Эндогенная фармацевтическая композиция, полученная на основе целенаправленной активации гуморальных медиаторов нервных окончаний коры головного мозга
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается средств для лечения патологических состояний с нарушением синтеза нейромедиаторов. Сущность изобретения состоит в создании фармацевтической композиции (ЭФК), а также способа получения. Фармацевтическая композиция представляет собой субклеточную фракцию синаптосом: синаптические мембраны (СМ), "легкие" синаптосомы (ЛС) и "тяжелые" синаптосомы (ТС), полученную из серого вещества больших полушарий головного мозга экспериментальных животных на основе целенаправленной модификации гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, при развитии и регрессии опухолевых процессов. Технический результат - композиция позволяет ингибировать рост опухолевых клеток, увеличить продолжительность жизни больных с асцитной карциномой Эрлиха, аденокарциномой молочной железы Са-755, карциносаркомой Уокера-256. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 3 табл.
Настоящее изобретение относится к области медицины и биотехнологии и касается фармацевтической композиции на основе нейромедиаторов, способам ее формирования и использования.
Показан возможный, принципиально новый способ получения лекарств на примере получения эндогенной фармацевтической композиции, представляющей собой комплекс нейромедиаторов, путем целенаправленной модификации гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, из коры головного мозга экспериментальных животных.
Предпосылки создания изобретения:
1. В последние годы значительно увеличилось количество обнаруженных в организме эндогенных, физиологически активных соединений, осуществляющих регуляцию нервных и гуморальных процессов.
Наряду с открытием “классических” эндогенных регуляторов - нейромедиаторов - ацетилхолина, норадреналина, дофамина, серотонина и ряда других, выявлена нейромедиаторная роль большой группы веществ пептидной природы - нейропептидов.
Помимо этих соединений, участвующих в передаче возбуждения в области синапсов, получены и широко изучаются эндогенные ростовые факторы мозга, а также ряд биогенных веществ, иногда относящихся к медиаторным структурам (гистамин, брадикинин, простогландины, аденозин и др.)
Эти группы эндогенных веществ в последние годы пополнились обнаружеными субпопуляциями адренергических (аМ1, аМ2, вМ1, вМ2), холинергических (M1, М2, М3), дофаминергичских (Д1, Д2), гистаминовых (H1, Н2, Н3), серотониновых (С1, С2, С3-5НТ1, 5-НТ2, 5-НТ) и других рецепторов.
Большинство нейромедиаторов выделено из организма в чистом виде, расшифрована их структура и осуществлен их синтез.
Параллельное развитие революционных воззрений на возможность получения новых лекарств путем воспроизведения и видоизменения естественных эндогенных соединений растений, животных и человека, а также разработка новых методов (таких, например, как сплайсинг - или рекомбинантная ДНК технология, генная инженерия и т.д.) привели к созданию целого ряда эффективных средств (инсулин, интерферон, гормон роста человека и многих других).
Эндогенные соединения выявляются в процессе раскрытия механизмов патогенеза различных заболеваний.
Получение и практическое использование новых фармацевтических средств, базирующихся на основе этих знаний, осуществляется в настоящее время по ряду направлений:
1.1. Путь установления истины и введение извне “сходного лекарства”.
1.2. Использование в качестве фармацевтических средств различных тканей человека и животных.
1.3. Путь “запуска” выработки собственных эндогенных средств, способных блокировать появившиеся нарушения в регуляции нормальных физиологических процессов в организме человека и животных.
Глобальное развитие получает первый (1.1) путь исследований. Этому способствует стремительное развитие современной исследовательской техники и использование возникших возможностей проведения экспериментальных работ на культуре клеток, “точечной” иммуногистохимии, технологии молекулярного клонирования, а также привлечение компьютерной технологии. В короткий срок получены огромные массивы информации по структурированию различных биорегуляторов, особенно нейропептидов (трофических и регуляторных).
Нейропептиды, гормоны, низкомолекулярные трансмиттеры, нейротрофины и другие тканевые ростовые факторы, амилоидные и апоптозные белки, функциональные аминокислоты, белки трансдукторных систем - это далеко не полный перечень химических биорегуляторов мозга в норме и при патологии. Изучению этих физиологически активных пептидов, а также нейротрофических ростовых факторов применительно к деятельности мозга посвящены десятки тысяч публикаций только в последние пять лет.
Такой интерес обусловлен появляющимися новыми воззрениями, в ходе анализа данных лабораторного и клинического изучения высших форм поведения человека и животных, а именно обнаружение материальных причин функционирования психосоматической сферы деятельности нервной системы, таких как память, страх, мотивированное поведение, лекарственная зависимость, хранение и переработка информации нейронами головного мозга, возникновение и развитие заболеваний и т.д.
Формирующаяся новая стратегия, заложенная в основу создания более эффективных лекарственных средств для коррекции различного рода наиболее значимых патологий и особенно таких, как вирусные инфекции, AIDS, сердечно-сосудистые заболевания, аутоиммунные расстройства и онкозаболевания, вызывает повышенный и практический интерес.
