Способ получения жидкого лактобактерина
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для производства пробиотических препаратов. Способ получения жидкого лактобактерина предусматривает оживление, культивирование пассажей лиофилизированной культуры и культивирование закваски лактобацилл на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат сухого обезжиренного молока ферментативный с содержанием аминного азота 1485 мг % - 30,0±0,3 г/л, автолизат дрожжей концентрированный - 110,0±10 г/л, агар пищевой - 0,8 г/л, воду дистиллированную до 1л. Культивирование закваски осуществляют до накопления биомассы лактобацилл 109-1010 КОЕ/мл. После чего из готового продукта удаляют 10-30% надосадочной жидкости и заменяют ее равным объемом свежей питательной среды. Изобретение позволяет упростить технологию получения жидкого лактобактерина и увеличить срок хранения жизнеспособных лактобацилл. 1 з.п ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и производству биологически активных добавок (БАД) и может быть использовано для получения пробиотического препарата (лактобактерина) на основе живых физиологически активных лактобацилл.
В лечении и профилактике дисбиозов человека широко используются лактобациллы, которые являются представителями нормальной микрофлоры кишечника и влагалища. Лактобактерин применяется в лиофилизированной форме (сухой) и в жидкой форме, представляющей взвесь в среде культивирования живых лактобацилл.
Экспериментальные исследования процесса колонизации деконтаминированного кишечника in vivo “жидкими” и лиофилизированными лактобациллами показали, что лиофилизированные лактобациллы слабо приживаются в тотально лактодеконтаминированном кишечнике и совсем не могут колонизировать слизистую частично деконтаминированного кишечника.
Исследование антагонистической активности лиофилизированного и “жидкого” лактобактерина in vitro показало невысокую способность лиофилизированных препаратов подавлять развитие условно-патогенных микроорганизмов (УПМ). “Жидкий” лактобактерин подавлял до 71,4% взятых в опыт энтеробактерий, а лиофилизированный - 9,8% (Глушанова Н.А., Блинов А.И. О взаимоотношениях резидентной микрофлоры с микроорганизмами пищевых добавок и продуктов функционального питания // Тезисы Международного симпозиума “Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания” 9-11 октября 2002 г. - Кемерово. - 2002. - С.20-21).
Известна молочно-дрожжевая среда для приготовления рабочей закваски лактобацилл, состава, г/л: гидролизат молока 500, дрожжевой аутолизат 50, глюкоза 2, вода до 1 литра, рН - не указано, но для среды МРС-1, предназначенной для выращивания лактобацилл, рН 6,2-6,6 (Инструкция по изготовлению кисломолочного бифилакта на молочных кухнях №11-14/6-33, утв. МЗ СССР 27.03.87).
При культивировании лактобацилл на этой среде при 37-38°С в течение 20-22 часов получают рабочую закваску, содержащую 6×108 КОЕ/мл (проверено нами).
Недостатком этой среды является трудоемкость и длительность приготовления в лабораторных условиях. Технология приготовления молочно-дрожжевой среды предусматривает две подготовительные стадии: получения гидролизата молока и получения дрожжевого аутолизата. Технология приготовления гидролизата молока предусматривает добавление уксусной кислоты и токсичного вещества - хлороформа (1% от объема), что делает невозможным применение внутрь (peros) лактобактерина на основе этой питательной среды.
Недостатком этой среды также является то, что она содержит глюкозу, присутствие которой способствует накоплению кислых продуктов метаболизма лактобацилл. В кислой среде происходит уменьшение титра жизнеспособных клеток лактобацилл при хранении при температуре (4±2)°С в течение 2 месяцев с 108 КОЕ/мл до 103 КОЕ/мл. Таким образом, данная среда не пригодна для получения жидкого лактобактерина с титром лактобацилл не менее 107 КОЕ/мл к концу срока хранения (2 месяца) при температуре (4±2)°С.
