Способ увеличения урожайности растения, способ контролирования режима цветения растения и конструкция днк для их осуществления
Изобретение относится к генной инженерии растений. Трансформация растения конструкцией ДНК, содержащей последовательность ДНК, которая кодирует белок, участвующий в метаболизме, усвоении и/или транспорте сахарозы, позволяет повысить урожайность растения за счет применения внешнего химического индуктора, обеспечивающего селективную транспортировку фиксированного углерода из фотосинтетически активной ткани растения в неактивную. Другим результатом применения внешнего химического индуктора является возможность контролирования режима цветения растения. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 18 ил.
Изобретение касается способа увеличения урожайности растений, конструкций ДНК, в состав которых входят последовательности ДНК, кодирующие белки, участвующие в процессах транспорта, метаболизма и усвоения сахарозы, которые оперативно связаны с контролируемой промоторной областью, и растениям, трансформированным указанными конструкциями. Главной особенностью данного изобретения является контролируемая продукция указанных белков, в результате которой происходит изменение характеристик роста растения, времени цветения и урожайности.
Фотосинтез является главным источником энергии, используемой для обеспечения биологических процессов у высших растений. Фотосинтезирующие клетки служат важнейшим источником фотоассимилятов, или органических соединений, производимых растениями в ходе фотосинтеза. Большая часть связанного органического углерода переносится от фотосинтезирующей ткани источника к органам, не способным к фотосинтезу, которые известны как поглотители, и которые являются той частью растения, где перенесенные питательные вещества либо используются, либо хранятся. Основным продуктом фиксации углерода в ходе фотосинтетической реакции является дисахарид сахароза.
Авторы изобретения обнаружили, что благодаря контролируемой экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих белки, которые участвуют в транспорте, метаболизме и усвоении сахарозы, осуществляемой с использованием индуцируемых промоторных систем, можно контролируемым путем изменять уровни сахарозы в растении так, чтобы вызвать желаемые изменения в цветении, и/или массе растения, и/или высоте в соответствующей фазе роста растения, тем самым устраняются некоторые вредные для растения эффекты и увеличивается общая урожайность растения. Применение контролируемых промоторных областей позволяет очень точно регулировать экспрессию указанных последовательностей ДНК, так что можно определить оптимальный уровень экспрессии, оптимальное время, когда экспрессируется последовательность ДНК, и оптимальную локализацию в растении.
По первому аспекту данного изобретения представлен способ увеличения урожайности растения, заключающийся в трансформации растения конструкциями ДНК, включающими в себя одну или более последовательностей ДНК, которые кодируют белки, участвующие в распознавании, транспорте, метаболизме и/или усвоении сахарозы, и которые оперативно связаны с контролируемой промоторной областью и необязательно оперативно связаны с терминатором транскрипции, а также в осуществлении контроля за уровнем, временем и пространственной локализацией экспрессии указанной последовательности (последовательностей) ДНК с указанной контролируемой промоторной области в результате применения внешнего химического индуктора, посредством чего увеличивается урожайность трансгенного растения.
В качестве наиболее предпочтительного варианта по первому аспекту данного изобретения представлен способ увеличения урожайности растения путем избирательного увеличения импорта фиксированного углерода в фотосинтетически неактивные поглощающие ткани, который заключается в трансформации растения конструкциями ДНК, включающими в себя одну или более последовательностей ДНК, которые кодируют белки, участвующие в распознавании, транспорте, метаболизме и/или усвоении сахарозы, и которые оперативно связаны с контролируемой промоторной областью и необязательно оперативно связаны с терминатором транскрипции, и в осуществлении контроля за уровнем, временем и пространственной локализацией экспрессии указанной последовательности (последовательностей) ДНК с указанной контролируемой промоторной области за счет применения внешнего химического индуктора, посредством чего избирательно усиливается транспорт фиксированного углерода из фотосинтетически активной ткани источника в фотосинтетически неактивную поглощающую ткань указанного трансгенного растения.
Употребляемый здесь термин “ткань источника” используется для обозначения фотосинтетически активных тканей растения, которые являются чистыми экспортерами фиксированного углерода, и термин “ткань поглотителя” обозначает такие фотосинтетически неактивные ткани растения, которые являются чистыми импортерами фиксированного углерода.
Экономически и практически желательно иметь возможность контролировать оба параметра: способность к цветению и время цветения растения. В некоторых случаях может быть желательной синхронизация цветения или переключение программы цветения на более ранние сроки, или манипулирование цветением так, чтобы оно удовлетворяло ограниченным условиям, обусловленным произрастанием в особых географических областях. В общем, увеличение количества цветущих растений отражается в увеличении конечного урожая, получаемого от растений, благодаря увеличению количества семян.
Сходным образом, увеличение веса сырой ткани растений, измеренной по увеличению площади листа, приводит к повышению урожайности за счет увеличения фотосинтетической способности растения.
Урожайность зависит, по меньшей мере, от двух параметров; (i) индукции поглотителя и (ii) роста поглотителя. Одним из факторов, стимулирующих индукцию поглотителя, может быть уменьшение снабжения поглощающей ткани ассимилятами. Это происходит, например, в том случае, когда индуцирована инвертаза листьев. Рост поглотителя зависит от количества ассимилятов, направленных в определенную поглощающую ткань. Этот процесс может быть стимулирован специфичной для данного поглотителя экспрессией инвертазы. Так как активность инвертазы отрицательно влияет на синтез крахмала, то химический контроль за экспрессией инвертазы несомненно обладает большими преимуществами, чем ее конститутивная экспрессия.
В том случае, когда индуцирована экспрессия инвертазы, усиленное снабжение поглотителя, вероятно, приводит к образованию более крупных клубней. Однако считается, что фенотип раннего цветения объясняется временным недостатком снабжения ассимилятами.
По второму аспекту данного изобретения представлен способ контролирования режима цветения растения, заключающийся в трансформации растения конструкцией ДНК, включающей в себя одну или более последовательностей ДНК, которые кодируют белки, участвующие в распознавании, транспорте, метаболизме и/или усвоении сахарозы, и которые оперативно связаны с контролируемой промоторной областью и необязательно оперативно связаны с терминатором транскрипции, а также в контроле за уровнем, временем и пространственной локализацией экспрессии указанной последовательности (последовательностей) ДНК с указанной контролируемой промоторной области путем применения внешнего химического индуктора, посредством чего изменяется режим цветения указанного трансгенного растения.
Способ обеспечения контролируемого режима цветения может применяться для ускорения цикла роста растения, так что может быть получено больше поколений.
