Способ получения гамма-аминомасляной кислоты (гамк)

 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) с использованием ауксотрофной по L-изолейцину бактерии Escherichia coli. Указанную бактерию выращивают в питательной среде, содержащей не менее 100 мг/л L-изолейцина, затем выделяют гамма-аминомасляную кислоту из культуральной жидкости. Данное изобретение позволяет увеличить выход ГАМК. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

Область техники

Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности и медицине и касается способа получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) с использованием ауксотрофных по L-изолейцину бактерий, принадлежащих к роду Escherichia.

Предшествующий уровень техники

Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) считается одним из основных ингибирующих аминокислотных медиаторов нервных импульсов в мозгу млекопитающих. Будучи широко (хотя и неравномерно) распространенным в мозгу млекопитающих, ГАМК является, как предполагается, медиатором приблизтельно 30% синапсов в мозгу. ГАМК является посредником в множестве функций синапсов посредством образования комплексов с белками (рецепторами ГАМК), расположенными как на клетках, так и на нервных окончаниях. Постсинаптический ответ на ГАМК происходит путем изменения проводимости хлоридов, что, как правило, хотя и не обязательно, приводит к гиперполяризации клетки (WO 0200221 A1). Поскольку ГАМК является эффективным нейромедиатором, она используется в медицине для лечения нарушений мозговой деятельности, таких как амнезия, парафазия (нарушение речи), гемиплегия (паралич половины тела), гипертонии и других. Также ГАМК может использоваться в качестве карциностатического агента (JP 60139622 A2).

Известны химические методы синтеза ГАМК (Garmaise et al, Canad. J.Chemistry, 1956, 34, 742-748; Авторское свидетельство СССР №452196). Для медицинских целей также может быть испльзована пища, обогащенная ГАМК. Известны различные продукты, получаемые из растений, обогащенных ГАМК. К ним относятся листья чая (выложенная заявка Японии 9-205989), листья кофе (выложенная заявка Японии 8-173111), растения рода крестоцветных и их сок (Европейская заявка ЕР 1082911 А2), нитевидные грибы (JP 2000060536 A2), порошок или сок растений вида Brassicaceous (JP 2001136929 А2) и другие.

Описаны микробиологические способы получения ГАМК с использованием бактерий Е. coli ВКПМ В-7460 и ВКПМ В7452, содержащих плазмиду с геном глутаматдекарбоксилазы (патент РФ №2143002), Bad. cadaveris ATCC 9760 (JP69-01197), Е. coli ATCC 9637 (JP70-15437) и Arthrobacter simplex ATCC 15799 (JP69-01196).

Но до настоящего времени не было сообщений, описывающих тот факт, что ауксотрофные по L-изолейцину бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, могут продуцировать ГАМК в условиях, когда такие бактерии выращиваются в питательной среде, содержащей значительное количество L-изолейцина.

Описание изобретения

Объектом настоящего изобретения является способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), включающий стадии выращивания ауксотрофной по L-изолейцину бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в питательной среде, содержащей значительное количество L-изолейцина.

Цель была достигнута путем установления того факта, что ауксотрофные по L-изолейцину бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, в ходе выращивания в питательной среде, содержащей L-изолейцин в количестве, большем, чем это необходимо для комплементации ауксотрофии по L-изолейцину, могут продуцировать ГАМК.

Таким образом было совершено настоящее изобретение.

Так, настоящее изобретение включает следующее.

1) Способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), включающий стадии:

- выращивания ауксотрофной по L-изолейцину бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в питательной среде, содержащей не менее 100 мг/л L-изолейцина, с целью продукции и накопления гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), и

- выделения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) из культуральной жидкости.

2) Способ в соответствии с 1), в котором бактерия модифицирована с целью увеличения экспрессии генов биосинтеза L-глутамата.

3) Способ в соответствии с 1), в котором используется бактерия Escherichia coli VL334thrC⁺ или Escherichia coli 702ilvA (ВКПМ B-8012).

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно. Способом согласно настоящему изобретению является способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), включающий стадии:

- выращивания ауксотрофной по L-изолейцину бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в питательной среде, содержащей не менее 100 мг/л L-изолейцина, с целью продукции и накопления гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), и

- выделения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) из культуральной жидкости. Термин “ауксотрофная по L-изолейцину бактерия” означает, что указанная бактерия требует наличия L-изолейцина в питательной среде для своего роста. В данном случае “ауксотрофной по L-изолейцину бактерией” является бактерия, которая требует наличия в питательной среде не менее 10 мг/л L-изолейцина. Поэтому концентрация L-изолейцина в питательной среде для ауксотрофной по L-изолейцину бактерии составляет обычно не менее 10 мг/л. Способы получения ауксотрофных по L-изолейцину бактерий хорошо известны и описаны, например, в Европейском патенте ЕР 1172433.