Наиболее близкой является жидкая неселективная питательная среда для накопления биомассы лактобацилл состава, г/л:
Гидролизат молока (без хлороформа) 200,0±50,0
Дрожжевой аутолизат концентрированный 100,0±20,0
Агар пищевой ГОСТ 16280-89 0,8
рН среды 6,2±0,1
Вода дистиллированная до 1 литра
Указанный состав питательной среды обеспечивает накопление биомассы лактобацилл в количестве от 108 до 109 КОЕ/мл и сохранение титра лактобацилл не менее 107 КОЕ/мл к концу срока хранения в течение 2 месяцев при температуре (4±2)°С. Основным достоинством этой среды является то, что она не содержит токсичные компоненты и лактобактерин на ее основе пригоден для употребления внутрь (Per os) (Глушанова Н.А., Блинов А.И. Лактобациллы в бактериологической диагностике и бактериотерапии вагинального лактодисбиоза / Учебно-методические рекомендации для врачей-бактериологов. - Новокузнецк. - 1999. - С.74).
Недостатком этой среды является трудоемкость изготовления в лабораторных условиях, включающая две подготовительные стадии (получение гидролизата молока и дрожжевого аутолизата концентрированного). Кроме того, гидролизат молока в своем составе содержит уксусную кислоту, которая оказывает ингибирующее действие на лактобациллы и снижает титр жизнеспособных лактобацилл при хранении. Для полного восстановления биологических свойств лиофилизированных лактобацилл проводят не менее 3-х пассажей культуры на жидкой питательной среде. Культуры лактобацилл 3-5 пассажей обладают наиболее высокой физиологической активностью и стойкостью (Глушанова Н.А., Блинов А.И. Лактобациллы в бактериологической диагностике и бактериотерапии вагинального лактодисбиоза / Учебно-методические рекомендации для врачей-бактериологов. - Новокузнецк. - 1999. - С.56).
Задача изобретения - создание более простой по технологии приготовления питательной среды для накопления биомассы живых физиологически активных лактобацилл, обеспечивающей длительное сохранение титра жизнеспособных лактобацилл.
Поставленная задача достигается тем, что при первом пассаже осуществляют оживление лактобацилл на жидкой питательной среде следующего состава, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока сухой
ферментативный 30,0±3,0
Аутолизат дрожжей концентрированный 110,0±10,0
Агар пищевой 0,8
Раствор едкого натра 20% до рН среды 6,4 ±0,1
Вода дистиллированная до 1 литра
при втором пассаже проводят посев на плотную питательную среду для культивирования лактобацилл, при третьем пассаже отбирают типичные колонии и осуществляют их культивирование в 10 мл той же жидкой питательной среды, проверяют чистоту культуры и делают посев в ту же жидкую питательную среду в соотношении 1:100 (четвертый пассаж), а культивирование на каждой стадии осуществляют в течение 14-20 часов при температуре (38±1)°С, после чего из готового продукта удаляют 10-30% надосадочной жидкости и заменяют ее равным объемом свежей жидкой питательной среды. Новизна заявляемого способа состоит в том, что для приготовления среды:
- используют гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный;
- рН среды 6,4±0,1;
- 10-30% надосадочной жидкости в готовом продукте заменяют свежей питательной средой.
В России для производства лиофилизированного лактобактерина применяются следующие штаммы лактобацилл: L.plantarum 8A-P3, L.plantarum 296 Д, L.fermentum 90TC4, L.fermentum 1-20 (Горьковский НИИ эпидемиологии и микробиологии, предприятие бак. препаратов и Пермский НИИВС), а также L.acidophilus 317/402 “Наринэ” (с. Петрово-Дальнее, АО “Биомед”). Эти штаммы лактобацилл разрешены МЗ РФ к применению и могут быть использованы для получения жидкого лактобактерина.
Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный (Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов “ИмБио”, содержание аминного азота 1485 мг %) в количестве 27,0-33,0 г/л является источником азота.
Аутолизат дрожжей концентрированный (содержание аминного азота 580-600 мг %) в количестве 100,0-120,0 г на 1 литр среды служит стимулятором роста и источником пластических веществ, способствующих регенерации лактобацилл, поврежденных действием лиофильного высушивания, а также способствует сохранению жизнеспособности лактобацилл при хранении жидкого лактобактерина.
