Композиция для стимулирования роста

 

Изобретение относится к медицине. Заявлено применение ингибитора дипептидилпептидазы IV для приготовления терапевтической композиции для лечения замедленного развития или карликовости, связанного с недостатком гормона роста. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств, не обладающих антигенными свойствами. 6 з.п. ф-лы, 3 табл.

Настоящее изобретение относится к химическим агентам и композициям, предназначенным для стимулирования роста животного, например недоразвитого человека, а также для ускорения восстановления и регенерации ткани.

Ингибиторы DP-IV

Дипептидилпептидаза IV (DP-IV, а также дипептидиламинопептидаза IV, DPP-IV, DAP-IV, ЕС 3.4.14.5) представляет собой сериновую пептидазу, которая отщепляет аминоконцевой дипептид от пептидов и протеинов. Она распознает субстраты, в которых N-терминальная последовательность представляет собой Х-Рrо или Х-Аlа. Ингибиторы DP-IV были предложены для использования в качестве терапевтических агентов, предназначенных для лечения воспалительных заболеваний и синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Обычно известные ингибиторы DP-IV представляют собой аналоги субстрата. Примерами ингибиторов DP-IV могут служить вещества, раскрытые в DD 296075 А5 (Neubert с сотр.. Ноябрь 1991), WO 91/16339 (Bachovchin с сотр., октябрь 1991), WO 93/08259 (Bachovchin с сотр., апрель 1993), WO 95/15309 (Jenkins с сотр., июнь 1995), WO 98/19998 (Villhauer, май 1998), WO 99/46272 (Scharpe с сотр., сентябрь 1999) и WO 99/61431 (Demuth с сотр., декабрь 1999). Пролекарства некоторых из указанных ингибиторов описаны также в WO 99/67278 и WO 99/67279 (обе заявки Demuth с сотр., декабрь 1999).

В следующей ниже таблице представлены основные типы соединений, являющихся ингибиторами DP-IV, а также конкретные примеры тех соединений, которые являются предпочтительными веществами настоящего изобретения; в таблице также даны ссылки на патентные документы, в которых раскрыт обширный ряд соединений, из которых выбраны указанные выше типы и примеры. Следует отметить, что все ингибиторы DP-IV, раскрытые в описаниях цитированных DD и WO заявок, могут использоваться в настоящем изобретении и ссылки на указанные известные патентные документы приведены для полной информации, касающейся общих и более конкретных формул и рассматриваемых индивидуальных соединений. Так, например, указанные в следующей ниже таблице пирролидиновые и тиазолидиновые кольца могут быть заменены большим числом других гетероциклов с различными размерами кольца и/или, как отмечается в упомянутых публикациях, указанные аминоацильные фрагменты могут быть заменены на большое число других групп, с получением других ингибиторов DP-IV, предназначенных для использования в настоящем изобретении.

Действие гормонов роста

Гормон роста (GH, Соматотропин) вырабатывается гипофизом в ответ на сигнал гипоталамуса в виде гормона, высвобождающего гормон роста (GHRH). Наиболее распространенная изоформа человеческого GH представляет собой пептид, содержащий 191 остаток, а GHRH представляет собой пептид, содержащий 44 остатка. GH является ключевым фактором стимуляции нормального развития ребенка и его дефицит может приводить к карликовости. У взрослых актуальность GH менее выражена, хотя взрослые и дети имеют аналогичные уровни содержания GH в плазме крови. По видимому, GH играет определенную роль в восстановлении тканей после травмы.

Современные терапевтические возможности, касающиеся недостаточности GH, включают в себя применение синтетического GH или GHRH. Однако в связи с тем, что оба рассматриваемых гормона имеют пептидную природу, возможность их перорального применения исключается. Обычно такие вещества применяют путем инъекций, которые могут причинять страдания пациенту (особенно детям), несмотря на развитие систем для инъекций без использования игл.

Кроме этого, однократная инъекция GHRH является лишь приближением к пульсирующему характеру высвобождения рассматриваемого фактора из гипоталамуса. Кроме этого, поскольку оба вещества представляют собой достаточно крупные пептиды, получение GHRH, и особенно GH, является дорогостоящей операцией. Из сказанного следует, что существует неудовлетворенная потребность в терапевтическом агенте, стимулирующем действие GH. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ингибиторы DP-IV способны повышать концентрацию циркулирующего GH.