Наиболее заметным достижением явилось создание нейротропных лекарственных средств, в качестве которых используются естественные нейромедиаторы. Эффективными оказались и синтетические аналоги эндогенных нейромедиаторов, имеющие с ними структурное сходство, а также лекарственные средства, действующие преимущественно на различные подгруппы их рецепторов.
Кроме того, установлено, что ряд лекарственных средств (противогистаминных, нестероидных, противовоспалительных и др.) в основе механизма действия имеют влияние на образование и метаболизм таких “медиаторных” веществ, как гистамин, простогландины, брадикинин и другие.
Накопление экспериментальных и практических данных в этих областях исследования привело к осознанию и сделало все более доказательным теорию о ведущей роли центральной нервной системы, а именно головного мозга, в химической регуляции различных процессов в организме человека и животных, а также постулата о том, что “развитие любой патологии есть нарушение регуляторной соразмерности в системе химических фактров нервной системы. И что суть лечения большинства патологий состоит в восстановлении соразмерности функционирования нейрохимических систем на основе конкретного знания, связанного, в частности, с нейропептидами, ростовыми факторами, другими биорегуляторами (О.А.Гомазков, “Нейропептиды и ростовые факторы мозга”, М., 2002 г., с.239).
В настоящее время на основе полученных данных и изучения отдельных аспектов функционирования головного мозга предлагается ряд лекарственных средств.
Так в известной фармацевтической композиции (заявка FR 94/00851 от 08.07.94, МПК С 12 N 15/80, С 12 N 5/10, А 61 К 39/12) на основании знаний ряда патологических состояний с нарушением синтеза нейромедиаторов предлагается введение гена, кодирующего нейромедиаторы в дефектный аденовирус (лишенный патофизиологической активности), и затем использование этого вируса в фармацевтических препаратах для лечения тех заболеваний, где необходим синтез нейромедиаторов. Дефектный рекомбинантный аденовирус с терапевтическим геном предлагается выбирать из генов, кодирующих ферменты, продукты крови, гормоны, лимфокины (интерлейкины, интерфероны, TNF и т.д.), факторы роста, нейромедиаторы, или их предшественники, или ферменты синтеза, трофические факторы (BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT и т.д.), аполипопротеины (ApoA1, АроА1У, АроЕ и т.д.), дистрофии, мини-дистрофин, генов-супрессоров опухолей или генов, кодирующих факторы, участвующие в коагуляции (факторы VII, VIII, IX и т.д.).
Казалось бы, что создана и предлагается целая серия фармацевтических средств, содержащих хотя бы по одному модифицированному дефектному рекомбинантному аденовирусу и фармацевтическому носителю. Тем не менее, неоспоримая биологическая активность этих средств не позволяет принципиально решить проблему эффективного купирования означенных патологических состояний, тем более таких, как опухолевые процессы, так как в основе этих работ были использованы знания отдельных звеньев функционирования центральной нервной системы, а вопрос о поломке синтеза нейромедиаторов (его механизма и причинах) не являлся предметом рассмотрения.
Частным случаем в лечении каскада патологий является и известное нецитологическое вещество, рекомендуемое для лечения боли при злокачественных заболеваниях, являющееся модифицированным нейротоксином клостридий, полученное на основе имеющихся данных по экспрессии пептидов в синапсах. Оно способно подавлять экзоцитоз по крайней мере одного нейромедиаторного или нейромодуляторного вещества из дискретных популяций нейронов, снижая при этом передачу афферентных болевых сигналов от периферических к центральным болевым волокнам и может использоваться в виде лекарства для лечения боли, особенно хронической боли (Заявка РСТ: GB 96/00916 от 16.04.1996 г., кл. С 12 N 15/31, 9/52,15/62, С 07 К 19/00, 14/33, 14/48, А 61 К 38/16). Однако, разработка способа регуляции выделения нейромедиатора или нейромодулятора из первичных сенсорных афферентных клеток или из первичных ноцицептивных афферентных клеток с помощью этого вещества, основанная на использовании частного случая каскада болевого синдрома, позволила соответственно получить возможность снижения болевого синдрома, но не возможность его блокирования при злокачественном заболевании. Здесь мы видим пример получения экзогенных регуляторных веществ по экспрессии пептидов в синапсах и создание малоэффективного симптоматического средства.
Путь установления отдельных аспектов истины и введение извне” сходного” лекарства способствовал не только разработке малоэффективных лекарств, но и создавал возможность нарушения естественных физиологических процессов.
Так, известно, что целый ряд синтетических лекарственных средств имеет структурное сходство с эндогенными нейромедиаторами. Эти синтетические аналоги могут, связываясь с рецепторами, препятствовать действию эндогенных лигандов, т.е. являться их антагонистами. Действие синтетических нейротропных лекарственных средств может также быть связанным с влиянием на биосинтез и метаболизм естественного пула нейромедиаторов и иметь непредсказуемые последствия.