Указанные количества гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного и аутолизата дрожжей концентрированного позволяют получить концентрацию аминного азота в питательной среде от 100 до 120 мг%, что обеспечивает накопление биомассы лактобацилл до 109-1010 КОЕ/мл.
Установление значения рН среды в пределах 6,3-6,5 обеспечивает оптимальные условия для накопления биомассы лактобацилл.
Замена от 10 до 30% надосадочной жидкости после накопления биомассы лактобацилл на свежую питательную среду способствует снижению титруемой кислотности лактобактерина и увеличению срока его хранения до 3 месяцев с титром не менее 108 КОЕ/мл. Замена более 30% надосадочной жидкости декантацией технологически затруднена, а использование центрифуги усложняет и удлиняет процесс. Замена менее 10% надосадочной жидкости не обеспечивает существенного увеличения срока хранения лактобактерина по сравнению с прототипом.
Сущность способа заключается в следующем.
Предварительно для полного восстановления биологических свойств лиофилизированного производственного штамма лактобацилл и получения рабочей закваски проводят не менее 3 пассажей и затем четвертый пассаж получение жидкого лактобактерина.
С этой целью в асептических условиях содержимое флакона лиофилизированной культуры лактобацилл растворяют в 5 мл жидкой питательной среды следующего состава, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока сухой
ферментативный 30,0±3,0
Аутолизат дрожжей концентрированный 110,0±10,0
Агар пищевой 0,8
Раствор едкого натра 20% до рН среды 6,4±0,1
Вода дистиллированная до 1 литра
и переносят во флакон, содержащий 25-30 мл жидкой питательной среды того же состава, инкубируют при (38±1)°С в течение 16-18 часов (первый пассаж). Затем из культуры первого пассажа делают посев бактериологической петлей с целью получения изолированных колоний лактобацилл (2-й пассаж) на поверхности плотной питательной среды для культивирования лактобацилл.
Например, следующего состава, г/л:
Гидролизат обезжиренного молока сухой
ферментативный 33,0
Аутолизат дрожжей концентрированный 100,0
Агар технический 20,0
Раствор едкого натра 20% 1,1 мл до рН среды 6,34
Вода дистиллированная 900,0
в коническую колбу вместимостью 1 литр помещают 100,0 мл аутолизата дрожжей концентрированного (содержание аминного азота 600 мг%), 33,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг%), 20,0 г агара технического, воды дистиллированной 900 мл, 1,1 мл 20%-ного раствора едкого натра до рН 6,34, нагревают на водяной бане до расплавления агара. Содержание аминного азота в плотной питательной среде 109 мг%. Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и обвязывают пергаментной бумагой, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)°С в течение 15 минут, охлаждают до температуры 45-50°С и разливают в асептических условиях по 20 мл в стерильные чашки Петри. После застывания агара чашки помещают в стерильные пластиковые пакеты по 2-3 штуки, герметично закрывают и хранят при температуре (4±2)°С в течение недели. Перед использованием чашки подсушивают в термостате при температуре (38±1)°С.
Все указанные ранее штаммы лактобацилл являются термофильными и факультативно анаэробными бактериями, поэтому хорошо растут на поверхности плотной питательной среды для культивирования лактобацилл в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода при температуре (38±1)°С.
Использование в заявляемом способе 0,8 г/л агара в составе жидкой питательной среды повышает вязкость, что уменьшает растворимость кислорода в толще среды и делает необязательным присутствие в атмосфере культивирования 5% углекислого газа и 16% кислорода.
В качестве плотной питательной среды могут быть использованы любые среды, предназначенные для культивирования лактобацилл, например, “Лактобакагар” (142279 п.Оболенск Отделение “Питательные среды” ГНЦ ПМ). В нашем случае введение в состав заявляемой жидкой питательной среды 18,0-20,0 г/л агара позволяет получить плотную питательную среду для выделения изолированных колоний лактобацилл, что дает возможность отбирать наиболее типичные колонии, соответствующие паспортным данным штамма.