Контролируемая промоторная область во всех упоминаемых здесь аспектах и вариантах данного изобретения преимущественно включает в себя индуцируемую переключающую промоторную систему, такую, например, как промоторная система, переключающая гены alcA/alcR, описанная в опубликованной заявке на международный патент № WO 93/21334; промотор GST, как описано в опубликованных заявках на международный патент № WO 90/08826 и WO 93/031294; и переключающая система экдизона, как описано в опубликованной заявке на международный патент WO 96/37609, положения которой включены здесь благодаря ссылке. Такие промоторные системы обозначаются здесь как “переключающие промоторы”. Переключающие промоторные системы наиболее пригодны для способа, заявленного в данном изобретении, поскольку они позволяют переключать экспрессию последовательностей ДНК в различных частях трансгенного растения в различные периоды времени посредством последовательной индукции, так как химический индуктор может быть применен в выбранной по желанию области растения на желаемой стадии роста. Например, переключающее химическое вещество может применяться в виде аэрозоля или пара по отношению ко всему или только к части трансгенного растения, или путем вымачивания корней.
Примеры химических веществ, которые могут применяться как переключатели, представлены в указанных выше ссылках, в которых описаны переключающие промоторные системы, а также приведены в сопровождающих заявку примерах. Переключающими химическими веществами являются такие химические вещества, которые пригодны для применения на соответствующей сельскохозяйственной культуре.
Индуцируемые промоторные системы преимущественно включают в себя однокомпонентную или двухкомпонентную системы. Однако системы, состоящие более чем из двух компонентов, так же включены в применение. Переключающая система может управляться конститутивным промотором, или, предпочтительно, специфичным для ткани или органа промотором, посредством которого ген, используемый как мишень, переключается только в ткани или органе мишени.
Наиболее предпочтительной для использования во всех упоминаемых здесь аспектах данного изобретения является переключающая промоторная система alcA/alcR.
Индуцируемая промоторная система alcA/alcR является двухкомпонентной системой, включающей в себя последовательности ДНК, кодирующие промотор а1сА и белок alcR, экспрессия которого находится под контролем желаемого промотора. Белок alcR в присутствии индуктора активирует промотор а1сА, и поэтому какой-либо ген, помещенный под контроль промотора а1сА, будет экспрессироваться только в присутствии индуктора. Предпочтительным промотором, контролирующим экспрессию регуляторного белка alcR, является специфичный для определенной ткани или органа промотор, такой как промотор, специфичный для листьев или клубней, в таком случае продуцируется alcR и активируется а1сА, приводя к экспрессии последовательности ДНК, кодирующей белок, который представляет интерес только в определенной части растения, такой как, например, лист, плод, зерно, эндосперм или семя. Когда способ, заявленный в данном изобретении, предполагается использовать для злаковых культур, желательно, чтобы экспрессия alcR находилась под контролем специфичного для семян промотора; при применении для хлебных злаков желательно, чтобы экспрессия alcR контролировалась промоторами, соединенными с генами, вовлеченными в синтез крахмала или с генами запасных белков семени, и при использовании для фуражных культур желательно, чтобы экспрессия alcR контролировалась специфичными для листа промоторами. Примеры селективных промоторов тканей и органов хорошо известны специалистам в данной области и к ним относятся, например, специфичные для семян промоторы, такие как промотор Ltp2 (kalla et al., Plant J., 6(6), 849-60, (1994)), промоторы zmGBS, zmZ27, osAGP и osGTl (Russel and Fromm, Transgenic Res. 1997, 6(2), 157-68), промотор CMd (Grosset et al., Plant.Mol. Biol., 1997, 34(2), 331-338), промотор глицина. А2В1а (Itoh et al., Mol.Gen.Genet., 1994, 243(3), 353-357), промотор олеосина Brassica napus (Keddie et al., Plant Molecular Biology, 19, 443-453, (1992)), промотор олеосина MatP6 хлопка (Hughes et al., Plant Physiol (1993), 101, 697-698), промотор олеосина Arabidopsis (Plant et al., Plant Mol.Biol. 25, 193-205 (1994)), промотор зеина (Ottoboni et al., Plant Mol Biol (1993) 21, 765-778), и специфичные для плодов и органов промоторы, такие как промотор пататина (Rocha-Sosa et al., EMBO J., 8, 23-30, 1989) семейство промоторов, связанных с генами малой субъединицы рибулезо-1,5-дифосфаткарбоксилазы/оксигеназы томата (Meier, Plant Physiol., 107(4) 1105-1118 (1995), промоторы rbcS3B и rbS3C томата (Carrasco, Plant Mol.Biol., 21 (1)-1-15 (1993), промотор STL1 листьев (Eckes et al., Mol.Gen.Genet., 205, 14-22 (1986) и промоторы rolC.
В качестве следующего предпочтительного варианта данного изобретения представлен способ повышения урожайности растения, заключающийся в трансформации растения конструкцией ДНК, включающей в себя одну или более последовательностей ДНК, которые кодируют белки, участвующие в распознавании, транспорте, метаболизме и/или усвоении сахарозы, и которые оперативно связаны с контролируемой промоторной областью alcA/alcR, где промотором, контролирующим экспрессию регуляторного белка alcR, является специфичный для ткани или органа промотор, необязательно оперативно связанный с терминатором транскрипции, и в осуществлении контроля за уровнем, временем и пространственной локализацией экспрессии указанной последовательности (последовательностей) ДНК с указанной контролируемой промоторной области благодаря применению внешнего химического индуктора, посредством чего повышается урожайность указанного трансгенного растения.
Примерами последовательностей ДНК, которые могут использоваться с целью повышения урожайности растения и для контроля за режимом цветения способом, заявленном в данном изобретении, могут быть последовательности ДНК, кодирующие белки, участвующие в транспорте, усвоении и предшествующем ему метаболизме сахарозы, например, фосфофруктокиназу, инвертазу и гексокиназу; в биосинтезе сахарозы, например, сахарозосинтазу, сахарозофосфатсинтазу и фруктозо-1,6-дифосфатазу; в транспорте запасных веществ во время покоя, в таком как транспорт, обеспечивающий приток во флоэму, например АТФазу и транспортные белки сахарозы и гексозы; в транспорте на большие расстояния по флоэме и в оттоке из флоэмы, например, пирофосфорилазу, отщепляющую неорганический пирофосфат (нПФазу); в процессах утилизации метаболитов сахарозы;
в блокировании синтеза крахмала (косвенно приводящего к увеличению уровней сахарозы); и ингибиторы инвертазы.
Применение контролируемой промоторной области позволяет производить контролируемое переключение последовательностей ДНК в соответствующий период цикла роста растения. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что контролируемая экспрессия гена инвертазы с использованием переключающей промоторной системы alcA/alcR приводит к увеличению высоты растения, увеличению размеров листьев и увеличению веса сырой ткани растения, которое может составлять до 10%, а также ускоряет наступление времени цветения растений, т.е. растения цветут раньше.