Первый аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, предназначенной для лечения карликовости и аномального роста (например, у детей) и для стимуляции восстановления тканей (например, после травмы), причем указанная композиция характеризуется тем, что она включает в себя ингибитор DP-IV. Второй аспект настоящего изобретения относится к новому применению ингибиторов DP-IV, а именно к лечению карликовости и повреждения тканей. Третий аспект изобретения относится к усовершенствованной схеме ускорения роста детей и регенерации поврежденных тканей, согласно которой на объекте лечения применяют композицию, содержащую ингибитор DP-IV.

Рассматриваемое применение ингибиторов DP-IV обладает рядом преимуществ над современными лечебными режимами, включающими в себя применение GH и GHRH. GHRH, и особенно GH, представляют собой крупные пептиды, которые выделяют из природных источников (например, препаратов мозга животных) или готовят в культурной среде с использованием рекомбинантных клеток. Выделение из животных источников требует особого внимания из-за опасности передачи заболевания и наличия антигенных белковых примесей. Возможность переноса человеческих патогенов рекомбинантными гормонами менее вероятна, однако остается потенциальная возможность их загрязнения антигенным белком. GHRH может быть получен синтетическим способом, однако такой синтез является дорогостоящим и предусматривает тщательную очистку продукта. В отличие от этого ингибиторы DP-IV представляют собой легкодоступные мелкие молекулы, которые могут быть получены стандартными синтетическими методами. Такие материалы не являются антигенными, их легко очищать, и они имеют низкую стоимость.

Другое преимущество состоит в том, что ингибиторы DP-IV во многих случаях остаются биологически активными при пероральном применении. Последнее обстоятельство отличает эти материалы от GH и GHRH, которые должны применяться путем инъекций. Следовательно, использование ингибиторов DP-IV обеспечивает менее инвазивную лечебную схему, которая менее обременительная для пациента.

В соответствие с первым аспектом настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию для лечения патологического развития или карликовости. Рассматриваемая композиция особенно эффективна для лечения патологического развития или карликовости, связанных с недостатком гормона роста. В равной мере настоящее изобретение предусматривает композицию для стимуляции восстановления тканей.

Указанные композиции отличаются тем, что они включают в себя ингибитор DP-IV. Рассматриваемые композиции могут дополнительно содержать такие хорошо известные фармацевтически применимые эксципиенты, как разбавители, носители, наполнители, связывающие агенты, дисперсанты, стабилизаторы и т.п.

В контексте настоящего изобретения соединение считается ингибитором DP-IV, если оно ингибирует действие фермента при концентрации 1 мкМ. Предпочтительно, когда рассматриваемое соединение ингибирует действие DP-IV при концентрации ниже 100 нМ и не ингибирует другие ферменты при концентрации ниже 1 мкМ. В следующей ниже таблице представлены основные типы ингибиторов DP-IV, а также их конкретные примеры, которые предпочтительно применять в настоящем изобретении; в таблице также приведены ссылки на патентные источники, из широкой сферы которых, касающейся раскрытых соединений, взяты указанные типы и примеры. Следует подчеркнуть, что ингибиторы DP-IV, раскрытые в цитированных описаниях DD и WO заявок, могут применяться в настоящем изобретении и на эти документы непосредственно ссылаются для полной информации по общим и более конкретным вопросам, касающимся формул и рассматриваемых индивидуальных соединений. Так, например, в представленной ниже таблице указанные пирролидиновые и тиазолидиновые кольца могут быть заменены большим числом других гетероциклов с различными размерами кольца, и/или указанные аминоацильные фрагменты в соответствии с указанными публикациями могут быть заменены большим числом других групп с получением других ингибиторов DP-IV, предназначенных для использования в настоящем изобретении.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения ингибитор DP-IV представляет собой нитрил аминоацилпирролидина. Особенно предпочтительными веществами такого типа могут служить нитрилы аминоацилпирролидина, раскрытые в WO 95/15309 и WO 98/19998.

