к 5-имино-13-дезоксиантрациклинам, которые затем очищают с помощью хроматографии.

Другой предпочтительный объект настоящего изобретения обеспечивает способ получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина. Способ включает приготовление раствора путем растворения около 1 г доксорубицин 13-тозилгидразон гидрохлорида и около 2,4 г п-толуолсульфокислоты в приблизительно 50 мл безводного метанола. К раствору добавляют около 0,8 г натрий цианборгидрида.

Раствор нагревают до температуры от около 68°С до около 72°С. Раствор осторожно кипятят с обратным холодильником в течение около 1 ч в атмосфере азота.

Реакционную смесь концентрируют до приблизительно 20 мл. Реакционную смесь охлаждают в морозильнике до температуры от около 0°С до около 4°С.

В реакционную смесь добавляют около 0,5 мл воды, затем около 200 мл хлороформа. К реакционной смеси добавляют безводный сульфат натрия. Соли отфильтровывают.

Фильтрат пропускают через колонку с силикагелем. Затем колонку промывают смесью хлороформ/метанол до получения бесцветного элюата.

Фракцию, содержащую продукт, элюируют метанолом. Метанольный элюат выпаривают. Остаток, получающийся после выпаривания, растворяют в 30% буферном растворе ацетонитрила в формиате аммония.

Продукт выделяют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием колонки, содержащей фенил. Продукт отделяют от других примесей с использованием градиента ацетонитрила/формиата аммония. Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, затем разбавляют приблизительно тем же объемом воды, что и собранная фракция, и этот раствор пропускают через препаративную фенильную колонку для ВЭЖХ. Колонку элюируют водой для удаления соли. Продукт элюируют метанолом. Метанольный элюат концентрируют и тот же самый продукт осаждают добавлением этилового эфира. Твердый продукт выделяют фильтрованием с получением около 600 мг 13-дезокси доксорубицина.

Около 600 мг очищенного 13-дезокси доксорубицина растворяют в около 60 мл метиленхлорида и около 10 мл воды и обрабатывают около 180 мг гидрокарбоната калия и около 180 мг ди-трет-бутилдикарбоната при комнатной температуре в течение около 2 ч. Органический раствор отделяют, промывают водой и сушат безводным сульфатом натрия. Раствор выпаривают досуха. Остаток растворяют в около 100 мл безводного метанола. Раствор, насыщенный аммиаком, хранят при температуре от около 0°С до около 4°С в течение 48 ч. Растворитель и аммиак удаляют в вакууме с получением 3’-N-Вос-5-имино-13-дезокси доксорубицина. 3’-N-Вос-5-имино-13-дезокси доксорубицин, полученный выше, обрабатывают около 60 мл безводного метанола, содержащего около 0,1 М хлористого водорода, при комнатной температуре в течение около 2 ч для удаления 3’-N-Вос-группы. Полученный раствор концентрируют до около 5 мл.

Концентрированный раствор выделяют с помощью препаративной ВЭЖХ с фенильной колонкой. Продукт отделяют от других примесей с использованием градиента ацетонитрила/формиата аммония. Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, разбавляют приблизительно равным объемом воды, вводят в препаративную фенильную колонку для ВЭЖХ и промывают водой для удаления солей. Затем продукт элюируют метанолом. Метанольный элюат подкисляют около 0,5 мл хлористого водорода в этиловом эфире. Затем раствор концентрируют до около 5 мл. К осажденному продукту добавляют около 10 мл этилового эфира. Осадок фильтруют с получением от около 40% до около 60% 5-имино-13-дезокси доксорубицин гидрохлорида.

В настоящем изобретении предложены также соединения, имеющие следующую формулу

где R1, R2 и R3 являются Н, ОН или ОМе группой и R4 представляет собой остаток сахара, отличный от морфолинил замещенного остатка сахара. Должно быть понятно, что под морфолинилом подразумеваются замещенные морфолинильные остатки. Соединения, которые включают морфолинил замещенный остаток сахара, проявляют значительно повышенную токсичность.

Далее, настоящее изобретение представляет фармацевтическую композицию, содержащую по крайней мере одно производное 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Кроме того, настоящее изобретение предлагает также способ лечения рака, включая лейкозы, лимфомы и твердые опухоли, причем данный способ включает стадию введения эффективного количества по крайней мере одного производного 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Последующие цели и преимущества настоящего изобретения будут понятны и очевидны для специалиста в данной области из следующего описания. Подробное описание показывает и описывает только предпочтительные варианты изобретения с тем, чтобы проиллюстрировать наилучшую форму осуществления изобретения. Для тех специалистов, которые будут осуществлять изобретение, изобретение включает иные и различные варианты. Детали изобретения можно изменять в различных аспектах, без отклонения от сути изобретения. Таким образом, чертежи и описание должны рассматриваться в виде иллюстративных по своей природе, но не ограничивающих объем изобретения.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Настоящее изобретение предлагает производные 5-имино-13-дезокси антрациклина, их использование и способы для получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина. В таблице 1 представлены примеры производных 5-имино-13-дезокси антрациклина, которые могут быть получены согласно настоящему изобретению. Как обсуждалось выше, соединения, такие как те, которые показаны в таблице 1, обладают, как известно, противоопухолевыми свойствами. Соединения обладают также меньшими побочными эффектами.

Способы настоящего изобретения могут быть осуществлены при температуре от около 0°С до около 75°С. Предпочтительно способы осуществляют при температуре от около 65°С до около 75°С. Более предпочтительно, способы осуществляют при температуре от около 68°С до около 72°С.

Способ согласно настоящему изобретению включает ряд общих условий. Например, реакцию восстановления предпочтительно проводят в кислых условиях. Другими словами, рН должно быть около 7,0 или ниже. Известные способы для получения приведенных выше соединений, которые используют щелочные условия в реакционной смеси, как было найдено, вызывают разложение реагирующих веществ и продуктов.