Вследствие этого, в качестве другого предпочтительного варианта данного изобретения представлен способ повышения урожайности растения путем трансформации растения конструкцией ДНК, включающей в себя последовательность ДНК, которая кодирует инвертазу и которая оперативно связана с контролируемой промоторной областью и необязательно оперативно связана с терминатором транскрипции, и в контроле за уровнем, временем и пространственной локализацией экспрессии указанной последовательности ДНК с указанной контролируемой промоторной области путем применения внешнего химического индуктора, посредством чего увеличивается урожайность указанного трансгенного растения.
Вследствие этого, в качестве еще одного предпочтительного варианта данного изобретения представлен способ осуществления контроля за режимом цветения растения, заключающийся в трансформации растения конструкцией ДНК, включающей в себя последовательность ДНК, кодирующую инвертазу и оперативно связанную с контролируемой, промоторной областью и необязательно оперативно связанную с терминатором транскрипции, и в контролировании уровня, времени и пространственной локализации экспрессии указанной последовательности ДНК с указанной контролируемой промоторной области путем применения внешнего химического индуктора, посредством чего изменяется режим цветения указанного трансгенного растения.
Источниками получения инвертазы могут быть клетки млекопитающих, бактерий, дрожжей, грибов или растений, и инвертаза может быть различных типов, таких как кислая или нейтральная инвертазы. Инвертаза с помощью сигнальных пептидов может быть направлена в различные части клетки, такие как клеточная стенка, цитоплазма, вакуоль или апопласт (см. Sonnewald et al., 1991, Plant J.1:95-106).
По третьему аспекту данного изобретения представлена конструкция ДНК, включающая в себя последовательность ДНК, кодирующую белок, участвующий в метаболизме, усвоении и/или транспорте сахарозы, и оперативно связанную с контролируемой промоторной областью.
Конструкции ДНК согласно данному изобретению могут также необязательно содержать последовательность терминатора транскрипции и/или последовательность мишени, для того, чтобы инвертаза могла быть направлена в желаемое место растения, выбранное в качестве мишени. Примером терминатора транскрипции может быть терминатор транскрипции нопалинсинтазы, и примерами пригодных для использования последовательностей мишеней могут служить, например, сигнальные последовательности и последовательности мишени, специфичные для вакуолей.
В преимущественном варианте этого аспекта данного изобретения последовательность ДНК кодирует инвертазу, а контролируемой промоторной областью является индуцируемая промоторная область, в состав которой входит переключающая промоторная система гены alcA/alcR.
Клетки растений могут быть трансформированы рекомбинантными конструкциями ДНК одним из многочисленных известных способов, таким как способ на основе Ti плазмид Agrobacterium, электропорация, микроинъекция, использование устройства для микробомбардировки частицами. Затем из трансформированных клеток путем регенерации могут быть получены целые растения, в которых новый ядерный материал стабильно включен в состав генома. Согласно данному изобретению, некоторая часть потомства этих первичных трансформантов унаследует рекомбинантные ДНК.
По четвертому аспекту данного изобретения представлена растительная ткань, трансформированная конструкцией ДНК, включающей в себя последовательность ДНК, которая кодирует белок, участвующий в метаболизме, усвоении и/или транспорте сахарозы, и которая оперативно связана с контролируемой промоторной областью, а также потомство указанного растения.
Примерами растений, урожайность которых может быть повышена, режим цветения которых может контролироваться способом, представленным в данном изобретении, и которые могут быть трансформированы конструкциями ДНК, соответствующими тем, что представлены в данном изобретении, являются, например, однодольные и двудольные растения, такие как полевые культуры, хлебные злаки, фрукты и овощи, в том числе следующие растения: тростник, подсолнечник, табак, сахарная свекла, хлопчатник, соя, кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, томаты, манго, персики, яблоки, груши, земляника, бананы, дыни, картофель, морковь, салат, капуста и лук; деревья, такие как эвкалипт и тополь; срезаемые для букетов цветы и декоративные растения.
Способ, заявленный в настоящем изобретении, может оказаться особенно полезным для обеспечения более однородного наполнения бананов в связке бананов, где обычно отдельные плоды бананов в верхней части связки наполняются раньше и лопаются, в то время как бананы в нижней части связки наполняются недостаточно. Согласно способу, представленному в данном изобретении, интенсивность поглощения веществ у бананов может быть изменена таким образом, что связанный углерод из верхней части связки может быть направлен к бананам в нижней части связки, что приведет к большей однородности размеров связок.
Настоящее изобретение далее поясняется только на примерах с использованием ссылок на приведенные ниже примеры и фигуры, которые имеют следующее содержание.
На фигуре 1 показана активность инвертазы после индукции этанолом в листьях, являющихся источником фотоассимилятов, трансгенных растений табака, несущих гены А1с:цитозольной инвертазы и Ас1:инвертазы клеточной стенки.
На фигуре 2 (A, B, C, D) графически изображено количество урожая, полученного от растений табака дикого типа и трансгенных растений табака в различных временных точках после индукции.
На фигуре 3 в виде гистограмм представлен анализ активности инвертазы в трансгенных растениях при различных концентрациях этанола (т.е. для дикого типа, alc:INV27, alc:INV10, alc:INV28 и 35ScytNV).
На фигуре 4 показана гистограмма результатов анализа следующих показателей: а) активности инвертазы; b) веса сырой ткани; с) высоты и d) количества цветущих растений в % для растений дикого типа и для трансгенных растений табака, индуцированных этанолом (т.е. для дикого типа, alc:INV27, alc:INV10 и alc:IN28).
На фигуре 5 представлены фотографии линий 27, 28, 10, несущих гены Alc инвертазы, и растений дикого типа без этанола (А) и в присутствии этанола (В).
На фигуре 6 (a, b, c) показано, что временная экспрессия инвертазы увеличивает количество цветков на растениях табака Alc:cyINV, но не растениях Alc:cwINV.
На фигуре 7 (a, b) показано изменение режима цветения в линиях Alc:cyINV и Alc:cwINV при экспрессии инвертазы.
На фигуре 8 (a, b, c) показано, что временная экспрессия инвертазы приводит к раннему цветению растений табака.
На фигуре 9 схематично показана стратегия клонирования конструкции Alc GUS с промотором L700.
На фигуре 10 показана специфичная для отдельных органов растений табака экспрессия L700::Alc:GUS через 48 часов после индукции.
На фигуре 11 схематично показана стратегия клонирования конструкции Alc GUS с промотором В33 потатина.
На фигуре 12 в виде гистограммы показаны результаты анализа активности GUS в клубнях картофеля дикого типа и трансгенных растений картофеля в 0 день и на 7 день после индукции.
На фигуре 13 (a, b) приведена гистограмма данных, полученных при анализе уровней индуцированной этанолом активности GUS, наблюдаемой в клубнях картофеля, трансформированного конструкцией пататин: alc:GUS.
На фигуре 14 показана тканеспецифичная и индуцируемая этанолом экспрессия GUS в трансгенных растениях табака:специфичная для клубней экспрессия белка alcR.
На фигуре 15 показана конструкция плазмиды пататин В33::Alc:cwINV.