Кроме того, синтетические природные лекарства, полученные на основании “сходства” с природными регуляторами, такие, например, как инсулин или интерферон, оказались дорогостоящими и трудоемкими в производстве и мало удобными в приеме пациентами, т.к. они состоят из крупных молекул, быстро разрушающихся в организме, поэтому необходимо делать частые инъекции. Есть и еще серия недостатков у таких лекарств, а именно - наличие избирательности. Лекарство, которое исцеляет одних больных, может оказаться смертельно опасным для других. Создание таких препаратов имеет и ту нежелательную сторону, что, прекрасно оказывая эффект в лабораторных условиях, иначе воздействует на человеческий организм.
Для получения значимых фармацевтических композиций предпринимаются также попытки использовать ткани человека или животных (1.2) на основании тех или иных теоретических предпосылок.
Так, для создания противоопухолевого вещества предлагается использовать мозг крупного рогатого скота (SU №944191, кл. 5 А 61 К 35/30). Или для лечения новообразований мозга использовать белково-пептидный комплекс из тканей головного мозга эмбриона животного вместе с его мягкими тканями (RU №2128510, кл.6 А 61 К 35/30, 35/48; RU №2128513, кл.6 А 61 К 35/48).
Отмечается, что при клиническом использовании такого белково-липидного комплекса в нейроонколгии, у каждого четвертого больного выявляется значительное улучшение общего состояния. Понятно, что такие пациенты ждут иных результатов и других фармацевтических средств.
Предлагается также фармацевтическая композиция из мышечных клеток или лейкоцитов (US, IL, кл. А 61 К 35/34; 35/16, С 12 Р 1/00, G 01 N 33/50//(С 12 Р 1/00, C 12 R 1/91) для ингибирования роста опухолевых клеток без влияния на рост неопухолевых клеток костного мозга или неопухолевых лимфоцитов. Предполагается, что этот регулятор роста, введенный орально, благодаря активации иммунной системы будет способствовать излечению таких заболеваний, как рак. К сожалению, практика показала нерезультативность в конечном варианте иммуномодуляторов (самых различных) при таких процессах, отмечая при этом всегда целый ряд положительных воздействий.
Известен также пул белков, выделенный из ткани пуповины плода человека (RU №2055589, кл. А 61 К 35/44; 1996 г.), обладающий способностью подавлять опухолевый рост также за счет иммуномодулирующего эффекта.
Предпринимаются попытки лечения злокачественных образований с помощью включения внутренних ресурсов организма, используя для этого субстрат, полученный путем разрушения нативных злокачественных клеток, который в дальнейшем выступает в роли супрессорно-киллерных Т-клеток.
Однако известные практические результаты, связанные с использованием методов с разрушающим воздействием на опухоль (радиотерапия, облучение опухоли инфракрасными лучами, химиотерапия и т.д.), побуждают исследователей продолжать поиски более эффектных средств даже этого направления.
В настоящее время проходит испытания ряд противоопухолевых препаратов, где вместо химиотерапии или радиологической обработки опухоли ученые предлагают перекрывать пути ее питания. Считается, что этот подход достаточно перспективен, т.к. эти новые лекарственные вещества, называемые ингибиторами ангиогинеза, могут приостановить развитие рака практически любого типа, не оказывая побочного токсического воздействия.
Таких новых препаратов, пока экспериментальных, известно уже больше десяти.
Самым перспективным считаются ангиостатин и эндостатин, которые выделены из мочи мышей Фолкменом и его коллегой Майклом О’Рейли (корпорация Med Inc. из Роквилла, шт. Мэриленд). Все опыты и успехи получены ими на мышах (60-80% уменьшение меланомы).
По направлению 1.2 существует ряд исследований, которые также пока носят экспериментальный или теоретический характер, как в случае с предложением использовать эмбриональные стволовые клетки, для обновления различных систем и функций.
Самым главным недостатком всех этих (пп.1.1 и 1.2) средств остается то, что при практическом использовании они не отвечают назревшим необходимым требованиям к фармацевтическому средству, а именно:
- способность излечить;
- отсутствие побочных эффектов;
- длительность действия;
- отсутствие зависимости.
Однако существует отчетливое понимание того факта, что живые системы способны к самоподдержанию и самовосстановлению, если патологические изменения не носят необратимый характер вследствие значимого нарушения целостности структуры или не прекращающегося негативного воздействия. Даже растения способны следовать этому постулату. Так Pinus sylvestris L. в ответ на воздействие стрессовых факторов: техногенные воздействие, низкие температуры или грибковые болезни, осуществляет переориентацию в синтезе вторичных метаболитов. Установлено, что возрастает степень ненасыщенности жирных кислот липидов, усиливается синтез низкомолекулярных жирных кислот и наиболее летучих компонентов. Причем в условиях холода для предотвращения образования в живых клетках льда синтезируются липиды жидкой консистенции, а в период покоя идет увеличение содержания эфирных масел - запас впрок.