Кроме того, и кислород, и вода должны быть исключены при проведении реакции восстановления. Предпочтительно реакцию проводить в атмосфере азота или инертного газа с использованием безводных растворителей. Кроме того, реакция аминирования должна проводиться при температуре около 0-4°С. Более высокие температуры могут вызывать разложение реагирующих веществ и продуктов.

Кроме того, вода должна быть исключена из реакции аминирования. Предпочтительно реакцию проводят в безводных растворителях.

В соответствии с приведенным выше, настоящее изобретение обеспечивает способы получения соединений общей формулы, приведенной выше.

Следующая схема обеспечивает пример превращения молекулы в процессе протекания реакции.

Следующая блок-схема иллюстрирует пример варианта осуществления способа согласно настоящему изобретению для получения 5-имино-13-дезокси доксорубицина, который является 13-дезокси антрациклиновым производным.

Далее в таблице 1 представлены примеры антрациклиновых производных, синтез которых описан здесь.

В соединениях R4 может быть модифицированным вариантом различных антрациклиновых аналогов. Кроме того, кольцо D может быть замещено галогеном или гидроксильной группой. Например, кольцо D может быть замещено фтором, иодом или любым другим галогеном.

Обычно способы согласно настоящему изобретению включают приготовление кислого раствора 5-имино-13-дезокси антрациклина. Раствор осторожно кипятят с обратным холодильником. Затем реакционную смесь можно охладить. Согласно одному из примеров, реакционную смесь охлаждают до температуры от около 0°С до около 4°С. Затем может быть добавлено небольшое количество воды для гидролиза продукта. К реакционной смеси может быть добавлен галогенсодержащий углеродный растворитель. Галогенсодержащий углеродный растворитель может быть охлажден. Например, галогенсодержащий углеродный растворитель может находиться при температуре от около 0°С до около 4°С. Примером галогенсодержащего углеродного растворителя, который может быть здесь использован, является хлороформ. Реакционную смесь можно затем отфильтровать после добавления безводного сульфата натрия. Фильтрование можно проводить при пониженной температуре. Например, фильтрование можно проводить при температуре от около 4°С до около 15°С.

Добавление воды, описанное выше, предпочтительно инициирует гидролиз. Любой избыток воды может быть удален путем добавления безводного сульфата натрия. Затем неорганические соли предпочтительно отфильтровывают из реакционной смеси. Фильтрат может быть подвергнут хроматографированию на колонке с силикагелем. Гидрофобные примеси могут быть выделены путем элюирования менее полярными растворителями.

13-дезокси антрациклиновые продукты могут быть затем элюированы и элюат далее очищен.

Очищенные производные 13-дезокси антрациклина могут быть растворены в смешанном растворителе метиленхлорида и воды, содержащем основание и ди-трет-бутил-дикарбонат. Раствор может быть перемешан при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч. Органический раствор может быть выделен и промыт водой. Затем растворитель может быть удален и остаток может быть растворен в спиртовом растворителе. Спиртовый раствор может быть насыщен аммиаком при температуре от около 0°С до около 4°С в течение около 24 ч. Растворитель может быть удален и затем сухой остаток может быть обработан подкисленным спиртовым растворителем при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч. Получаемый раствор может быть подвергнут концентрированию и подвергнут дальнейшей очистке, затем подкислен и подвергнут осаждению в эфир с получением гидрохлоридных солей 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Предпочтительно, способы согласно настоящему изобретению включают приготовление раствора антрациклин 13-тозилгидразонов в безводном метаноле с п-толуолсульфокислотой и цианборгидридом натрия. Раствор осторожно кипятят с обратным холодильником в атмосфере азота и затем охлаждают. Добавляют воду с последующим добавлением хлороформа. Осажденные соли отфильтровывают и фильтрат выделяют на колонке с силикагелем. Гидрофобные примеси, образовавшиеся при разложении, элюируют смешанным раствором хлороформа и метанола. Продукты 13-дезокси антрациклинов элюируют метанолом. Метанольный элюат далее чистят с помощью препаративной ВЭЖХ.

Очищенные 13-дезокси антрациклины растворяют в смеси метиленхлорида и воды и обрабатывают гидрокарбонатом калия и ди-трет-бутил-дикарбонатом. Раствор перемешивают при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч. Органический слой отделяют, промывают водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Затем растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в безводном метаноле, насыщенном аммиаком, и хранят при температуре от около 0°С до около 4°С в течение около 48 ч. Метанол и аммиак удаляют из продукта реакции, который обрабатывают разбавленным раствором кислоты в спирте при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч с получением соединения 5-имино-13-дезокси антрациклина. Указанное соединение в растворе концентрируют и затем очищают с помощью препаративной ВЭЖХ для удаления примесей, а затем солей. Продукт элюируют метанолом, подкисляют и осаждают с получением гидрохлоридной соли 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Следующее ниже описание иллюстрирует пример осуществления способа согласно настоящему изобретению.

Пример 1

Получение гидрохлорида 5-имино-13-дезокси доксорубицина

Около 1 г доксорубицин 13-тозилгидразон гидрохлорида и около 2,4 г п-толуолсульфокислоты растворяют в около 50 мл безводного метанола. К этому раствору добавляют около 0,8 г цианборгидрида натрия. Полученный раствор нагревают до около 68-72°С и выдерживают при осторожном кипячении с обратным холодильником в течение около одного часа в атмосфере азота.

Затем реакционную смесь концентрируют до около 20 мл и охлаждают в морозильнике до около 0-4°С. Добавляют около 0,5 мл воды с последующим добавлением около 200 мл хлороформа. Добавляют безводный сульфат натрия и после встряхивания отфильтровывают соли.