На фигуре 16 (a, b, c) показана индуцированная этанолом активность инвертазы в клубнях картофеля пататин:А1с:cwINV.
На фигуре 17 (a, b) показано содержание углеводородов в растущих клубнях картофеля Pat::cwINV и Pat::Ale::cwINV.
На фигуре 18 показано увеличение размера клубней картофеля в результате ранней индукции экспрессии инвертазы апопластов.
ПРИМЕРЫ
Авторы адаптировали для данного изобретения регулон alc гриба аскомицета A.nidulanc, который хорошо охарактеризован (Pateman et al., Proc.Roy.Soc.London B 217, 243 (1983). Greaser et al., Biochem, J.225, 449 (1985), Lockington et al., Mol.Microbiol. 1, 275 (1987), Felenbok et al., Gene 73, 385 (1988), Felenbok et al., J.Biotechnol. 17, 11 (1991), Kulmberg et al., J.Biol.Chem. 267, 21146 (1992), Kulmberg et al., Mol.Microbiol. 7, 847, (1993) и Fillinger and Felenbok, Mol.Microbiol. 20, 475 (1996). На основании сведений из классической генетики предполагается, что эта генетическая система является самодостаточной и контролирует клеточный ответ на этанол и другие близкие химические вещества. Гены а1сА и aldA A.Nidulans кодируют алкогольдегидрогеназу I и альдегиддегидрогеназу, соответственно (Pateman et al., Proc. Roy. Soс. London В 217, 243 (1983), Creaser et al., Biochem. J.225, 449 (1985). Lockington et al., Mol.Microbiol. 1,275 (1987), Felenbok et al., Gene 73, 385 (1988), Felenbok et al., J.Biotechnol. 17, 11 (1991), Kulmberg et al., J.Biol.Chem. 267, 21146 ((1992), Kulmberg et al., Mol.Microbiol. 7, 847, (1993) и Fillinger and Felenbok, Mol.Microbiol. 20, 475 (1996). Оба этих гена регулируются специфичным для путей обмена транскрипционным фактором AlcR (Pateman et al., Proc.Roy.Soc.London В 217, 243 (1983), Creaser et al., Biochem. J. 225, 449 (1985), Lockington et al., Mol.Microbiol. 1, 275 (1987), Felenbok et al., Gene 73, 385(1988), Felenbok et al., J.Biotechnol. 17, 11 (1991), Kulmberg et al., J.Biol.Chem. 267, 21146 ((1992), Kulmberg et al., Mol.Microbiol. 1, 847, (1993) и Fillinger and Felenbok, Mol.Microbiol. 20, 475 (1996). Белок AlcR связывается со специфическими сайтами в пределах промоторной области а1сА и, как здесь показано, заставляет его прямо отвечать на молекулу индуктора (Pateman et al., Proc.Roy.Soc. London В 217, 243 (1983), Creaser et al., Biochem. J.225, 449 (1985), Lockington et al., Mol.Microbiol. 1, 275 (1987), Felenbok et al., Gene 73, 385 (1988), Felenbok et al., J.Biotechnol. 17, 11 (1991), Kulmberg et al., J.Biol.Chem. 267, 21146 ((1992), Kulmberg et al., Mol.Microbiol. 7, 847, (1993) и Fillinger and Felenbok, Mol.Microbiol, 20, 475 (1996).
Регуляторная система alc была выбрана как наиболее пригодная для создания кассеты экспрессируемых генов растений по нескольким причинам. Во-первых, минимальная регуляторная система состоит только из гена alcR и промотора а1сА. Во вторых, из-за эволюционной дивергенции между A.nidulans и высшими растениями вряд ли какие-либо растительные гомологи белка AlcR могут активировать промотор: AlcR имеет в своем составе двуядерный цинкосодержащий кластер, подобный Gal4 (Pateman et al., Proc.Roy.Soc.London В 217, 243 (1983), Creaser et al., Biochem. J.225449 (1985), Lockington et al., Mol. Microbiol. 1, 275 (1987), Felenbok et al.. Gene 73, 385 (1988), Felenbok et al., J.Biotechnol. 17, 11 (1991), Kulmberg et al., J.Biol.Chem. 267, 21146 ((1992), Kulmberg et al., Mol.Microbiol. 7, 847 (1993) и Fillinger and Felenbok, Mol.Microbiol. 20, 475 (1996), который пока найден только у грибов. Кроме того, по-видимому, ни один из транскрипционных факторов растений не конкурирует за связывание с промотором alcA. В-третьих, химическими индукторами являются относительно простые органические молекулы, обладающие низкой фитотоксичностыо. В четвертых, при нормальных условиях роста, уровни природных индукторов растения чрезвычайно низки.
Чтобы проверить эффективность системы, были сконструированы экспрессирующие кассеты растений. Создание генных конструкций на основе alс. В конструкции p35S:alcR (А) для экспрессии с кДНК белка AlcR использовали промотор 35S вируса мозаики цветной капусты. Участок alcR кДНК (предоставленной Felenbok) был вырезан из несущего ее вектора Bluescript (Stratagene) частичным расщеплением BamHI, сшит с расщепленным BamHI вектором pJRl (Smith et al., Nature 334, 724 (1988)), который является производным вектором pUC, содержащим промотор CaMV 35S и терминатор nos, и этой конструкцией трансформировали клетки E.coli XL-1 Blue (W.О.Bullock et al., Bio Techhniques 5, 376 (1987); J.Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, edn. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Репортерная alcA кассета, palcA:XAT (В), была сконструирована расщеплением pCaMVCN peстриктазами HindIII и BamHI для удаления промотора. pCAMVCN является вектором экспрессии растений, который можно приобрести в Pharmacia. Это вектор, производный от pUC, в котором промотор CaMV 35S обеспечивает экспрессию бактериального гена ХАТ. Терминатор получен из гена nos A.tumefaciens). Поскольку ТАТА блоки промоторов А1сА и 35S были идентичными (5'ТСТАТАТАА3'), была использована ПЦР рекомбинантов для амплификации и слияния посредством этого сайта обоих фрагментов. (Higuchi in PCR Protocols, M.A.Innis et al., eds (Academic Press, San Diego (1990), p.177-183. Продукт ПЦР alcA простирался выше ТАТА блока на 246 п.н. и включал в себя сайты связывания AlcR (Pateman et al., Proc. Roy. Soc. London В 217, 243 (1983), Creaser et al., Biochem. J.225, 449 (1985), Lockington et al., Mol.Microbiol. 1, 275 (1987), Felenbok et al., Gene 73, 385 (1988), Felenbok et al., Biotechnol. 17, 11 (1991), Kulmberg et al., J.Biol.Chem. 267, 21146 (1992), Kulmberg et al., Mol.Microbiol. 7, 847 (1993) и Fillinger and Felenbok, Mol. Microbiol. 20, 475 (1996). Продукт ПЦР 35S включал в себя общую последовательность ТАТА блока и простирался ниже по течению до BamHI сайта, подходящего для последующего клонирования; известно, что минимальный промотор 35S не способен к экспрессии в растениях. (Было показано, что минимальный промотор 35S, содержащий только эти последовательности между положениями -46 и +5, не обладает способностью инициировать транскрипцию (Odell et al., Nature 346, 390 (1985), Hilson et al., Plant Cell 2, 651 (1990), Schena et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10421 (1991). Есть все основания ожидать, что слияние ра1сА посредством ТАТА последовательности (положения от -31 до +1) также будет неактивным). Полученный продукт был расщеплен HindIII и BamHI, и сшит с pCaMVCN, в котором отсутствовал промотор. После трансформации клеток E.coli, проведен скрининг колоний, чтобы отобрать плазмиду, содержащую нужный гибридный промотор palcA:35S, и HindIII и BamHI фрагмент был секвенирован, чтобы убедиться в отсутствии ошибок ПЦР. Конструкция palcA:Inv была получена делецией репортерного гена GUS из плазмиды palcA:GUS и ин-серцией укороченного гена suc2 дрожжей, выделенного из плазмиды rolC-suc2 в виде BamHI фрагмента (Lerchl et al., Plant Cell 7, 259 (1995). Для трансформации растений кассета p35S:alcR была клонирована в векторе, производном Bin 19 (Deblacre et al., Nucleic Acids Res. 13, 4777 (1985), вместе с конструкцией ра1сА:ХАТ или с конструкцией palcA:Inv перенесена в ходе трансформации в A. tumefaciens (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163, 181 (1978); Vervliet et al., J.Gen.Virol.26, 33 (1975)). Трансформация растений табака с использованием опосредованного Agrobacterium переноса генов была выполнена как описано ранее (Rosahl et al., EMBO J.6, 1159 (1987) и Komari et al., Plant Science 60, 223 (1989)).