Композиции настоящего изобретения могут быть сформированы для применения на людях любым известным методом, включающим в себя пероральное применение, введение через слизистые оболочки (например, трансбуккальное, сублингвальное, интраназальное, вагинальное и ректальное применение), трансдермальное применение или применение в виде инъекций (включая внутривенную, внутримышечную и подкожную инъекции). Предпочтительным путем применения является пероральный прием. В этом случае композицию формируют в виде таблетки или капсулы.

Согласно второму аспекту настоящее изобретение включает в себя новое применение соединений, известных как ингибиторы DP-IV, в качестве терапевтических агентов для лечения замедленного развития или карликовости, либо для стимуляции восстановления тканей.

Согласно третьему аспекту настоящее изобретение включает в себя усовершенствованный способ лечения замедленного развития или карликовости, особенно тех аномалий, которые связаны с недостатком гормона роста, а также стимуляцию восстановления тканей, согласно которым на пациенте применяют фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество ингибитора DP-IV. Такое лечение включает в себя применение только указанной композиции или ее комбинации с другими описанными выше агентами. Лечение может проводиться путем применения разовой дозы или раздельных доз с интервалами, например, 2-6 часов. Согласно особенно предпочтительной схеме лечения композицию применяют один раз в день, вечером перед сном. Курс лечения, предназначенного для восстановления ткани, может длиться в течение нескольких дней или недель, или в течение более длительного времени при лечении замедленного развития. Опытный врач сумеет установить момент достижения необходимого конечного показателя лечения, а также определить подробности схемы приема лекарства.

Примеры

Пример 1. Приготовление ингибиторов.

Ингибиторы DP-IV могут быть получены с использованием методов, описанных в литературе. Синтез нитрилов аминоацилпирролидина описан в WO 95/15309 и WO 98/19998. Ниже описан способ, служащий иллюстрацией указанных методов.

Пример 1А – Синтез (2S)-N-изолейцилпирролидин-2-карбонитрила.

(а) трет-Бутилоксикарбонил-изолейцилпролинамид.

К перемешиваемой суспензии гидрохлорида пролинамида (225 мг, 1,50 ммоля) в сухом дихлорметане (15 мл) добавляли диизопропилэтиламин с получением прозрачного основного (рН 9) раствора. В систему в виде одной порции добавляли N-(трет-бутилоксикарбонилизолейцилокси)сукцинимид (328 мг, 1,0 ммоль) и полученную смесь перемешивали в течение 16 часов при комнатной температуре в атмосфере азота. Растворитель выпаривали в вакууме и полученный остаток распределяли между этилацетатом и 0,3 н. раствором бисульфата калия. Органический слой промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия, водой и рассолом, сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали фильтрацией через тонкий слой силикагеля, проводя элюирование сначала смесью гексан/этилацетат (10:90) и затем этилацетатом. В результате концентрирования элюата, содержащего продукт, получали целевое соединение в виде бесцветной вспененной стеклообразной массы; 301 мг (92%).

Спектр ¹ H ЯМР (СDСl₃): δ 6,90 (1Н, шир.с); 5,51 (1Н, шир.с); 5,18 (1Н, д, J=9,6 Гц); 4,62 (1Н, дд, J=2,6 и 7,0 Гц); 4,29 (1Н, дд, J=8,4 и 9,2 Гц); 3,79-3,58 (2Н, м); 2,36 (1Н, м); 2,09-1,57 (5Н, м); 1,43 (9Н, с); 1,17 (1Н, м); 0,95 (3Н, д, J=6,6 Гц); 0,90 (3Н, т, J=7,3 Гц) ч./млн.

(b) (2S)-N-(трет-Бутилоксикарбонилизолейцил)пирролидин-2-карбонитрил.

К перемешиваемому раствору амида, полученного в разделе (а) (203 мг, 0,62 ммоля), в сухом пиридине (10 мл) и в атмосфере азота добавляли имидазол (84 мг, 1,24 ммоля). Полученную смесь охлаждали до -35°С, после чего прикапывали оксихлорид фосфора (0,25 мл, 2,48 ммоля). Полученную смесь перемешивали в течение 1 часа, при этом температуре давали повышаться до -20°С, после чего растворитель удаляли в вакууме. Остаток очищали методом хроматографии на силикагеле с получением целевого соединения в виде бесцветного масла; выход 180 мг (94%).