Чашки Петри с посевами инкубируют крышкой вниз при температуре (38±1)°С в течение 18-20 часов, в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа и 16% кислорода, после чего отбирают типичные колонии. Каждую колонию засевают в пробирку с 10 мл жидкой питательной среды (3-й пассаж), инкубируют при температуре (38±1)°С в течение 14-16 часов, проверяют чистоту культуры лактобацилл в каждой пробирке и используют в качестве рабочей закваски для получения жидкого лактобактерина (4-й пассаж).
Получение жидкого лактобактерина: в 1 литр приготовленной жидкой питательной среды при температуре (38±1)°С в асептических условиях вносят 10 мл рабочей закваски (культуры лактобацилл 3-го пассажа), перемешивают, инкубируют при температуре (38±1)°С в течение 15-17 часов. Отбирают стерильной пипеткой в асептических условиях 5 мл надосадочной жидкости и определяют титруемую кислотность по Тернеру, которая должна быть в пределах 80-95°Т. Не взбалтывая осадок, в асептических условиях, при помощи стерильной стеклянной трубки с резиновым шлангом осторожно удаляют 100-300 мл надосадочной жидкости и добавляют соответственно 100-300 мл жидкой питательной среды. Содержимое колбы перемешивают и отбирают 5 мл для определения титруемой кислотности и 0,5 мл для определения титра лактобацилл.
Методика определения титруемой кислотности по Тернеру: 5 мл биомассы лактобацилл в среде накопления помещают в коническую колбу вместимостью 50 мл, добавляют 10 мл дистиллированной воды, 2 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина и титруют 0,1 М раствором NaOH до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 2 минут. Кислотность биомассы лактобацилл в градусах Тернера (°Т) определяют по формуле: °Т=V×К×20, где V - количество мл 0,1 М раствора NaOH, пошедшее на титрование; К - поправочный коэффициент к титру 0,1 М раствора NaOH; 20 - коэффициент пересчета.
Методика определения титра лактобацилл: в 10 пробирок разливают по 4,5 мл заявляемой жидкой питательной среды. В первую пробирку с помощью дозатора вносят 0,5 мл испытуемой культуры, а затем титруют по 0,5 мл, сменяя наконечники, т.о. получают разведения от 10-1 до 10-10. Инкубируют пробирки при температуре (38±1)°С в течение 18-20 часов. Учет результатов производят путем подсчета отдельных колоний в столбике среды в 2-3 пробирках наибольшего разведения, где еще наблюдается рост. Число колоний умножают на 2 и на степень разведения и получают титр лактобацилл, т.е. число колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл лактобактерина. Для получения более точного результата делают параллельный ряд разведений. Результат определяют как среднее значение от двух определений.
Фасовка готового лактобактерина: разливают по 10 мл в асептических условиях в стерильные флаконы, укупоривают стерильными резиновыми пробками и металлическими колпачками под обкатку, хранят при температуре (4±2)°С в течение 3 месяцев. К концу срока хранения жидкого лактобактерина титр лактобацилл не менее 108 КОЕ/мл.
Контрольные бактериологические исследования получаемого лактобактерина на отсутствие посторонней микрофлоры проводят по методике контроля продукции детских молочных кухонь (Инструкция по приготовлению кисломолочного бифилакта на молочных кухнях №11-14/6-33. - Утв. 27.03.87. МЗ СССР, - М., 1987). Основным условием получения качественного лактобактерина является строгое соблюдение правил асептики на всех стадиях его изготовления.