Бактериальный ген хлорамфениколацетилтрансферазы (ХАТ) был использован в качестве репортерного гена, так что уровни экспрессируемого белка можно определять с использованием метода ELISA. При трансформации A.nidulans (Ballancee and Turner, Gene 36. 321 (1983); Campbell et al. Curr.Genet.d989) введенная конструкция ра1сА:ХАТ определяла индуцируемую активность ХАТ, а p35S:alcR восстанавливала дикий фенотип у мутантов alcR (данные не показаны). Временные исследования (Callis et al., Genes and Develop 1, 1183 (1987)) в протопластах кукурузы показали, что в растительных клетках белок AlcR мог стимулировать транскрипцию с промотора аlсА и что экспрессия, по крайней мере, частично регулировалась этанолом (данные не показаны).
После опосредованной Agrobacterium tumefaciens трансформации было отобрано трансгенное растение табака, несущего кассеты p35S:alcR и раlсА:ХАТ, и тестировано с помощью ПЦР на наличие обеих кассет (данные не показаны). Это растение было оплодотворено в результате самоопыления, и потомство, полученное после высевания семян, было исследовано на наличие обоих селектируемых маркеров и на экспрессию ХАТ. Расщепление в потомстве по наличию данных конструкций соответствовало соотношению по Менделю (1 нетрансгенное растение:2 гемизиготы: 1 гомозигота), что соответствует наличию одной копии кассет в родительском растении (данные не показаны).
Отобранный проросток выращивали до взрослого состояния, чтобы получить гомозиготную линию. Проростки этого растения тестировали на наличие белка ХАТ в сравнении с проростками подобного растения, трансформированного конструкцией, которая экспрессирует ХАТ с промотора CaMV 35S, обладающего высокой конститутивной активностью (таблица). Гомозиготные по palc:ХАТ проростки в отсутствие индукции содержали едва обнаруживаемые количества белка ХАТ, но после индукции этанолом активность ХАТ в этих проростках составляет 39% от значения активности ХАТ в необработанных проростках р35S:ХАТ и 55% от значения активности ХАТ в обработанных этанолом проростках р35S:ХАТ. Таким образом, обработка этанолом проростков р35S:ХАТ приводит к снижению уровня белка ХАТ (29%) относительно необработанного контроля.
Хотя индуцируемые уровни экспрессии были ниже, чем уровень экспрессии с промотора 35S, очень низкая базальная активность свидетельствует о возможности использования этой системы для манипулирования метаболизмом углерода. Серия индуцируемых векторов инвертазы была создана заменой репортерного гена ХАТ укороченным дрожжевым геном suc2 GENE 100, кодирующим цитозольную инвертазу дрожжей. В связи с этим, BamHI фрагмент, выделенный из плазмиды RolC::Suc2 (Lerchi et al., 1995, Plant Cell 7, 259-270) был использован для замены репортерного гена. Фрагмент содержал от 848 до 2393 нуклеотида дрожжевого гена suc2 (номер по каталогу Y01311) и кодировал белок инвертазы без сигнального пептида. Инвертазы из других источников и инвертазы различных типов, такие как кислая инвертаза, или другие инвертазные мишени были так же созданы с использованием комбинаций транзитных пептидов инвертаз, описанных Sonnewald et al., 1992, Plant J.1:95:106, которые могут экспрессироваться в клеточной стенке или в субклеточных структурах, таких как вакуоль или апопласт (детали клонирования описаны Caddick et al., Nature Biotech, vol.16, Feb. 1998 page 177 и Lerchi J.et al., 1995, Plant Cell 7:250-270 и Sonnewald et al.). Были отобраны трансгенные растения табака, несущие palc:cyInv (трансформация табака (Nicotiana tabacum cv.Samsun NN) с использованием опосредованного Agrobacterium переноса генов была выполнена как описано Rosahl et al. EMBO J.13, 1 (1987)). В результате скрининга около 100 независимых устойчивых к канамицину регенерированных растений, проведенного на наличие индуцируемой этанолом инвертазной активности, было идентифицировано 23 растения, экспрессирующих инвертазу. Из 23 растений, проявляющих индуцируемую инвертазную активность, были отобраны три линии (10, 27 и 28) для более детального анализа. С этой целью, растения были размножены в культуре ткани и 50 растений каждой линии были перенесены в теплицу. После 21 дня роста в горшках, имеющих объем 2 л, была выполнена начальная индукция путем вымачивания корней в 100 мл 1% раствора этанола (объем/объем). Чтобы усилить ответ на этанол, индукция была повторена через 48 и 72 часа после первоначального вымачивания корней. Чтобы исследовать активность инвертазы, были взяты образцы через 0, 1, 6, 24, 48, 72 и 96 часов после начальной индукции (смотри фигуру 1). Повышенная активность инвертазы измерялась во всех трех трансгенных линиях уже через 6 часов после первого добавления этанола. Активность инвертазы в двух линиях (10 и 27) равномерно увеличивалась, достигая плато через 96 часов после первоначального вымачивания корней, тогда как в третьей линии (28) она еще увеличивалась.