Затем раствор пропускают через колонку с силикагелем (2,5×5 см). Далее колонку промывают смесью хлороформ/метанол (10/1) до получения бесцветного элюата. Объединенную фракцию, содержащую продукт, элюируют метанолом. Метанольный элюат выпаривают и остаток растворяют в 30% буферном растворе ацетонитрила в формиате аммония (pH 4,0, 0,5%) и выделяют с помощью препаративной ВЭЖХ. Используют фенильную колонку и отделение продукта от других примесей достигают использованием градиента ацетонитрила/формиата аммония (от 27 до 30% ацетонитрила в течение около 30 мин).

Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, разбавляют приблизительно равным объемом воды. Раствор пропускают через препаративную фенильную колонку для ВЭЖХ. Колонку элюируют водой для удаления солей. Затем продукт элюируют метанолом. Метанольный элюат концентрируют, и продукт осаждают добавлением этилового эфира, содержащего хлористый водород, и собирают фильтрованием с получением 600 мг 13-дезокси доксорубицин гидрохлорида. Выход составляет 80%.

Данные тонкослойной хроматографии (ТСХ):

Данные УФ спектров: max=233, 252, 293, 485 нм.

Данные масс спектрометрии (MS):

530 (M+ H)

Данные 1H ЯМР-спектров (метанол d4 ): (смотри ниже)

1,30 (d, 3H, 6’-СН3),

1,85 (m, 2H, 13-Н 2),

2,05 (m, 2H, 10-Н2),

2,60 (d, 1H, 12-Н),

3,05 (d, 1H, 12-Н),

3,55 (m, 1H, 5’-Н),

3,90 (m, 2H, 14-Н2),

4,05 (s, 3H, O-СН 3),

4,25 (m, 1H, 4’-H),

4,95 (m, 1H, 3’-Н),

5,40 (m, 1H, 1'-Н),

7,55 (d, 1Н, 3-Н),

7,85 (d, 1H, 2-H),

7,95 (d, H, 1-Н).

Около 600 мг очищенного 13-дезокси доксорубицина растворяют в около 60 мл метиленхлорида и около 10 мл воды и обрабатывают около 180 мг гидрокарбоната калия и около 180 мг ди-трет-бутилдикарбоната при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч. Органический раствор отделяют, промывают водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Раствор выпаривают досуха и остаток растворяют в около 100 мл безводного метанола. Раствор, насыщенный аммиаком, выдерживают при температуре от около 0°С до около 4°С в течение 48 ч. Растворитель и аммиак удаляют в вакууме с получением 3’-N-Вос-5-имино-13-дезокси доксорубицина, который обрабатывают около 60 мл безводного метанола, содержащего около 0,1 М хлористого водорода, при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч для удаления 3’-N-Boc-группы. Полученный раствор концентрируют, а продукт выделяют с помощью препаративной ВЭЖХ. Фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, разбавляют приблизительно равным объемом воды. Раствор вводят в препаративную фенильную колонку для ВЭЖХ и элюируют водой для удаления солей. Продукт элюируют метанолом. Метанольный элюат подкисляют хлористым водородом в этиловом эфире и раствор концентрируют.

Добавляют этиловый эфир и образовавшийся осадок фильтруют с получением около 360 мг (60%) 5-имино-13-дезокси доксорубицин гидрохлорида.

Данные тонкослойной хроматографии (ТСХ): Rf=0,35.

Данные УФ спектров: max=222, 251, 310, 544, 585 нм.

Данные 1H ЯМР-спектров: (МеОН-d4).

1,30 (d, 3H, 6’-СН3),

1,85 (m, 2H, 13-Н 2),

2,10 (m, 2H, 10-H2),

2,60 (d, 1Н, 12-Н),

2,75 (d, 1H, 12-Н),

2,95 (d, 1H, 12-Н),

3,50 (m, H, 5’-H),

3,90 (m, 2H, 14-Н2),

4,15 (s, 3Н, O-СН3),

4,25 (m, 1Н, 4’-Н),

5,10 (m, 1H, 3’-Н),

5,60 (m, 1H, 1’-Н),

7,50 (d, 1H, 3-Н),

7,80 (d, 1H, 2-Н),

8,05 (d, 1H, 1-Н).

Данные масс-спектрометрии (MS): 529 (M+H)

Настоящее изобретение предлагает также соединения, имеющие следующую формулу:

Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую по крайней мере одно производное 5-имино-13-дезокси антрациклина.

Кроме того, настоящее изобретение еще предлагает способ лечения рака, лейкозов, лимфом и твердых опухолей. Способ включает стадию введения эффективного количества по крайней мере одного производного 5-имино-13-дезокси антрациклина. Дозировки будут аналогичны известным соединениям. Благодаря их аналогии с известными соединениями, специалист в этой области будет способен определить схемы лечения, приводящие к аналогичной эффективности, без излишнего экспериментирования. Однако, как обсуждалось выше, настоящее изобретение обеспечивает значительно уменьшенные побочные эффекты, включая пониженную кардиотоксичность.