Предполагается, что лекарственные средства, полученные на основе использования принципа, что соединения, созданные самим организмом человека или животных или полученные на основе других естественных методов борьбы с болезнью, могут действовать более результативно.
Многообещающие исследования по направлениям 1.1 и 1.2, базирующиеся на этих же принципах, но использовавшие методы отдельных фрагментов, пока не принесли ожидаемых результатов.
В последнее время набирает силу третье направление по этому же принципу (1.3) - по разработке целенаправленного “запуска” выработки собственных эндогенных средств, способных блокировать патологические изменения. Так в изобретении (RU, №2120303, C1, 6 A 61 K 39/00, 20.10.98г.) предлагается получение специфических сывороток крови, способных повышать устойчивость организма к эндогенным иил экзогенным факторам, на основании того, что доноры имеют в крови запрограммированные “молекулы памяти” - нейропептиды.
Однако способы и примеры излечения патологических состояний с использованием этих сывороток не указываются, не исследуются и участие мозга и ЦНС в этих процессах.
Как сообщают сотрудники украинского Центра эмбриональных тканей “EmCell”, лечить заболевания можно путем замены иммунной системы при введении эмбриональных клеток с заданными параметрами извне.
Однако пока не известны практические результаты этих работ, в которых также не учитывается роль мозга и ЦНС в формировании эндогенных средств.
Задачей изобретения является создание эффективной композиции для купирования патологических состояний с нарушением синтеза нейромедиаторов, лишенной вышеуказанных недостатков существующих средств.
Задача была решена новой эндогенной композицией на основе комплекса нейромедиаторов из коры головного мозга экспериментальных животных. Композиция согласно изобретению представляет собой субклеточную фракцию синаптосом: синоптические мембраны (СМ), “легкие” синаптосомы (ЛС) и “тяжелые” синаптосомы (ТС), полученную из серого вещества больших полушарий головного мозга экспериментальных животных на основе целенаправленной модификации гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, при развитии и регрессии патологического процесса.
Указанная фракция предпочтительно включает синаптосомы при следующем содержании белка в мг/г ткани:
СМ - 1,4-2,4;
ЛС - 1,81-2,41;
ТС - 1,61-1,83.
Предполагается, что использование нового подхода способно изменить само понимание лекарств в существующей интерпретации. Он осуществляется путем целенаправленной модификации гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы в коре головного мозга экспериментальных животных.
Эффективная фармацевтическая композиция, отвечающая необходимым требованиям для купирования патологических процессов, например, таких как возникновение и развитие опухоли, и целенаправленная модификация гуморальных медиаторов нервных окончаний могла быть получена при условии наличия основополагающей (в данном случае для развития патологического процесса) какой-либо теории по обоснованию причины возникновения этих процессов и на ее основе возможности использования средств, вызывающих замедление или остановку процесса (например, регрессию опухоли).
Известно что, периодически поступают сенсационные сообщения о новых эффективных средствах для борьбы со злокачественными новообразованиями.
Любой "бум" мог бы окончиться победой человечества над раком, если бы в его основе лежала первопричина, как при чуме, например.
Принять в качестве первопричины "микроорганизмы" или "паразиты" и возможный путь перехода от инфекции к раку не позволяет существующая практика. Так, например, установлено, что Helicobacter pylory, поражая слизистую желудка, способствует развитию опухолей или папилломавирус человека (HPV) может вызвать рак шейки матки. Но... Н.pylory и HPV инфицируют миллионы людей, но лишь у некоторых из них развивается рак.
Так обстоят дела со всеми гипотезами рака. Истинная причина должна объяснять всю накопленную массу информации, практику людей. Объяснять, а не отвергать очевидное.
Однако интегративный процесс осмысления и обобщения огромной массы полученных данных для этой патологии начинается только по отдельным звеньям и, в частности, для работы центральной нервной системы и мозга. Это особенно относится к пониманию материальных причин функционирования их психосоматической сферы.
Исключительно показательным сообщением в этом плане можно считать сообщение о причине развития рака. Сообщается, что причиной неконтролируемого роста клеток может быть всего один белок, известный как с-Мус. Как полагают исследователи, именно стимуляция этого белка в условиях нарушения его влияния на апоптоз приводит к развитию опухолей. Делается заявление, “что рак не так сложен, как думали люди” (News. Battery.ru - Аккумулятор новостей, 06.05.2002 г.). Однако вопрос обратной связи даже не обсуждается. А именно почему возник этот и множество других известных процессов сопутствующих развитию опухолей?
В процессе работы нами была сформирована “рабочая гипотеза” развития опухолевых процессов, а именно эти процессы являются следствием нарушения функционирования психосоматической сферы центральной нервной системы живых организмов и мозга в частности.
Целью настоящего изобретения не являлось доказательство этого постулата. Он был взят за основу исследований как факт, не требующий теоретических или практических изысканий.