Фенотипическая модификация начиналась через 72 часа после индукции этанолом и была наиболее сильной после 96 часов. Конечный фенотип был идентичен опубликованным ранее результатам, полученным при использовании промотора 35S CaMV для управления экспрессией цитозольной инвертазы дрожжей (Sonnewald et al., Plant J.1, 95 (1991)). Окончательное развитие фенотипа происходило при достижении максимальной активности инвертазы и было наиболее выраженным для трансформантов 28. Измерения флюоресценции фотосинтеза использовали для слежения за изменениями квантового выхода (Schreiber et al., in Ecophysiology of Photosynthesis, vol.100, Schuize and Caldwell, Eds (Springer Verlag, Berlin, 1994), pp. 49-70) во всех трех линиях трансформантов in vivo в течение всего эксперимента по индукции. В ходе курса обработки этанолом не обнаружено заметных изменений квантового выхода в самых молодых листьях (листья А, площадь листа составляет 8% от максимальной величины). Однако в соответствии с видимым развивающимся фенотипом квантовый выход значимо снижался (р>0,05) в листьях В (15% от максимума) и С (45% от максимума) растений линий 10 и 28, начиная с 72 часа после начальной индукции и продолжал снижаться далее вплоть до конечной временной точки 96 ч.
На фигуре 2 приведены данные, показывающие снижение скорости фотосинтеза вслед за увеличением активности инвертазы в трансгенных растениях табака, которые были получены путем измерений квантового выхода. Измерения флюоресценции проводились для того, чтобы контролировать изменения параметров фотосинтеза во время индукции активности инвертазы, с использованием прибора РИМ-2000 (Walz, Effeltrich, Германия). Эффективность использования квантов (квантовый выход) фотосистемы II(ФСII) была измерена при направлении насыщающего светового луча на адаптированные к свету листья растений дикого типа и трансформированных растений (palc:Inv). Перед каждым измерением убеждались, что насыщающий импульс достигал плато, чтобы обеспечить точное определение показателя Fm'. Интенсивности измеряемого и насыщающего светового луча доводили до значения FO', близкого к 0,4. Измерения проводились на различных листьях, площадь которых достигала 8% (А), 15% (В), или 45% (С) от максимальной площади листа, пяти растений каждого генотипа в идентичных по времени точках.
Квантовый выход в трех последующих адаптированных к свету листьях (листья А-С), начиная от верха растения, был измерен с использованием прибора РАМ-2000 в указанных временных точках. Данные значения являются средними значениями +-SE (n=5). Для растений линии 28, квантовый выход был снижен на 23% (р<0,05) и 27% (р<0,05) и для растений линии 10 только на 6% и 17% (р<0,05), соответственно. Вследствие гетерогенности развивающегося фенотипа среди индивидуальных растений каждого генотипа стандартные ошибки были выше при измерениях, проводимых на подверженных этому процессу листьях (В и С).
В таблице, показаны уровни активности ХАТ в трансгенных растениях табака. Индивидуальные проростки гомозиготной трансгенной линии табака, несущие ген ХАТ, который экспрессируется с промотора аlсА, сравнивали с проростками сходной линии, трансформированной р35S:ХАТ. Растения росли на жидкой среде вплоть до 4-недельного возраста, и давали четыре настоящих листа (потомство из семян растений табака выращивали, высевая семена прямо в 2 см слой стерильных бусин из полиэтилена низкой плотности (диаметром 5 мм), плавающих на поверхности 0,5% (вес/объем) стерильного раствора Miracle Gro в стаканах, объемом 500 мл. Стаканы покрывали перфорированным полиэтиленовым пакетом и инкубировали при 25°С при высокой интенсивности освещения в комнате роста). Индукция достигалась добавлением 0,1% этанола в среду роста в течение 120 час. Индуцирующую среду сменяли через 58 час, чтобы поддерживать концентрацию этанола. Один лист был взят перед индукцией, и один лист после индукции. ХАТ определяли методом ELISA (Boehringer Mannheim) в грубых клеточных экстрактах; общее количество белка определяли, как описано ранее (Bradford, Anal.Biochem. 72:243 (1976). Все значения даны в нг белка ХАТ на мг общего белка, и представляют собой среднее из девяти индивидуальных повторов±стандартное отклонение.
На фигуре 3 можно увидеть, что активность инвертазы трансгенных растений зависит от дозы, и что активность при 5% этанола значительно выше, чем при 1% этанола. Следовательно, можно регулировать инвертазу дозозависимым способом с использованием переключателя Alc.
Чтобы увидеть влияние экспрессии индуцируемой цитозольной инвертазы на рост растения и время цветения, растения табака размножали вегатативно в культуре ткани (фигура 4). Потом 50 маленьких растений каждого генотипа переносили в теплицу. На фигуре 4 буквами wt обозначен дикий тип растений, являющихся контролем для трансгенных растений, и линии 10, 27 и 28 представляют 50 независимых размноженных клонированием линий, содержащих 35S:ale:suc2. Спустя три недели после переноса, растения индуцировали путем вымачивания корней в 100 мл 1% раствора этанола (объем/объем). Индукцию повторяли три раза (0, 48 и 72 часа). В частности, на фигуре 4а показана активность цитозольной нейтральной инвертазы (suc2), измеренная через 96 часов после начальной индукции, на фигуре 4b показан вес сырой ткани наземной биомассы через 45 дней после переноса и на фигуре 4с показана высота растений через 45 дней после переноса. На фигуре 4d показано количество растений в процентах, которые цвели на 45 день после переноса.
Чтобы показать влияние индуцируемой этанолом цитозольной инвертазы на высоту растений и цветение, растения размножали в культуре ткани и переносили в теплицу (фигура 5). Спустя три недели после переноса одну половину растений индуцировали этанолом как дано в описании к фигуре 4. Вторую половину растений переносили во вторую теплицу без какой-либо обработки этанолом. На верхней панели (А) показаны четыре растения табака через 7 недель после переноса из культуры ткани без обработки этанолом. На нижней панели (В) показаны растения с таким же генотипом через 4 недели после начальной индукции этанолом. Слева направо показаны следующие генотипы: 1, линия 27; 2, линия 10; 3, линия 28; 4, нетрансформированный контроль. Фенотип раннего цветения обнаруживали последовательно в этих линиях во всех экспериментах.
Чтобы показать, что индуцируемая экспрессия инвертазы приводит к увеличению количества цветков на растении, 25 растений каждого генотипа (wt, cyt inv 10, cyt inv 27, cyt inv 28, cw inv 19, cw inv 28 и cw inv 45) получали размножением в культуре ткани и переносили в теплицу (фигура 6). Через три недели после переноса растения индуцировали, как описано выше. К концу периода роста определяли общее количество цветков, образованных каждым растением.