Спектр ¹H ЯМР (СDСl₃): δ 5,14 (1Н, д, J=9,2 Гц); 4,80 (1Н, дд, J=2,6 и 7,1 Гц); 4,22 (1Н, дд, J=7,9 и 9,1 Гц); 3,81 (1Н, м); 3,71 (1Н, м); 2,30-2,12 (4Н, м); 1,75 (1Н, м); 1,60 (1Н, м); 1,42 (9Н, с); 1,19 (1Н, м); 0,97 (3Н, д, J=6,9 Гц); 0,91 (3H, т, J=7,3 Гц) ч./млн.

Спектр ¹³С ЯМР (CDCl₃): δ 171,7; 155,6; 118,0; 79,6; 56,0; 46,5; 46,0; 37,8; 29,6; 28,1; 25,0; 24,2; 15,2; 10,9 ч./млн.

(c) Трифторацетат (S)-N-(изолейцил)пирролидин-2-карбонитрила.

Нитрил из раздела (b) растворяли в трифторуксусной кислоте и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Растворитель выпаривали в вакууме и остаток растворяли в воде. Полученный раствор лиофилизировали с получением целевого соединения в виде белого пушистого твердого вещества; выход 60 мг.

Масс-спектр FAB: вычислено m/е 209,3; найдено 210,2 (М+Н)⁺

Спектр ¹Н ЯМР (D₂ O): δ 4,3 (1Н, м); 3,64 (1Н, д, J=5,6 Гц), 3,16 (2Н, м), 1,86-1,48 (5Н, м); 0,98 (1Н, м), 0,68 (1Н, м), 0,51 (3Н, д, J=6,9 Гц); 0,38 (3H, т, J=7,3 Гц) ч./млн.

Спектр ¹³С ЯМР (D₂O): δ 169,7; 119,7; 57,3; 48,6; 48,1; 36,9; 30,2; 25,8; 24,5; 15,4; 11,5 ч./млн.

Пример 1В - Синтез (2S)-N-((2'S)-2'-амино-3',3'-диметилбутаноил)пирролидин-2-карбонитрила

Указанное вещество получали, следуя методике, описанной в примере 1А, в результате замены производного изолейцина на соответствующее производное трет-бутилглицина.

Спектр ¹³C ЯМР (CD₃OD): δ 4,86-4, 81 (1Н, м); 4,04 (1Н, с); 3,77-3,71 (2Н, м); 3,34 (2Н, с); 2,34-2,08 (4Н, м); 1,14 (9Н, с) ч./млн.

Спектр ¹³С ЯМР (СD₃ОD): δ 167,40, 117,99, 58,78, 46,53, 34,21, 29,54, 25,22, 25,03 ч./млн.

Пример 2. Эффект циркуляции гормона роста.

Животные

Эксперименты проводили на самцах крыс Sprague-Dawley (200-220 г), полученных от Iffa Credo (L'Arbresle, France), которым давали стандартный корм ad llbitum и выдерживали в 12 часовом режиме свет-темнота в помещении с регулируемой температурой и влажностью.

Хирургическое вмешательство

Крыс взвешивали и анестезировали с помощью Narcorene. Вентральную сторону горла обривали и делали разрез по центру гортани. Обнажали правую яремную вену и в нее вставляли катетер из полиэтиленовой трубки (внешний диаметр 1,0 мм), соединенной с трубкой из силикона для медицинского применения (вн. диаметр 0,94 мм) (силиконовая часть вставлена в яремную вену). Трубку закрепляли и политеновую сторону пропускали через разрез на задней стороне шеи. Катетер промывали 300 мкл раствора Ringer, содержащего 0,1% гепарина. Крысам давали возможность восстанавливаться в течение, по крайней мере, 24 часов в индивидуальных клетках, предоставляя воду и пищу ad libitum.