Эта “рабочая гипотеза” позволяла сделать заключение о том, что если патологический процесс купирован, то существует временной диапазон наличия всего пула регуляторных веществ в центральной нервной системе и в мозге в частности.
Целью настоящего изобретения явилось экспериментальное обоснование постулата о том, что в мозге животных (или человека) с различными патологическими процессами в период излечения осуществляется синтез эндогенной фармацевтической композиции, представляющей собой комплекс гуморальных медиаторов нервных окончаний, способных купировать различные отклонения от нормального течения физиологических процессов.
Для достижения цели настоящего изобретения осуществлялось создание условий, способствующих формированию определенного набора регуляторных веществ в мозге экспериментальных животных опухоленосителей (в приведенных примерах) или иной патологии путем целенаправленной модификации гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, их получение и использование в качестве фармацевтической композиции.
Предполагалось, что эффективная противоопухолевая композиция или система препаратов, использующихся комплексно, должна одновременно с подавлением роста опухолевых клеток в месте их локализации менять характер нейроэндокринной регуляции. Не исключалось, что медиаторы, вырабатывающиеся в синаптосомах в период элиминации опухолей, могут явиться именно такими наборами регуляторных веществ, которые будут являться фармацевтическими композициями второго порядка, которые в дальнейшем могут использоваться как самостоятельные лекарственные средства.
На первой стадии исследований необходимо было выбрать противоопухолевый препарат или систему препаратов, которые могли бы осуществлять хотя бы у части животных с перевитыми опухолями элиминацию экспериментальных опухолевых процессов. Причем эти соединения должны были хотя бы в ряде случаев не просто тормозить рост опухолей или увеличивать продолжительность жизни животных, но и вызывать ремиссию.
Из невероятно большого количества требований к этому первичному противоопухолевому препарату вытекало, что он должен быть полиактивным, так как эндогенная элиминация опухолевого процесса невозможна без корректировки нарушенного противоопухолевого иммунитета, который протекает на фоне измененной стабильности клеточных мембран и всего пула нейроэндокринной регуляции.
Предполагалось, что такой противоопухолевый препарат может быть на первой стадии и растительным, так как именно для растительных композиций свойственна полиактивная природа действия в силу сложенного химического состава и полиактивного биологического действия для самих растений.
Известны противоопухолевые растительные средства, нашедшие применение в клинике - винбластин из барвинка розового (vinca rosea L.) в России и винкристин - также из барвинка розового в Венгрии (М.Д.Машковский, “Лекарственные средства”, М., Медицина, 1988, с.466). Однако их использование малоэффективно и сопровождается рядом нежелательных тяжелых побочных эффектов, т.к. они обладают высокой токсичностью.
Известен водный экстракт из хвои пихты сибирской, получивший название “Абисиб”, обладающий противоопухолевым действием. (RU №2104020, кл.6 А 61 К 35/78, 29.05.95). Но в случае его использования речь может идти о наличии слабой биологической активности, а не о лечебном эффекте, т.к. в процессе его получения инактивируется значительное число активных ингредиентов даже той, единственной летучей фракции, которая экстрагируется.
Наиболее приемлемым известным растительным средством является фармацевтическая композиция из пихты сибирской (Abies sibiricus Led), полученная из нативного капсульного экстракта путем его обогащения фракцией монотерпенов. Это лекарственное средство, получившее название “Абисил” или “Абисил-1”, отвечает необходимым критериям, а именно наличие клинически значимых спектров полиактивности, в том числе противоопухолевых, а также отсутствие токсических или нежелательных сопутствующих эффектов (RU, №2054945, кл. А 61 К 35/78, 27.02.96, RU №2002107924/14, МПК7 А 61 К 9/02, 35/78, 29.03.2002).
Создание условий для формирования специфического набора регуляторных веществ в мозге экспериментальных животных опухоленосителей.
В качестве перевиваемых опухолевых штаммов были использованы асцитная карцинома Эрлиха (пример 1), солидная карцинома молочной железы Са-755 (пример 2), карциносаркома Уокера- 256 (У-256) (пример 3).
Субстанция Абисил была получена известным способом (RU №2054945, кл. А 61 К 35/78, 27.02.96). В качестве растворителя использовалось оливковое масло в соотношении субстанции Абисил и растворителя, а именно 0,1:10 соответственно.
Пример 1.
Формирование эндогенной фармацевтической композиции в мозге экспериментальных животных опухоленосителей с асцитной карциномой Эрлиха осуществлялось с использованием мышей линии BALB/c.
В опыты было взято 4 группы животных по 60 штук в каждой.
Вес мышей (самцы и самки) - не менее 20г. Опухоль, асцитную карциному Эрлиха, прививали внутриплеврально. Лечение начинали через 48 часов после прививки опухоли. В качестве контроля служила группа животных, которой инъецировали растворитель (оливковое масло), но не оказывали лечения.