Как можно видеть на фигуре 7, у трансгенных растений, экспрессирующих индуцируемую инвертазу, наблюдалась ускоренная индукция образования цветков. 25 растений каждого генотипа получали размножением в культуре ткани и переносили в теплицу. Через три недели после переноса растения индуцировали, как описано выше. Потом образование цветков прослеживали в течение периода роста. Растения классифицировали как цветущие, когда раскрывался первый бутон. Значения даны в [%] количества цветущих растений от общего числа растений (n=25).
Как можно видеть на фигуре 8, фенотип раннего цветения воспроизводится в разные сезоны роста посредством временной экспрессии инвертазы. В связи с этим 50 (весной) и 25 (летом и осенью) растений каждого генотипа использовали для индивидуальных экспериментов, соответственно. После размножения растения переносили в теплицу и через три недели после переноса начинали индукцию как описано выше. В указанное время после переноса (дпп, дни после переноса) подсчитывали растения с распустившимися цветочными бутонами. Значения даны в [%] количества цветущих растений от общего числа растений.
Получение плазмиды pSTLSI:AlcR:AlcA:GUS(SC08).
Чтобы получить плазмиду SC08, EcoRI/HindIII фрагмент плазмиды AlcR/AGUS, содержащий область, кодирующую AlcR, и терминатор NOS субклонировали в плазмиде pAlcR, полученной на основе pBuescript SK. После этого плазмида pAlcR была расщеплена EcoRI, концы затуплены ДНК-полимеразой (фрагмент Кленова), далее расщеплена HindIII и встроена в плазмиду pBINSTSL1, расщепленную BamHI, обработанную фрагментом Кленова и расщепленную HindIII, в результате чего была получена плазмида pBIN:STSL1:AlcR. Плазмида pBINSTSL1 состоит из промотора STSL1, последовательность которого соответствует нуклеотидам от + до +1585 опубликованной последовательности гена STSL1 картофеля (Eckes et al., (1986) Mol.Gen. Genet. 205, 14-22), и терминатора OCS (октопинсинтаза). Конечная конструкция SCO8 была получена встраиванием HindIII фрагмента плазмиды AlcR/GUS, содержащего промотор АlсА, область кодирующую GUS и терминатор NOS, в расщепленный HindIII вектор pBIN:STSL1:AlcR. Стратегия клонирования конструкции Alc GUS с промотором L700 показана на фигуре 9.
Тканеспецифичная и индуцируемая этанолом экспрессия GUS в трансгенных растениях табака, т.е. специфичный для листьев/стебля белка alcR, показан на фигуре 10. Трансгенные растения табака, экспрессирующие репортерный ген GUS под контролем индуцируемой этанолом системы, размножали в культуре ткани и переносили в теплицу. Через три недели после переноса растения индуцировали путем вымачивания корней, используя 100 мл 1% раствора этанола. Спустя 48 часов после индукции были отобраны образцы тканей и активность GUS определена в белковых экстрактах: листьев, поглощающих органические вещества, <3 см; листьев, являющихся источником органического вещества. Экспрессию белка alcR в корнях и стеблях плазмидой 35S::Fle::GUS под контролем промотора 35S CaMV использовали как конститутивный контроль. Так же использовали экспрессию белка alcR плазмидой L700::А1с::GUS под контролем специфичного для листьев/стебля промотора STLS1 картофеля в 4 независимых трансгенных линиях (6, 9, 27 и 74).
Получение плазмиды В33::AlcR::А1сА:GUS (SC09).
Чтобы получить плазмиду SC09, EcoRI/HindIII фрагмент плазмиды AlcR/A GUS, содержащий кодирующую область AlcR и терминатор NOS, был субклонирован в полученной на основе pBluescriptSK плазмиде pAlcR. Затем плазмида pAlcR была расщеплена EcoRI, концы затуплены ДНК полимеразой (фрагмент Кленова), далее обработана рестриктазой HindIII и встроена в расщепленную SmaI/HindIII плазмиду pBIN:B33AlcR. Плазмида pBINB33 состоит из промотора пататина класса I, соответствующего последовательности от -1512 до +14 гена пататина В33 (Rocha-Sosa et al. (1989) EMBO J., 8, 23-29) и терминатора OCS. Конечная конструкция SC09 была получена встраиванием HindIII фрагмента плазмиды AlcR/A GUS, содержащего промотор А1сА, кодирующую область GUS и терминатор NOS, в расщепленный HindIII вектор pBIN:B33AlcR. Стратегия клонирования конструкции Ale GUS с промотором пататина В33 показана на фигуре 11.
Вектор AlcR пататин а1сА GUS
Agrobacterium tumefaciens линии С58С1:pGV2260 были прямо трансформированы pSC09 (В33-alc GUS в Bin19) с помощью процедуры, описанной Hofgen and Willmitzer (Nucleic Acids Res., 16(20), 9877, 1988). Трансформация растений картофеля (сорт Solara) с использованием опосредованного Agrobacterium переноса генов была выполнена, как описано Rocha-Sosa et al. (EMBO J., 8(1), 23-9, 1989). Трансгенные растения были дублированы в культуре ткани, и один набор растений был перенесен в теплицу после образования корней. Растения выращивали до взрослого состояния и собирали клубни. Были взяты образцы клубней от каждого независимого трансформанта на анализ GUS без обработки этанолом. Другую часть клубней переносили в коробки из оргстекла, содержащие сосуды с 1% этанолом. Через 7 дней после обработки парами этанола, собирали клубни и исследовали активность GUS. На фигуре 13 показано, что в клубнях после обработки этанолом наблюдаются высокие уровни экспрессии трансгена.
Трансгенные растения картофеля, экспрессирующие репортерный ген GUS под контролем индуцируемой этанолом системы, размножали в культуре ткани и переносили в теплицу. Через два месяца после переноса растения индуцировали посредством вымачивания корней, используя 100 мл 1% этанола. Через 48 часов после индукции отбирали образцы ткани и определяли активность GUS в белковых экстрактах листьев, стеблей и клубней весом >5 г. Экспрессия репортерного гена GUS плазмидой Pat:GUS под контролем промотора В33 пататина класса I выступала в качестве контроля. Кроме того, использовали экспрессию белка alcR плазмидой Pat::Alc:GUS под контролем клубнеспецифичного промотора В33 картофеля. Активность приведена в пмоль ЕМ/мг/мин. На фигуре 14 показана тканеспецифичная и индуцируемая этанолом экспрессия GUS в растениях табака благодаря клубнеспецифичной экспрессии белка AlcR.