Настоящее изобретение также предлагает способ лечения аутоиммунных заболеваний или иммунодефицитных нарушений, таких как СПИД (AIDS). Способ включает стадию введения эффективного количества по крайней мере одного производного 5-имино-13-дезокси антрациклина.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

Сравнительная оценка кардиотоксичности доксорубицина, GPX-150 и GPX-100 на хронической модели кроликов

Описание эксперимента

Двадцать четыре белых новозеландских кролика одного возраста весом 3,0 кг разбивают случайным образом на 4 группы (N=6 кроликов/группе). В данных группах постоянно применяют, соответственно, доксорубицин, GPX-150, GPX-100 и простой растворитель-наполнитель (0,9% NaCl) в качестве контроля. Дозу лекарства или наполнителя вводят внутривенно (iv) в ушную вену два раза/неделю (по вторникам и пятницам). Каждую неделю (по понедельникам) отбирают пробы сыворотки и крови, а для оценки работы сердца еженедельно или через неделю (по четвергам) проводят М-эхокардиографическое обследование с получением данных фракционного сокращения левого желудочка (LVFS). Ежедневно оценивают потребление корма, а массу тела измеряют еженедельно (см. фиг.6). Контрольные кролики получают то же количество корма, что и кролики, на которых испытывают доксорубицин (парное кормление). После забивания животных получают образцы свободных стенок верхушки сердца и левого желудочка, которые сохраняют в 4%-ном глутаральдегиде (рН 7,4) для гистологического исследования и анализа посредством световой и трансмиссионной электронной микроскопии. Образцы ткани левого желудочка получают также для оценки кардиологических уровней антрациклинов и метаболитов. Кроликов забивают при появлении кардиотоксичности (LVFS <30% или снижение LVFS на 10% единиц, т.е. с 42% до 32% LVFS), проявлениях угрозы жизни или токсичности, вызывающей слабость (т.е. при сильной миелосупрессии или мукозите), или через 13 недель после начала исследования.

Схема дозирования

Оптимальные противоопухолевые дозы GPX-100 приблизительно в два раза превышают дозы доксорубицина, в то время как оптимальные противоопухолевые дозы GPX-150 превышают оптимальные дозы доксорубицина в 4-8 раз. Таким образом, были выбраны такие дозы GPX-100 и GPX-150, которые в два раза (для GPX-100) и в 7 раз (для GPX-150) превышают кумулятивную кардиотоксическую дозу доксорубицина (17,5 мг/кг). Доксорубицин вводят в дозе 1,25 мг/кг два раза/неделю в течение 7 недель (кумулятивная доза 17,5 мг/кг), GPX-100 вводят в дозе 2 мг/кг два раза/неделю в течение 10 недель (кумулятивная доза 40 мг/кг), а GPX-150 вводят в дозе 5 мг/кг два раза/неделю в течение 12 недель (кумулятивная доза 120 мг/кг).

Результаты

Наиболее чувствительным к действию доксорубицина типом клеток крови оказались красные кровяные клетки (RBC). На фиг.9 продемонстрировано, что контрольный уровень ВВС (верхний график - Еженедельные уровни RBC) оставался стабильным на протяжении всего эксперимента. В течение двух недель после начала эксперимента по введению аналогов антрациклина уровень RBC снижается во всех группах по сравнению с контролем (фиг.9). Действие GPX-150 на RBC является средним между воздействием доксорубицина и GPX-100, однако значительно отличается от контроля на протяжении эксперимента. Величина RBC в группе, получающей доксорубицин, возрастает через 7 недель и возвращается к значениям, соответствующим контролю, в связи с прекращением лечения доксорубицином на седьмой неделе. Воздействие GPX-100 на уровни RBC и гематокрит (НТС) продолжает снижаться на протяжении всего исследования (см. фиг.10). К концу эксперимента два кролика, получающие GPX-100, имеют гематокрит ниже 10%, а один из кроликов этой группы умирает во время эксперимента. Хотя причина смерти остается неизвестной, одним из факторов, способствующих его гибели, могла быть анемия.

Подсчет белых кровяных клеток (WBC) показал, что их уровень в меньшей степени подвержен действию антрациклинов, чем RBC (см. фиг.8, верхний график - Еженедельные уровни WBC). GPX-100 и GPX-150 приводят к такому снижению числа WBC, которое сходно с реакцией на действие доксорубицина. Значения антрациклиновых групп отличаются от контрольных значений между 3 и 7 неделями. Группа, получающая GPX-100, была единственной группой, леченной антрациклином, которая имела существенно более низкое число нейтрофилов, чем контрольная группа (см. фиг.11 - Еженедельные уровни нейтрофилов).

Подводя итог, можно заключить, что при используемых в данных экспериментах дозах GPX-100 вызывает равное или большее снижение числа кровяных клеток, чем доксорубицин. Хотя GPX-150 также подавляет число кровяных клеток по сравнению с контролем, его величина в целом занимает промежуточное значение между той же величиной в доксорубициновой и контрольной группах.

Дозы GPX-100 и доксорубицина приводят к ухудшению прибавки в весе по сравнению с контрольными кроликами. Действие доксорубицина, приводящее к замедлению прибавки веса по сравнению с контролем, нельзя объяснить различиями в потреблении корма, т.к. контрольная группа кроликов и доксорубициновая группа кроликов находятся в условиях парного кормления. GPX-100 вызывает аналогичные снижение потребления корма и замедление прибавки веса в сравнении с кроликами, леченными доксорубицином. Кролики, леченные GPX-150, показывают большее потребление корма по сравнению с контрольными кроликами (поскольку контрольная и доксорубициновая группы кроликов получают парное кормление), хотя они не имеют большую прибавку в весе, чем контрольные кролики, из чего можно предположить, что GPX-150 может также вмешиваться в механизмы, связанные с прибавкой веса у кроликов.

Доксорубицин вызывает сильную токсичность, которая не наблюдается в группах, леченных GPX-100 или GPX-150. У четырех из шести кроликов, леченных доксорубицином, был сильный мукозит, у двух сильно вздулись и кровоточили рот и губы. Эти эффекты (мукозит, вздутие или кровотечение из губ) не наблюдались ни у одного из кроликов, леченных GPX-100 или GPX-150. У трех из шести кроликов, леченных доксорубицином, наблюдалось истощение скелетных мышц, а у двух - отек (задних конечностей и стенки грудной клетки). Ни у одного из кроликов, леченных GPX-100 или GPX-150, не наблюдалось истощения мускулатуры, хотя у одного кролика, леченного GPX-100, при забивании был небольшой отек стенки грудной клетки. Все кролики, леченные доксорубицином, отличаются выпадением шерсти, т.е. шерсть выпадает либо умеренно, либо очень сильно. Только у двух из пяти кроликов, леченных GPX-100, выпала шерсть, а у четырех из шести кроликов, леченных GPX-150, выпадение шерсти было значительным.