Мыши контрольной группы погибали на 7-15 сутки на фоне развития опухолевого плеврита.
В группе мышей, получавших лечение инъекцированием в зону роста опухоли прототипа субстанции Абисил в разовой дозе 100 мг/кг веса животных, в течение 9 суток с интервалом в 24 часа, погибло 7 из 60 мышей к 12 суткам. Остальные мыши оставались живы на протяжении 60 дней опыта без признаков опухоли или каких-либо проявлений токсичности.
Эффективность лечения оценивали с помощью общепринятого показателя противоопухолевой активности - УПЖ (увеличение продолжительности жизни) при наличии в качестве контроля мышей, не получавших противоопухолевой терапии.
Расчет увеличения продолжительности жизни проводили по формуле
где М - продолжительность жизни в днях.
Как следует из полученных данных, использование субстанции Абисил в дозе 100 мг/кг веса животных - при введении в зону роста опухоли по описанной схеме вызывает значительную регрессию опухолевого процесса (см. Табл.1).
Предполагалось, что в мозге экспериментальных животных - в процессе регрессии опухолей, к моменту завершения этого процесса, должен быть сформирован определенный пул нервных окончаний, имеющий комплекс нейромедиаторов с заданной локализацией и определенным биохимическим составом, который способен обеспечить такое протекание биосинтетических, ферментативных и физических процессов, которые ведут к регрессии опухолей и выживанию животных опухоленосителей.
Существующие методы препаративного фракционирования нервной ткани позволяли проверить эту гипотезу.
Специфический набор регуляторных веществ из мозга экспериментальных животных с инокулированным опухолевым штаммом - асцитной карциномой Эрлиха, был получен с использованием метода выделения нервных окончаний, а именно субклеточноых фракций синаптосом в редакции Прохоровой М.И. (“Методы биохимических исследований", под ред. М.И.Прохоровой, Ленинград, 1982 г. “Ускоренная методика получения синаптосом из коры гловного мозга крыс”, Шевцов В. В. Бюллетень эксперименатальной биологии и медицины №1, 1972).
Способ выделения фракции синаптосом.
Для получения 3 г серого вещества больших полушарий животных декапетировали, извлекли головной мозг и на холодной подложке отделили кору больших полушарий. Выделенная кора измельчалась ножницами и отмывалась от крови физиологическим раствором (0,85% NaCl) при помощи декапитирования и затем средой выделения (0,32 М сахароза, 20 Ммоль - НСl, 1 ммоль ЭДТА, рН 7,4 - при 20°С).
Затем ткань гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в среде выделения из расчета: на 1г ткани 9 мл среды, 2 г - 18 мл среды выделения (8-10 фракций зазор 0,2 мл).
Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 1500g (K-24, ГДР:4000 об/мин).
Осадок представлял собой фракцию неочищенных ядер (ядра, неразрушенные клетки, кров. сосуды). Надосадочную жидкость осторожно декантируют и оставляют.
Осадок повторно ресуспендируют в исходной (18 мл) среде выделения и вторично центрифугируют 10 мин при 1500g. После этого осадок отбрасывают, а надосадочные жидкости I и II центрифугирования объединяют.
Объединенные надосадочные жидкости центрифугируют на рефрижераторной ультрацентрифуге (VAC-60 с угловым ротором 8×50) при 10000 g в течение 20 мин для выделения “неочищенной митохондриальной фракции”.
Осадок “неочищенной митохондриальной фракции” суспендируют в 6 мл холодной 0,32 М сахарозы и наслаивают на предварительно охлажденный в течение 30-40 мин градиент, состоящий из равных объемов (по 6 мл) 0,8; 1,0; 1,1; 1,2; М сахарозы. Разделение проводят при 130000g в течение 30 мин на ультрацентрифуге, используя ротор Swout 3×50 (VAC-60).
В результате ультрацентрифугирования получают 4 слоя и осадок. Верхний слой на 0,8 М сахарозе - миелин, между 0,8 М и 1,0 М сахарозой - “легкие”, или холинергические синаптосомы (ЛС), между 1,1 и 1,2 М сахарозой - “тяжелые”, или аминергические, синаптосомы (ТС), осадок - митохондрии (MX). Полученные фракции отбирают с помощью пастеровской пипетки, разбавляют 0,15 сахарозой и осаждают при 20000g в течение 40 мин (ультрацентрифуга VAC-60, угловой ротор 8×50).
Специфический набор регуляторных веществ у животных опухоленосителей, заключенный в мозговых субклеточных фракциях синаптосом, сформировавшийся в ответ на инокуляцию (контрольная группа), и последующую регрессию (группа с прототипом) опухолевого штамма - асцитная карцинома Эрлиха, был использован для лечения мышей в качестве эндогенной фармацевтической композиции (ЭФК).
Для этого следующей группе мышей в качестве лечебного средства вводили ЭФК, полученную от контрольной (нелеченной) группы мышей с хорошо развившимся асцитом. При этом отмечалось незначительное увеличение продолжительности жизни животных, но не выявился процесс регрессии (см. табл. 1.)