Термин “бактерия, принадлежащая к роду Escherichia” означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е. coif).

Примерами ауксотрофных по L-изолейцину бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, являются штаммы, дефицитные по гену ilvA, такие как штаммы Е. coli B7ILE (VKPM B-8013), VL334thrC⁺ 702ilvA (VKPM В-8012) и 237 (VKPM В-7925), описанные в Европейском патенте ЕР 1172433.

Авторы настоящего изобретения установили, что ауксотрофные по L-изолейцину бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, в ходе выращивания в питательной среде, содержащей L-изолейцин в количестве, большем, чем это необходимо для комплементации ауксотрофии по L-изолейцину, могут продуцировать ГАМК. Другими словами, в условиях, когда потребность в L-изолейцине не является фактором, лимитирующим рост ауксотрофных по L-изолейцину бактерий, выращивание указанных бактерий приводит к накоплению ГАМК в культуральной жидкости. Концентрация L-изолейцина должна быть не менее 100 мг/л. Детальный механизм установленного факта остается неустановленным.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка ГАМК из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых ГАМК продуцируется с использованием бактерий.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и необходимое количество L-изолейцина, необходимого для роста бактерии. Количество L-изолейцина, используемое в способе согласно настоящему изобретению, должно быть не менее 100 мг/л. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой кислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем ГАМК может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Наилучший способ осуществления изобретения

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на Примеры.

Пример 1. Продукция ГАМК с использованием дефицитного по гену ilvA штамма Е. coli VL334thrC⁺.

Штамм VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофным по L-изолейцину и L-треонину штаммом, содержащим мутации в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). Природный аллель гена thrC был перенесен методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е. coli К12 (ВКПМ В-7). В результате был получен ауксотрофный по L-изолейцину штамм VL334thrC⁺. Указанный штамм обладал способностью к продукции L-глутаминовой кислоты (Европейский патент ЕР 1172433).

Питательная среда для ферментации содержала 60 г/л глюкозы, 25 г/л сульфата аммония, 2 г/л КН₂ PO₄, 1 г/л MgSO₄, 0.1 мг/мл тиамина и 25 г/л мела (рН 7.2). L-изолейцин добавляли в различных концентрациях. Глюкозу и мел стерилизовали раздельно. 2 мл питательной среды были помещены в пробирки и инокулированы одной петлей микроорганизма. Выращивание проводили при 30°С в печение 3 дней с перемешиванием.

ГАМК определяли с помощью метода “Waters Accq-Tag Amino Acid Analysis Method” в соответствии с рекомендациями производителя. Указанный метод заключается в получении производных пептидов и аминокислот из гидролизованных белков перед нанесением на колонку с последующим разделением полученных производных с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с флюоресцентной детекцией. Коэффициент удерживания (RC) определяется как отношение времени удерживания пика вещества (RT) к времени удерживания L-фенилаланина (рН элюента 5.05). RC L-пролина = 0.695, RC ГАМК=0.701. Длина волны возбуждения флюоресцентного детектора была 250 нм, область длин волн испускания была 320-560 нм. Максимум испускания для L-пролина составлял 395 нм, максимум испускания для ГАМК составлял 395 нм и 460 нм. Подлинность ГАМК также была подтверждена методами масс-спектроскопии и ЯМР.

Количество ГАМК и L-глутаминовой кислоты измеряли с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол уксусная кислота вода =4:1:1). Результаты выращивания представлены в таблице 1.

Пример 2. Продукция ГАМК с использованием дефицитного по гену ilvA штамма Е. coli 702ilvA.

Штамм 702ilvA (ВКПМ В-8012) является штаммом, дефицитным по гену ilvA, и обладает способностью к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Штамм 702ilvA выращивали в тех же условиях, которые описаны в Примере 1. Результаты выращивания представлены в таблице 2.

Формула изобретения

1.Способ получения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), включающий стадии выращивания ауксотрофной по L-изолейцину бактерии Escherichia coli в питательной среде, содержащей не менее 100 мг/л L-изолейцина, и выделения гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) из культуральной жидкости.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактерия модифицирована с целью увеличения экспрессии генов биосинтеза L-глутамата.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют штамм бактерии Escherichia coli VL334thrC⁺ или Escherichia coli 702ilvA (ВКПМ В-8012).