Технология приготовления аутолизата дрожжей концентрированного
Для приготовления аутолизата необходимо брать только качественные дрожжи, без признаков высыхания. Срок хранения дрожжей при (2±2)°С со дня выпуска не должен превышать 3-х дней, влажность массы в день выпуска 75%. 1 кг прессованных пекарских дрожжей нарезают небольшими кусками и закладывают в стеклянную емкость вместимостью 2 л, закрывают полиэтиленовой крышкой, затем помещают в термостат на 2 суток при (59±1)°С, 1-2 раза в сутки емкость встряхивают. Конец аутолиза характеризуется полным разжижением дрожжей. Аутолизат должен иметь коричневый оттенок и приятный запах. Аутолизат охлаждают до комнатной температуры и помещают в холодильник для отстаивания в течение 18-24 часов. Аутолизат центрифугируют при 6000 об/мин в течение 15 мин, коричневую прозрачную надосадочную жидкость разливают по флаконам емкостью 100 мл, укупоривают резиновыми пробками и металлическими колпачками под обкатку, стерилизуют при 1 атм. (120°С) в течение 30 мин. Хранят при (4±2)°С до 1 месяца. Из 1 кг дрожжей получают 0,40-0,47 л дрожжевого аутолизата концентрированного. Содержание аминного азота в аутолизате 580-600 мг %.
Пример 1.
Приготовление жидкой питательной среды и получение жидкого лактобактерина: в коническую колбу вместимостью 1 литр помещают 120,0 мл аутолизата дрожжевого концентрированного (содержание аминного азота 600 мг %), 33,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг %), воды дистиллированной 880 мл, перемешивают до полного растворения гидролизата молока, добавляют 1,5 мл 20%-ного раствора едкого натра до рН 6,5; добавляют 0,8 г агара пищевого, нагревают на водяной бане до расплавления агара. Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и обвязывают пергаментной бумагой, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)°С в течение 15 минут. После стерилизации питательную среду быстро охлаждают, поместив колбу в водяную баню с температурой 15-20°С, периодически перемешивают для ускорения охлаждения и равномерного распределения агара в объеме среды. Содержание аминного азота в приготовленной жидкой питательной среде 121 мг %.
Перед посевом питательную среду нагревают на водяной бане до температуры (38±1)°С, добавляют 10 мл рабочей закваски (L.acidophilus 317/402), инкубируют при температуре 37°С в течение 16 часов. Не взбалтывая осадок, отбирают в асептических условиях стерильной пипеткой 5 мл надосадочной жидкости и определяют титруемую кислотность после инкубации (95,0°Т). Затем удаляют в асептических условиях 300 мл надосадочной жидкости и добавляют 300 мл стерильной свежей жидкой питательной среды, содержимое колбы перемешивают до получения однородной массы, отбирают 5 мл готового лактобактерина для определения титруемой кислотности и для определения титра жизнеспособных лактобацилл. В данном примере в готовом лактобактерине титр лактобацилл 9×109 КОЕ/мл, титруемая кислотность 72,5°Т. Результаты ежемесячного определения титра лактобацилл и титруемой кислотности в течение срока хранения (4 месяцев) представлены в таблице, из которой следует, что через 3 месяца хранения титр лактобацилл 7×108 КОЕ/мл, а титруемая кислотность 75,5°Т; через 4 месяца хранения титр лактобацилл 2×107 КОЕ/мл, а титруемая кислотность 78,5°Т.
Пример 2
Приготовление жидкой питательной среды и получение жидкого лактобактерина: в коническую колбу вместимостью 1 литр помещают 110,0 мл аутолизата дрожжевого концентрированного (содержание аминного азота 600 мг%), 30,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг %), воды дистиллированной 890 мл, перемешивают до полного растворения гидролизата молока, добавляют 1,3 мл 20%-ного раствора едкого натра до рН 6,4; добавляют 0,8 г агара пищевого, нагревают на водяной бане до расплавления агара. Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и обвязывают пергаментной бумагой, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)°С в течение 15 минут. После стерилизации питательную среду быстро охлаждают, поместив колбу в водяную баню с температурой 15-20°С, периодически перемешивают для ускорения охлаждения и равномерного распределения агара в объеме среды. Содержание аминного азота в приготовленной жидкой питательной среде 108,7 мг %. Перед посевом питательную среду нагревают на водяной бане до температуры (38±1)°С, добавляют 10 мл рабочей закваски (L.acidophilus 317/402), инкубируют при температуре 37°С в течение 15 часов. Не взбалтывая осадок, отбирают в асептических условиях стерильной пипеткой 5 мл надосадочной жидкости и определяют титруемую кислотность после инкубации (89,8°Т). Затем удаляют в асептических условиях 200 мл надосадочной жидкости и добавляют 200 мл стерильной свежей жидкой питательной среды, содержимое колбы перемешивают до получения однородной массы, отбирают 5 мл готового лактобактерина для определения титруемой кислотности и для определения титра жизнеспособных лактобацилл. В данном примере в готовом лактобактерине титр лактобацилл 5×109 КОЕ/мл, титруемая кислотность 74,3°Т. Результаты ежемесячного определения титра лактобацилл и титруемой кислотности в течение срока хранения (4 месяцев) представлены в таблице, из которой следует, что через 3 месяца хранения титр лактобацилл 11×108 КОЕ/мл, а титруемая кислотность 80,3°Т; через 4 месяца хранения титр лактобацилл 3×107 КОЕ/мл, а титруемая кислотность 82,7°Т.