В группе мышей, получавших в качестве лечения ЭФК, выделенную из мозга животных с полной регрессией перевитого опухолевого штамма - асцитная карцинома Эрлиха, выявлена высокая противоопухолевая активность. (см.табл.1). К концу опыта погибло 2 мыши из 60 использованных в опыте. Причем не отмечалось каких-либо токсических проявлений.
Пример 2.
Аденокарциному молочной железы Са-755 прививали подкожно в количестве 50 мг опухолевой ткани на мышь. В опыты были взяты мыши линии C57BL×CBA, самцы весом не менее 20г. Лечение в опытных и контрольных группах начинали через 48 часов. В контроле мышам подкожно инъецировали растворитель (оливковое масло). Лечение осуществляли подкожными инъекциями субстанции Абисил в зону роста опухоли в одноразовой дозе 100 мг/кг веса животных. Интервал между инъекциями составлял 24 часа. Введение Абисила осуществляли на протяжении 9 дней. Специфический набор регуляторных веществ получали также аналогично примеру 1. Оценочным критерием служил процент торможения роста опухоли, рассчитанный по формуле:
где Vcp - средний объем опухоли, который является произведением 3 измерений, выраженных в см3.
Процент регрессии развившейся солидной аденокарциномы Са-755 рассчитывали по формуле:
где
R - процент регрессии;
Vисх - начальный средний объем опухоли;
Vлеч - средний объем опухоли после лечения;
Полученные результаты отражены в Таблице 2.
У мышей, леченных с использованием прототипа (табл.2), отмечалось значительное торможение роста опухоли, но невысокий процент регрессии.
Результаты опыта с использованием ЭФК из группы с прототипом свидетельствуют о высоком терапевтическом эффекте специфического набора регуляторных веществ, сформировавшегося в мозге экспериментальных животных (мышей линии C57BL×CBA) с аденокарциномой молочной железы Са-755, в процессе регрессии опухоли под воздействием прототипа, что позволило использовать его в качестве лекарственного средства - эндогенной фармацевтической композиции.
Пример 3.
Осуществляли формирование специфического набора регуляторных веществ в мозге экспериментальных животных опухоленосителей с перевитой карциномой Уокера-256 (У-256).
Опухоль У-256 перевивали подкожно крысам линии Вистар весом 200 -250г самцам и самкам в паховую область.
В контроле была использована группа животных с введением растворителя в объеме 0,2 мл п/к в паховую область
Лечение осуществляли с использованием субстанции Абисил в дозе 100 мг/кг веса животных через 48 часов после инокуляции опухоли. Абисил вводили п/к в зону роста опухоли с интервалом 24 часа на протяжении 9 дней.
В контрольных группах гибель крыс отмечалась на протяжении 9-18 дней. Часть крыс опытной группы (40 штук из 60), получившие лечение Абисилом, оставались живы на протяжении 90 дней опыта. Отмечалось постепенное рассасывание опухолевого инокулята и отсутствие токсических эффектов.
В группе животных, получавших в качестве лечения ЭФК, полученную от крыс контрольной группы, отмечено незначительное увеличение продолжительности жизни животных и полное отсутствие признаков регрессии опухоли.
Животные, получившие в качестве лекарственного средства ЭФК, выделенную из мозга животных с полной регрессией опухоли У-256, оставались все живы на протяжении 60 дней опыта без признаков опухоли и каких-либо проявлений токсичности.
Таким образом, использованный нами (примеры 1, 2, 3) способ целенаправленной активации синтеза гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, явился условием для формирования определенного набора регуляторных веществ в мозге экспериментальных животных опухоленосителей и позволил осуществить их получение и использование в качестве эндогенной фармацевтической композиции.
Благодаря этому достигалась цель настоящего изобретения.
Следовательно, теоретическое обоснование постулата о том, что в мозге животных (или человека) с различными патологическими процессами в период излечения осуществляется синтез эндогенной фармацевтической композиции, представляющей собой комплекс гуморальных медиаторов нервных окончаний, способных купировать различные отклонения от нормального течения физиологических процессов подтверждается экспериментальными данными.
Как показано (примеры 1, 2, 3), различные патологические процессы (развитие асцитного рака, солидных опухолей) хорошо купируются специфической эндогенной фармацевтической композицией, полученной от животных с аналогичными патологическими состояниями в период их ремиссии.
Таким образом, используя указанный способ целенаправленной активации гуморальных медиаторов нервных окончаний коры головного мозга при развитии и купировании различных патологических процессов, можно получать эндогенные фармацевтические композиции от различных отклонений нормального течения физиологических процессов (асцитный рак, солидные опухоли, воспалительные процессы, дерматологические и др. заболевания).
В наших примерах (1, 2, 3) получение противоопухолевой эндогенной фармацевтической композиции связано с использованием прототипа - субстанции Абисил. В случае любых других патологических процессов существует необходимость использования соответствующих лекарственных средств, способных оказывать терапевтический эффект.