GPX-100 вводят в максимально переносимой дозе, и один из шести кроликов, леченных GPX-100, погиб в конце эксперимента и не был обследован. К концу опыта кролики, леченные GPX-100, были вялыми, с бледными ушами, носом и глазами, а 4 из 5 кроликов были холодными на ощупь. Такие симптомы не наблюдаются у других кроликов, леченных GPX-150 или доксорубицином.

Доксорубицин также вызывает нарушение сердечной деятельности, что оценено с помощью М-эхокардиографии (LVFS). Еженедельные данные эхографии (см. фиг.7) показывают прогрессирующее снижение фракционных сокращений левого желудочка (LVFS) после шести недель лечения доксорубицином. После забивания животных все шесть кроликов, леченных доксорубицином, имеют сердечные дисфункции по данным эхокардиографии, а LVFS у них значительно отличается от значений в контрольной группе (Р<0,001). В противоположность этому, ни один из кроликов, леченных GPX-100 или GPX-150, в любой момент времени по ходу эксперимента не имеет каких-либо нарушений сердечной деятельности по данным эхокардиографии.

При забивании выделяют левое предсердие, разделяют его пополам и для оценки сердечной деятельности исследуют обе половинки в ванночке для тканей, где во время всего исследования остается постоянной предварительная нагрузка и нагрузка после опыта. Предсердие, полученное от кроликов, леченных доксорубицином, характеризуется ухудшением сердечной сократимости (dF/dt) по сравнению с контролем на протяжении целого диапазона сила-частота (1, 2 и 3 Гц). Для предсердия, полученного от кроликов, леченных GРХ-100 и GPX-150, не характерно ухудшение dF/dt по сравнению с контролем. Сердечную сократимость оценивают также по первому сокращению, следующему за 20-, 30- и 60-секундными интервалами отдыха (20-, 30- и 60-секундные PRP). Усиленная сократимость следует в результате увеличения запасов кальция в саркоплазматическом ретикулуме (SR), который образуется во время интервала отдыха, а такие лекарства, как доксорубицин и кофеин, которые влияют на функционирование SR, также воздействуют на перерывы сердцебиений. Как и ожидалось, доксорубицин значительно ухудшает сократимость (dF/dt) сердцебиений периода отдыха (см. фиг.12), но сократимость (dF/dt) предсердия, полученного от кроликов, леченных GРХ-150, не ухудшилась по сравнению с контрольными значениями. Сократимость (dF/dt) сердцебиений периода отдыха предсердия, полученного от кроликов, леченных GPX-100, имеет промежуточные значения, которые значительно отличаются от значений контроля и доксорубицина.

Выводы

При одинаковых миелосупрессивных дозах GPX-100, GPX-150 и доксорубицина, кролики, леченные GPX-100 и GPX-150, не имеют сердечных дисфункций in vivo, оцененных по LVFS, а все кролики, леченные доксорубицином, имеют различные нарушения сердечной деятельности in vivo. Ленты предсердия, полученного от кроликов, леченных GPX-150, при забивании не имеют изменений в сократимости (dF/dt) no сравнению с контролем. Предсердие, полученное от кроликов, леченных доксорубицином, демонстрирует ухудшенную сократимость (dF/dt) при всех частотах сердцебиения и при потенцированных сердцебиениях периода отдыха. Предсердие, полученное от кроликов, постоянно леченных GPX-100, не показывает каких-либо ухудшений в сократимости (dF/dt) на протяжении всего исследованного диапазона сила-частота, но оно имеет ухудшение сократимости потенцированных сердцебиений периода отдыха. Кроме того, кролики, леченные GPX-100 и GPX-150, имеют меньше проявлений стоматита (мукозита) и истощения мускулатуры, чем кролики, леченные доксорубицином.

Сравнительные исследования противоопухолевой активности GPX-100, GPX-150 и доксорубицина in vivo.

1. Краткое изложение эксперимента. Противоопухолевую активность GPX-100, GPX-150 и доксорубицина in vivo исследуют на модели мышиной лейкемии с применением мышей CD2F1, которым инъецируют клетки P388D1 (полученные от мыши раковые клетки лейкемии). Мышам CD2F1 внутрибрюшинно (ip) вводят 1 млн. клеток P388D1 в двух подгруппах мышей. Подгруппа 1 состояла из 10 групп по 10 мышей/группе, а подгруппа 2 состояла из 7 групп по 10 мышей/группе. Мышей CD2F1 случайным образом распределяли по экспериментальным группам.

В подгруппе 1 исследуют две дозы доксорубицина (dox) (0,8 мг/кг и 1,6 мг/кг непрерывно вводят в течение 9 дней в дни 1-9 эксперимента), три дозы GPX-100 (1,6 мг/кг, 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг вводят по той же схеме, как dox) и четыре дозы GPX-150 (0,8 мг/кг, 1,6 мг/кг, 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг вводят по той же схеме, как dox). Определяют величину показателя Т/С леченных мышей (выраженное в процентах отношение значений в леченных группах к значениям в контрольной группе) для 20%-ного, среднего и 80%-ного времени выживания (см. таблицы 2-4). Dox проявляет ожидаемую противоопухолевую активность, но GPX-100 и GPX-150 также проявляют противоопухолевую активность. Более того, GPX-150 дает наивысшее значение Т/С из наблюдаемых в ходе эксперимента (200% при 20%-ном времени выживания, табл. 2).