Фрагмент, содержащий трансактиватор гена alcR и терминатор NOS, вырезали рестриктазами EcoRI и HindIII из плазмиды 35S:AlcR-AlcA:GUS (35S-Alc:GUS) (Salter et al.. Plant Journal, 16(1), 127-132, 1998) и затем субклонировали в Bluescript SK-(STRATAGENE) (alcR в SK-). Плазмиду AlcR в SR- расщепляли EcoRI и обрабатывали фрагментом Кленова, чтобы затупить концы, и далее расщепляли HindIII. Этот EcoRI(-)-HindIII фрагмент клонировали в бинарном векторе Bin-В33, расщепленном SmaII и HindIII, в результате чего была создана плазмида пататин В33:AlcR в pBIN19. Продукт ПЦР инвертазы дрожжей с последовательностью сигнального пептида (СП) белкового ингибитора II (von Schaewen et al. (1990), EMBO J., 9, 3033-3044) был клонирован в векторе pGEM-T с помощью праймеров К83 и К84, которые содержали сайт Small. Small фрагмент был субклонирован в плазмиде pUC-AlcA в сайте BamHI, который был затуплен ДНК полимеразой Т4. Ориентация была проверена с помощью комбинирования Asp718 и EcoRI, а так же Xbal. Правильно ориентированная плазмида была затем субклонирована в пататин B33:AlcR в pBIN19, с образованием конечной плазмиды пататин B33:AlcR-AlcA: cwwINV в BIN19 (пататин В33::Alc:cwINV). Конструкция плазмиды показана на фигуре 15.
Трансгенные растения картофеля размножали в культуре ткани и затем переносили в теплицу. После того, как завязывались клубни, растения индуцировали однократно 100 мл 1% этанола (вымачивание корней) и определяли активность инвертазы в клубнях. На левой панели показана активность инвертазы перед (0) и после (1) индукции этанолом, выявленная после электрофореза в SDS-ПААГ. Нетрансформированные растения дикого типа были использованы в качестве контроля и сравнивались с независимыми трансгенными линиями 2, 3, 4, 5, 7 и 13 (см. фигуру 16).
На фигуре 17 показано содержание углеводов в клубнях картофеля через два месяца после начальной индукции. Трансгенные растения Pat::cwINV, экспрессирующие дрожжевую инвертазу, контролируются с помощью клубнеспецифичного промотора пататина В33 (независимые трансгенные линии 3, 33 и 41). Трансгенные растения SC12 (Pat::Alc:cwINV) (независимые трансгенные линии 2, 5, 7 и 13) представляют собой индуцируемые этанолом линии. Клубнеспецифичная экспрессия инвертазы клеточной стенки происходит благодаря клубнеспецифичной экспрессии белка alcR, опосредованной промотором В33.
Трансгенные растения картофеля размножали в культуре ткани и переносили в теплицу. Индукция этанолом производилась в трех различных стадиях развития. 1-я индукция через 25 дней после переноса, 2-я индукция через 32 дня после переноса и 3-я индукция через 39 дней после переноса. В каждом эксперименте по индукции использовали 10 растений каждого генотипа. Начальную индукцию проводили путем вымачивания корней. Согласно процедуре индукции, растения, индуцированные через 25 дней, были индуцированы парами через 32 и 39 дней после переноса. Растения, индуцированные через 32 после переноса, были индуцированы второй раз, тогда как растения, индуцированные через 39 дней после переноса, больше не индуцировались (смотри фигуру 18).
В рамках данного изобретения возможны другие модификации, которые будут очевидными для специалистов в данной области.
Формула изобретения
1. Способ увеличения урожайности растения, предусматривающий трансформацию растения конструкцией ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую белок, участвующий в распознавании, транспорте, метаболизме и/или усвоении сахарозы, оперативно связанную с контролируемой промоторной областью и необязательно оперативно связанную с терминатором транскрипции, и контролирование уровня, времени и пространственной локализации экспрессии указанной последовательности ДНК с указанной контролируемой промоторной области путем применения внешнего химического индуктора, посредством чего увеличивается урожайность указанного трансгенного растения.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что селективно увеличивают транспортировку фиксированного углерода из фотосинтетически активной ткани-источника в фотосинтетически неактивную ткань указанного трансгенного растения.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК, кодирующую белок, который участвует в транспорте, усвоении и последующем метаболизме сахарозы, как, например, в биосинтезе сахарозы; в транспорте запасных веществ во время периода покоя, как, например, в подаче во флоэму; в транспорте на большие расстояния по флоэме или оттоке из флоэмы; или в утилизации ассимилятов, таких, как метаболиты сахарозы.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК кодирует инвертазу.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная контролируемая промоторная область содержит химически индуцируемую промоторную систему.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что химически индуцируемый промотор находится под контролем тканеспецифичного или органоспецифичного промотора.
7. Способ по п.5 или 6, отличающийся тем, что указанная химически индуцируемая промоторная система содержит промоторную систему alcA/alcR.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что экспрессия регуляторного белка alcR находится под контролем тканеспецифичного или органоспецифичного промотора.
9. Способ контролирования режима цветения растения, предусматривающий трансформацию растения конструкцией ДНК, содержащей последовательность ДНК, кодирующую белок, участвующий в распознавании, транспорте, метаболизме и/или усвоении сахарозы, оперативно связанную с контролируемой промоторной областью и необязательно оперативно связанную с терминатором транскрипции, и контролирование уровня, времени и пространственной локализации экспрессии указанной последовательности ДНК с указанной контролируемой промоторной области путем применения внешнего химического индуктора, посредством чего изменяется режим цветения указанного трансгенного растения.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК представляет собой последовательность ДНК, кодирующую белок, который участвует в транспорте, усвоении и последующем метаболизме сахарозы, как, например, в биосинтезе сахарозы; в транспорте запасных веществ во время периода покоя, как, например, в подаче во флоэму; в транспорте на большие расстояния по флоэме или оттоке из флоэмы; или в утилизации ассимилятов, таких как метаболиты сахарозы.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанная последовательность ДНК кодирует инвертазу.
12. Способ по любому из пп.9-11, отличающийся тем, что указанная контролируемая промоторная область содержит химически индуцируемую промоторную систему.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что химически индуцируемый промотор находится под контролем тканеспецифичного или органоспецифичного промотора.
14. Способ по п.12 или 13, отличающийся тем, что указанная химически индуцируемая промоторная система содержит промоторную систему alcA/alcR.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что экспрессия регуляторного белка alcR находится под контролем тканеспецифичного или органоспецифичного промотора.
16. Конструкция ДНК, содержащая последовательность ДНК, которая кодирует белок, участвующий в метаболизме, усвоении и/или транспорте сахарозы, оперативно связанную с контролируемой промоторной областью, где указанная контролируемая промоторная область содержит химически индуцируемую промоторную систему.
17. Конструкция ДНК по п.16, отличающаяся тем, что указанной химически индуцируемой промоторной системой является переключающая промоторная система alcA/alcR.
18. Конструкция ДНК по п.17, отличающаяся тем, что регуляторный белок alcR находится под контролем тканеспецифичного или органоспецифичного промотора.
19. Конструкция ДНК по любому из пп.16-18, отличающаяся тем, что указанная последовательность ДНК содержит последовательность ДНК, кодирующую инвертазу.
РИСУНКИ