Пример 3
Приготовление жидкой питательной среды и получение жидкого лактобактерина: в коническую колбу вместимостью 1 литр помещают 100,0 мл аутолизата дрожжевого концентрированного (содержание аминного азота 600 мг%), 27,0 г гидролизата обезжиренного молока сухого ферментативного (содержание аминного азота 1485 мг %), воды дистиллированной 900 мл, перемешивают до полного растворения гидролизата молока, добавляют 1,0 мл 20%-ного раствора едкого натра до рН 6,3; добавляют 0,8 г агара пищевого, нагревают на водяной бане до расплавления агара. Колбу закрывают ватно-марлевой пробкой и обвязывают пергаментной бумагой, стерилизуют в автоклаве при температуре (121±1)°С в течение 15 минут. После стерилизации питательную среду быстро охлаждают, поместив колбу в водяную баню с температурой 15-20°С, периодически перемешивают для ускорения охлаждения и равномерного распределения агара в объеме среды. Содержание аминного азота в приготовленной жидкой питательной среде 100,1 мг %.
Перед посевом питательную среду нагревают на водяной бане до температуры (38±1)°С, добавляют 10 мл рабочей закваски (L.acidophilus 317/402), инкубируют при температуре 37°С в течение 17 часов. Не взбалтывая осадок, отбирают в асептических условиях стерильной пипеткой 5 мл надосадочной жидкости и определяют титруемую кислотность после инкубации (85,2°Т). Затем удаляют в асептических условиях 100 мл надосадочной жидкости и добавляют 100 мл стерильной свежей жидкой питательной среды, содержимое колбы перемешивают до получения однородной массы, отбирают 5 мл готового лактобактерина для определения титруемой кислотности и для определения титра жизнеспособных лактобацилл. В данном примере в готовом лактобактерине титр лактобацилл 4×109 КОЕ/мл, титруемая кислотность 70,8°Т. Результаты ежемесячного определения титра лактобацилл и титруемой кислотности в течение срока хранения (4 месяцев) представлены в таблице, из которой следует, что через 3 месяца хранения титр лактобацилл 12×108 КОЕ/мл, а титруемая кислотность 73,7°Т; через 4 месяца хранения титр лактобацилл 8×107 КОЕ/мл, а титруемая кислотность 76,2°Т.
Таким образом, полученные результаты доказывают, что заявляемый способ получения жидкого лактобактерина позволяет не только упростить технологию приготовления питательной среды за счет исключения стадии ферментативного гидролиза молока, но и расширить ассортимент питательных сред, предназначенных для накопления биомассы бактерий рода Lactobacillus. При этом новая среда для получения жидкого лактобактерина обладает достаточными ростовыми и буферными свойствами. Замена 10-30% надосадочной жидкости после культивирования лактобацилл на свежую питательную среду позволяет значительно увеличить срок сохранения жизнеспособных физиологически активных лактобацилл (титр не менее 108 КОЕ/мл при хранении в течение 3 месяцев). Жидкий лактобактерин, полученный по заявляемому способу, используется в научной работе на кафедре микробиологии Новокузнецкого ГИДУВа.