Опыты, проведенные в подгруппе 2, имеют цель выяснения и распространения зависимости доза-эффект на использование 3 лекарственных средств в подгруппе 1. В качестве стандарта для сравнения выбирают дозу dox 0,8 мг/кг.

Дозы GPX-100 2,4 и 3,2 мг/кг приводят к ответным Т/С, которые сходны с ответными Т/С на действие dox (см. таблицы 2-4). Подобно результатам, полученным в подгруппе 1, наилучшие ответные Т/С в эксперименте наблюдаются при использовании GPX-150 (в дозе 9,6 мг/кг) во всех трех категориях времени выживания (т.е. 215%, 155% и 137% при 20%-ном, среднем и 80%-ном времени выживания, соответственно).

GPX-100 и GPX-150 в дозах, использованных в данном исследовании, демонстрируют противоопухолевую активность, которая равна или превосходит активность, проявляемую доксорубицином. В дозах, использованных в данном исследовании, GPX-150 дает наивысший противоопухолевый эффект, по сравнению с эффектом доксорубицина или GPX-100. Хотя в данных опытах GPX-150 оказался более эффективным, чем доксорубицин или GPX-100, он был менее сильным, чем GPX-100 или доксорубицин. Таким образом, GPX-100 и GPX-150 обладают противоопухолевой активностью на модели Р388 мышиной лейкемии.

2. Здания и оборудование.

Эксперименты проведены на базе следующих научных учреждений:

Mountain States Medical Research Institute

190 E. Bannock

Boise, ID 83172

Veteran Affairs Medical Center

500W. Fort Street

Boise, ID 83702

3. Спонсор. Gem Pharmaceuticals, Inc.

Pelham, AL

4. Цель исследования. Задача заключалась в том, чтобы определить, будут ли GPX-100 и GPX-150 проявлять противоопухолевую активность, равную активности доксорубицина, на модели Р388 мышиной лейкемии мышей CD2F1, инъецированных клетками Р388.

5. Методы

а) cведения о материалах, использованных в опытах:

GPX-100 (производства фирмы GEM, LOT # Q200698273; 31 мая 2000 г.) отвешивали для каждой дозы ежедневно и готовили в солевом растворе (0,9% NaCl). Лекарственное вещество хранили в холодильнике (4°С). Доксорубицин (производства фирмы GEM) отвешивали для каждой дозы ежедневно и готовили в солевом растворе. Лекарственное вещество хранили в холодильнике (4°С).

Клетки Р388 получены в коллекции АТСС 22 мая 1998 г. (LOT # 946949). GPX-150 получен от фирмы SynQuest, Inc., LOT # SMT-8-172-23-26, 26 октября 2000 г.

б) cведения о животных:

Самцы мышей CD2F1 весили 25-30 г в начале эксперимента. Исследование проводилось с 7 марта по 21 июля 2001 г.

6. Тест-протокол

В день 0 мышам CD2F1 делают внутрибрюшинную инъекцию (ip) 1,6 млн. свежесобранных опухолевых клеток Р388. Мышей разделяют на 2 подгруппы: подгруппа 1 состоит из 10 групп по 10 мышей/группе, а подгруппа 2 состоит из 7 групп по 10 мышей/группе.

Подгруппа 1 включает в себя следующие 10 групп мышей:

1) контрольная группа (100 мкл солевого раствора/мышь вводят ip в дни 1-9, n=10);

2) dox группа (0,8 мг/кг dox вводят ip в дни 1-9, n=10);

3) dox группа (1,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

4) GPX-100 группа (1,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

5) GPX-100 группа (3,2 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

6) GPX-100 группа (6,4 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

7) GPX-150 группа (0,8 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

8) GPX-150 группа (1,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

9) GPX-150 группа (3,2 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

10) GPX-150 группа (6,4 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10).

Подгруппа 2 включает в себя следующие 7 групп мышей:

1) контрольная группа (100 мкл солевого раствора/мышь вводят ip в дни 1-9, n=9);

2) dox группа (0,8 мг/кг dox вводят ip в дни 1-9, n=9);

3) GPX-100 группа (2,4 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=9);

4) GPX-100 группа (3,2 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=9);

5) GPX-150 группа (9,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

6) GPX-150 группа (12,8 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10);

7) GPX-150 группа (25,6 мг/кг вводят ip в дни 1-9, n=10).

Мышей взвешивают через день и для каждой группы строят график массы тела на протяжении всего эксперимента. На протяжении всего эксперимента ежедневно контролируют смертность. Результаты в каждой группе выражают в виде процентного увеличения периода жизни леченных мышей (Т) по сравнению с контрольными (С); (Т/С х 100).

7. Результаты

Исследована противоопухолевая активность GPX-100 и GPX-150 и докоорубицина in vivo на модели мышиной лейкемии с применением мышей CD2F1, которым были инъецированы клетки P388D1 (полученные от мыши раковые клетки лейкемии). Мышам CD2F1 внутрибрюшинно (ip) вводили 1 млн. клеток P388D1 в двух подгруппах мышей. Подгруппа 1 состояла из 10 групп по 10 мышей/группе, а подгруппа 2 состояла из 7 групп по 10 мышей/группе. Мышей CD2F1 случайным образом распределяли по экспериментальным группам.

В подгруппе 1 исследовали две дозы доксорубицина (dox) (0,8 мг/кг и 1,6 мг/кг непрерывно вводят в течение 9 дней в дни 1-9 эксперимента), три дозы GPX-100 (1,6 мг/кг, 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг вводят по той же схеме, как dox) и четыре дозы GPX-150 (0,8 мг/кг, 1,6 мг/кг, 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг вводят по той же схеме, как dox). Определена величина показателя Т/С леченных мышей (выраженное в процентах отношение значений в леченных группах к значениям в контрольной группе) для 20%-ного, среднего и 80%-ного времени выживания (см. таблицы 2-4).