Методика эксперимента

За 15 минут до инъекции GHRH (0,1 мкг/кг, внутривенно) делали инъекцию соединения примера 1В или его носителя (3 мг/кг, внутривенно). Образцы крови (200-250 мкл) отбирали непосредственно до инъекций ингибитора и GHRH и затем через 5, 10, 15, 20, 30 и 60 минут после инъекции GHRH. Каждый образец крови замещали эквивалентным объемом раствора Ringer, содержащего 0,1% гепарина. Плазму экстрагировали и хранили при -20°С до определения GH методом RIA.

Результаты

Соединение примера 1В усиливает выброс GH, индуцированный применением GHRH (таблица 1). Интегрированные ответные реакции GH составили 720,2±217,0 нг/мл 60 мин и 5072,8±837,3 нг/мл 60 мин в группах, обработанных носителем и ингибитором соответственно.

Таблица 1: Влияние ингибитора DP-IV примера 1В на выброс GH, индуцированный внутривенной инъекцией GHRH. Результаты представляют собой среднее значение GH в нг/мл для группы из 6 крыс ± среднее квадратичное отклонение.

Полученные результаты показывают, что ингибиторы DP-IV способны повышать уровни циркуляции гормона роста и, следовательно, подходят для лечения замедленного развития, связанного с недостатком гормона роста, а также других болезненных состояний, для которых важна стимуляция роста ткани.

Пример 3. Фармацевтическая композиция.

3А – 50 мг таблетка

Таблетки, содержащие эквивалент, соответствующий 50 мг соединения примера 1А в качестве активного агента, готовили из следующих ингредиентов, г:

Соединение Примера 1А (в виде

соли трифторуксусной кислоты) 154,5

Пшеничный крахмал 53,5

Гидроксипропилцеллюлоза 13,5

Карбоксиметилцеллюлоза кальция 11,0

Стеарат магния 2,0

Лактоза 165,5

Всего 400,0

Указанные материалы смешивали и затем прессовали с получением 2000 таблеток по 200 мг, каждая из которых содержала эквивалент, соответствующий 50 мг соединения примера 1А в виде свободного основания.

3В – 100 мг вагинальные свечи

Свечи, подходящие для вагинального применения и содержащие эквивалент, соответствующий 100 мг соединения примера 1А в качестве активного агента, готовили из следующих ингредиентов, г:

Соединение Примера 1А (в виде

соли трифторуксусной кислоты) 154,5

Пшеничный крахмал 210,0

Коллоидный оксид кремния 2,5

Povidone 30 49,0

Стеарат магния 23,0

Адипиновая кислота 57,0

Бикарбонат натрия 43,0

Лаурилсульфат натрия 5,0

Лактоза 456,0

Всего 1000,0

Перечисленные материалы смешивали друг с другом и затем прессовали с получением 1000 свечей массой в 1 г, каждая из которых содержала эквивалент, соответствующий 100 мг соединения примера 1А в виде свободного основания.

Приведенные выше примеры лишь иллюстрируют изобретение, раскрытое в настоящем документе, и не носят ограничительного характера. Некоторые расширения, рассматриваемые специалистом в данной области как эквивалентные, охватываются сферой настоящего изобретения и формулы изобретения, которая дополнительно определяет сферу притязаний.

Один или более ингибиторов DP-IV могут использоваться в качестве единого компонента, обладающего активностью, касающейся указанных предназначений рассматриваемой композиции и способа настоящего изобретения.

Формула изобретения

1. Применение ингибитора дипептидилпептидазы IV для приготовления терапевтической композиции для лечения замедленного развития или карликовости.

2. Применение по п.1, где замедленный рост или карликовость связаны с недостатком гормона роста.

3. Применение по п.1 или 2, при котором ингибитор дипептидилпептидазы IV содержит нитрил аминоацилпирролидина.

4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где терапевтическая композиция составлена для перорального применения.

5. Применение по п.4, где терапевтическая композиция составлена в виде таблетки или капсулы.

6. Применение по любому из предшествующих пунктов, при котором терапевтическую композицию вводят один раз в день - вечером.

7. Применение по любому из предшествующих пунктов, при котором один или более ингибиторов дипептидилпептидазы IV являются единственным компонентом терапевтической композиции, которая обладает активностью в связи с указанным предназначением.