| Таблица | |||
| Титр, срок хранения и титруемая кислотность лактобактерина (L.acidophilus 317/402) в зависимости от соотношения компонентов питательной среды | |||
| Изменяемые параметры | Пример №1 | Пример №2 | Пример №3 |
| Гидролизат обезжиренного молока сухой ферментативный (аминный азот 1485 мг %), г | 33 | 30 | 27,0 |
| Дрожжевой аутолизат концентрированный (содержание аминного азота 600 мг %), мл | 120,0 | 110,0 | 100,0 |
| Агар пищевой, г | 0,8 | 0,8 | 0,8 |
| Вода дистиллированная, мл | 880,0 | 890,0 | 900,0 |
| Раствор едкого натра 20%, мл | 1,5 | 1,3 | 1,0 |
| рН среды | 6,5 | 6,4 | 6,3 |
| Время инкубации 4-го пассажа лактобацилл, час | 16 | 15 | 17 |
| Титруемая кислотность после инкубации, °Т. | 95,0 | 89,8 | 85,2 |
| Титр лактобацилл после инкубации 4-го пассажа, КОЕ/мл | 12×109 | 7×109 | 5×109 |
| Количество свежей питательной среды, введенной взамен удаляемой надосадочной жидкости, мл | 300,0 | 200,0 | 100,0 |
| Титруемая кислотность готового лактобактерина, °Т. | 72,5 | 74,3 | 70,8 |
| Титр лактобацилл в готовом лактобактерине, КОЕ/мл | 9×109 | 5×109 | 4×109 |
| Титруемая кислотность через 1 месяц хранения при температуре (4±2)°С, °Т | 72,7 | 74,8 | 71,5 |
| Титр лактобацилл через 1 месяц хранения при температуре (4±2)°С, КОЕ/мл | 5×109 | 4×109 | 3×109 |
| Титруемая кислотность через 2 месяца хранения при температуре (4±2)°С, °Т | 73,1 | 75,3 | 72,4 |
| Титр лактобацилл через 2 месяца хранения при температуре (4±2)°С, КОЕ/мл | 3×109 | 2×109 | 16×108 |
| Титруемая кислотность через 3 месяца хранения при температуре (4±2)°С, °Т | 75,5 | 76,2 | 73,7 |
| Титр лактобацилл через 3 месяца хранения при температуре (4±2)°С, КОЕ/мл | 7×108 | 11×108 | 12×108 |
| Титруемая кислотность через 4 месяца хранения при температуре (4±2)°С, °Т | 78,5 | 82,7 | 76,2 |
| Титр лактобацилл через 4 месяца хранения при температуре (4±2)°С, КОЕ/мл | 2×107 | 3×107 | 8×107 |
1.Способ получения жидкого лактобактерина, включающий оживление и культивирование пассажей лиофилизированной культуры лактобацилл на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат сухого обезжиренного молока, концентрированный автолизат дрожжей, агар пищевой, раствор едкого натра, дистиллированную воду, посев на плотную питательную среду для культивирования лактобацилл, отбор типичных колоний, культивирование закваски лактобацилл на жидкой питательной среде того же состава до заданного значения накопления биомассы лактобацилл, отличающийся тем, что оживление, культивирование пассажей лиофилизированной культуры и культивирование закваски лактобацилл ведут на жидкой питательной среде, содержащей гидролизат сухого обезжиренного молока ферментативный с содержанием аминного азота 1485 мг % при следующем содержании компонентов, г/л:
Гидролизат сухого обезжиренного молока
ферментативный с содержанием аминного
азота 1485 мг % 30,0±3,0
Автолизат дрожжей концентрированный 110,0±10,0
Агар пищевой 0,8
Вода дистиллированная До 1 л
при этом культивирование закваски осуществляют до накопления биомассы лактобацилл 109-1010 КОЕ/мл, из готового продукта удаляют 10-30% надосадочной жидкости и заменяют ее равным объемом свежей питательной среды.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование на каждой стадии осуществляют в течение 14-20 ч при значении рН среды 6,4±0,1.