Наилучший эффект от действия доксорубицина был получен в дозе 0,8 мг/кг, поскольку доза 1,6 мг/кг оказалась токсичной при 80%-ном времени выживания (значения Т/С были меньше 100% (82% по данным таблицы 4)). Однако значения Т/С для дозы dox 1,6 мг/кг оказались сходными с дозами dox 0,8 мг/кг при 20%-ном и среднем времени выживания (по данным таблиц 2 и 3, 157% против 152% и 135% против 147%, соответственно).

Дозы GPX-100 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг также оказались токсичными и давали значения Т/С меньше 100% для обеих доз при 20%-ном, среднем и 80%-ном времени выживания (таблицы 2-4). Доза GPX-100 1,6 мг/кг приводила к значениям Т/С, сходными со значениями Т/С при действии dox в дозе 0,8 мг/кг (таблицы 2-4).

Доза GPX-150 6,4 мг/кг приводила к наибольшим значениям Т/С во всех группах подгруппы 1 при 20%-ном времени выживания (Т/С=200%, таблица 2). Тем не менее, значения Т/С от действия GPX-150 при среднем и 80%-ном времени выживания оказались равными для доз 3,2 мг/кг и 6,4 мг/кг (142% против 142% и 153% против 153%, соответственно, по данным таблиц 3 и 4).

Опыты, проведенные в подгруппе 2, имели целью выяснить и распространить зависимость доза-эффект на использование 3 лекарственных средств в подгруппе 1. В качестве стандарта для сравнения использовалась доза dox 0,8 мг/кг.

Дозы GPX-100 2,4 и 3,2 мг/кг приводили к ответным Т/С, которые оказались сходными с ответными Т/С на действие dox (см. таблицы 2-4). Подобно результатам, полученным в подгруппе 1, наилучшие ответные Т/С в эксперименте наблюдались при использовании GPX-150 (в дозе 9,6 мг/кг) во всех трех категориях времени выживания (т.е. 215%, 155% и 137% при 20%-ном, среднем и 80%-ном времени выживания, соответственно).

8. Обсуждение и выводы

GPX-100 и GPX-150 в дозах, использованных в данном исследовании, демонстрируют противоопухолевую активность, которая равна или превосходит активность, проявляемую доксорубицином. В дозах, использованных в данном исследовании, GPX-150 дает наивысший противоопухолевый эффект, по сравнению с эффектом при действии доксорубицина или GPX-100. Хотя в данных опытах GPX-150 оказался более эффективным, чем доксорубицин или GPX-100, он является менее сильным, чем GPX-100 или доксорубицин. Таким образом, GPX-100 и GPX-150 обладают противоопухолевой активностью, исследованной на модели Р388 мышиной лейкемии.

Приведенное выше описание иллюстрирует и описывает настоящее изобретение. Кроме того, раскрытое в описании иллюстрирует и описывает только предпочтительные варианты осуществления изобретения, но, как отмечалось выше, должно быть понятно, что изобретение может использоваться в различных других комбинациях, модификациях в пределах объема притязаний изобретения, как они представлены здесь, в соответствии с вышеприведенными рекомендациями и/или опытом, или знаниями в данной области техники. Варианты осуществления, описанные здесь выше, предполагают, кроме того, объяснение лучших известных форм практики изобретения и дают возможность другим специалистам в этой области использовать изобретение в таких или других вариантах и с различными модификациями, требуемыми конкретными применениями или использованием изобретения. Таким образом, описание не предполагает ограничения изобретения в форме, описанной здесь. Кроме того, оно предполагает, что прилагаемая формула изобретения может быть составлена с включением альтернативных вариантов.

Формула изобретения

1. Производные 5-имино-13-дезокси антрациклина формулы

где R1, R2 и R3 являются Н, ОН или ОСН3 группой;

R4 представляет собой следующие группы:

2. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая по крайней мере одно производное 5-имино-13-дезокси антрациклина по п.1.

3. Способ лечения рака, аутоиммунных заболеваний или иммунодефицитных нарушений, отличающийся тем, что он включает введение эффективного количества по крайней мере одного производного 5-имино-13-дезокси антрациклина по п.1.

4. Способ получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина, отличающийся тем, что осуществляют восстановление антрациклин 13-тозилгидразона цианборгидридом натрия в безводном метаноле при рН около 7,0 или ниже в присутствии п-толуолсульфокислоты посредством осторожного кипячения раствора с обратным холодильником в атмосфере азота при температуре приблизительно 75°С, затем реакционную смесь охлаждают, обрабатывают водой и хлороформом, добавляют к раствору безводный сульфат натрия, отфильтровывают осадок, а фильтрат разделяют на колонке с силикагелем, промываемой градиентом хлороформ/метанол, при этом продукт 13-дезокси антрациклина элюируют метанолом, после чего проводят дальнейшую очистку метанольного элюата с помощью препаративной ВЭЖХ, затем к раствору очищенного 13-дезокси антрациклина в смеси метиленхлорида и воды добавляют гидрокарбонат калия и ди-трет-бутил-дикарбонат, выделяют полученный 3’-N-Вос-дезокси антрациклин, растворяют его в безводном метаноле, охлаждают полученный раствор и проводят аминирование 3’-N-Вос-13-дезокси антрациклина посредством насыщения раствора аммиаком при температуре около 0-4°С, затем удаляют растворитель и аммиак, растворяют остаток в безводном метаноле, удаляют 3’-N-Вос-группу в кислой среде и с помощью препаративной ВЭЖХ выделяют целевой продукт, который при необходимости превращают в гидрохлорид 5-имино-13-дезокси антрациклина.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанное кипячение с обратным холодильником проводят при температуре от около 68°С до около 72°С.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанное кипячение с обратным холодильником проводят в отсутствие кислорода.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанное кипячение с обратным холодильником проводят в отсутствие воды.

8. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанное кипячение с обратным холодильником проводят в атмосфере азота.

9. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанное кипячение с обратным холодильником проводят в атмосфере инертного газа.

10. Способ по п.4, отличающийся тем, что аминирование проводят в отсутствие воды.

11. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанные процессы приводят к выходу производного 5-имино-13-дезокси антрациклина около 40%.

12. Способ получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина, отличающийся тем, что готовят кислый раствор антрациклин 13-тозилгидразона с цианборгидридом, осторожно кипятят раствор с обратным холодильником, реакционную смесь охлаждают, добавляют воду и галогенсодержащий углеводородный растворитель, реакционную смесь высушивают с использованием безводного сульфата натрия, фильтруют, полученный фильтрат пропускают через колонку для препаративной хроматографии с выделением производного 13-дезокси антрациклина, затем фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, пропускают через колонку ВЭЖХ с обращенной фазой для удаления неорганических солей, после этого готовят щелочной раствор 13-дезокси антрациклина, в котором проводят реакцию с ди-трет-бутилдикарбонатом, экстрагируют полученные Вос-защищенные производные, раствор обрабатывают аммиаком при температуре около 0-4°С, упаривают растворитель и аммиак, обрабатывают остаток кислым раствором и полученный раствор выпаривают и пропускают через колонку для препаративной ВЭЖХ с выделением 5-имино-13-дезокси антрациклина, после чего фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, пропускают через колонку ВЭЖХ с обращенной фазой для удаления неорганических солей и выделяют целевой продукт.

13. Способ получения производных 5-имино-13-дезокси антрациклина, отличающийся тем, что растворяют около 1 г доксорубицин 13-тозилгидразон гидрохлорида и 2,4 г п-толуолсульфокислоты в около 50 мл безводного метанола, добавляют около 0,8 г цианборгидрида натрия к раствору, нагревают полученный раствор до температуры от около 68°С до около 72°С, осторожно кипятят раствор с обратным холодильником в течение приблизительно 1 ч в атмосфере азота, концентрируют реакционную смесь до около 20 мл, охлаждают реакционную смесь в морозильнике до температуры от около 0°С до около 4°С, добавляют около 0,5 мл воды к реакционной смеси, добавляют около 200 мл хлороформа к реакционной смеси, добавляют безводный сульфат натрия к реакционной смеси, отфильтровывают соль, пропускают раствор через колонку с силикагелем, далее промывают колонку смесью хлороформ/метанол до получения бесцветного элюата, элюируют метанолом фракцию, содержащую продукт, выпаривают метанольный элюат, растворяют остаток, полученный после выпаривания, в 30%-ном буферном растворе ацетонитрила в формиате аммония, выделяют продукт с помощью препаративной ВЭЖХ с использованием фенильной колонки, отделяют продукт от других примесей с использованием градиента ацетонитрил/формиат аммония, разбавляют водой фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, пропускают раствор через препаративную фенильную колонку ВЭЖХ, промывают колонку водой, элюируют продукт метанолом, концентрируют раствор до около 5 мл, осаждают продукт добавлением около 10 мл диэтилового эфира, фильтруют осадок с получением около 600 мг твердых 13-дезокси антрациклинов, которые растворяют в около 60 мл метиленхлорида и около 10 мл воды, добавляют около 180 мг гидрокарбоната калия и около 180 мг ди-трет-бутилдикарбоната и проводят реакцию в растворе при температуре около комнатной в течение приблизительно 2 ч, после чего отделяют органический раствор, промывают его водой, высушивают раствор безводным сульфатом натрия, выпаривают растворитель, растворяют остаток в около 100 мл безводного метанола, выдерживают раствор в атмосфере, насыщенной аммиаком, при температуре около 0-4°С в течение 48 ч, выпаривают раствор, растворяют остаток в около 60 мл безводного метанола, содержащего около 0,1 М хлористого водорода, проводят реакцию в растворе при температуре около комнатной температуры в течение около 2 ч, концентрируют раствор до около 5 мл, выделяют продукт с помощью препаративной ВЭЖХ с использованием фенильной колонки, отделяют продукт от других примесей с использованием градиента ацетонитрил/формиат аммония, разбавляют водой фракцию, очищенную с помощью ВЭЖХ, пропускают раствор через фенильную колонку для ВЭЖХ, промывают ее водой, элюируют продукт метанолом, концентрируют раствор до около 5 мл, превращают продукт в гидрохлоридную соль, осаждают продукт 10 мл диэтилового эфира и фильтруют осадок с получением около 360 мг твердого 5-имино-13-дезоксиантрациклин гидрохлорида.

РИСУНКИ



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к органической химии и может найти применение в медицине

Изобретение относится к органической химии и может найти применение в медицине

Изобретение относится к области медицины и касается применения производных антрациклина и новых производных антрациклина для лечения амилоидоза, а также фармацевтических композиций, содержащих указанные соединения

Изобретение относится к конъюгатам терапевтически применяемых антрациклинов с носителями, такими, как поликлональные и моноклональные антитела, или белки, или пептиды природного или искусственного происхождения, со способами их получения, с фармацевтическими композициями, содержащими эти конъюгаты, и с использованием этих композиций при лечении некоторых опухолей млекопитающих

Изобретение относится к ветеринарии

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии

Изобретение относится к области медицины

Изобретение относится к медицине, в частности к гематологии

Изобретение относится к медицине, а именно гнойной хирургии

Изобретение относится к производным 5-имино-13-дезокси антрациклина формулы где R1, R2 и R3 являются Н, ОН или ОСН3 группой и R4 представляет собой следующие группы: Предложена фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью, содержащая по крайней мере одно производное 5-имино-13-дезокси антрациклина

Наверх