Такая необходимость отсутствует при получении эндогенной фармацевтической композиции из мозга животных с различными патологическими состояниями в процессе их самоизлечения, так как их ремиссия невозможна без образования специфического набора регуляторных веществ - гуморальных медиаторов нервных окончаний.
До настоящего изобретения отсутствовала возможность получения эндогенных лекарственных средств такого рода в эксперименте, которые можно использовать в качестве эффективных фармацевтических композиций с необходимым спектром биологической активности.
Получение таких терапевтических средств стало возможным благодаря целенаправленной модификации гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы из коры головного мозга экспериментальных животных.
Полученные экспериментальные данные имеют значение не только для получения принципиально новых эффективных лекарственных средств, но и для понимания существующих подходов к лечению различных заболеваний, а также для успешной оценки перспективных лекарственных средств среди многочисленных появляющихся новых лекарств путем изучения их влияния на мозг и комплексные биологические системы.
Для получения практических результатов, пригодных к использованию в общечеловеческой практике, возможен также путь использования перехода на квантомеханический уровень.
Известно, что механизм выделения медиаторов одинаков для всех структур нервной системы. Они выделяются из синапсов в виде дискретных квантов.
В процессе инокуляции опухолевых штаммов (или при спонтанном развитии опухолевых процессов) изменяется содержание медиаторов в гранулах пресинаптических клеток мозга, изменяется скорость их выделения, взаимодействие с мембраной и т.д. В процессе ремиссии в квантомеханическом поле создаются условия, кодирующие синтез определенных нейромедиатров, которые выделяются в виде порций квантов. Этим процессом кодирования можно научиться управлять, чтобы получать конечный продукт - (ЭФК), который существует при любой патологии.
Проведенные нами эксперименты (примеры 1, 2, 3) показали, что это высокоэффективное эндогенное лекарство. В наших примерах ЭФК выделялась и использовалась извне, но эти соединения не обязательно выделять.
Известно, что структура нейромедиаторов имеет форму квантовых полей. Получить нужные лекарства из синаптосом для человека можно, расшифровав вначале (получив картину формы волнового света) получающуюся форму в момент ремиссии (опухолей, например), а затем искусственно задать синтез такой формы. Этого можно достичь разными способами, но в том числе создав математическую модель набора нейромедиаторов (их синтеза) специфического при разных излеченных модельных состояниях (У-256, Са-755, S-180 и т.д.). Нужно научиться генерировать определенные конструкции из электронных спинов в синаптосомах головного мозга, имея образец расшифрованных, создавшихся в процессе излечения.
В таком случае, формирующиеся эндогенные фармацевтические композиции, как таковые в нашем существующем понимании, можно и не получать, а просто фиксировать разные стадии процесса ремиссии.
Результаты настоящего изобретения определяют правомерность и целесообразность нового подхода к управлению синтезом “собственных лекарственных средств”, а также пути создания высокоэффективных принципиально новых, терапевтически значимых лекарственных средств.
| Таблица 1 Влияние эндогенной фармацевтической композиции на продолжительности жизни мышей с асцитной карциномой Эрлиха в сравнении с контролем и прототипом | ||||
| Штамм | Вещество | Количество животных и вид | УПЖ, % | Излечение, % |
| Асцитная карцинома Эрлиха (АКЭ) | 1. Контроль (АКЭ) | Мыши линии BALB/c 60 | - | 0 |
| 2. Прототип* | Мыши линии BALB/c 60 | 381 | 88 | |
| 3.ЭФК (контроль)** | Мыши линии BALB/c 60 | 16 | 0 | |
| 4. ЭФК (прототип)*** | Мыши линии BALB/c 60 | 427 | 96 | |
| * - прототип - субстанция Абисил в дозе 100мг/кг веса. ** - ЭФК(контроль) - получена от мышей контрольной группы. *** - ЭФК (прототип) - получена от мышей (излеченных) из группы с прототипом ЭФК эндогенная фармацевтическая композиция. | ||||
| Таблица 2 Торможение роста аденокарциномы молочной железы Са-755 мышей эндогенной фармацевтической композицией | ||||
| Штамм опухоли | Вещество | Количество животных и вид | ТРО, % | Излечение, % |
| Аденокарциномы молочной железы Са-755 | 1.Контроль (Са-755) | Мыши линии C57BL×CBA 60 штук | 0 | |
| 2. Прототип* | Мыши линии C57BL×CBA 60 штук | 74 | 35 | |
| 3.ЭФК (контроль)** | Мыши линии C57BL×CBA 60 штук | 18 | 0 | |
| 4. ЭФК (прототип)*** | Мыши линии C57BL×CBA 60 штук | 94 | 61 | |
| * - прототип - субстанция Абисил в дозе 100мг/кг веса. ** - ЭФК(контроль) - получена от мышей линии C57BL×CBA контрольной группы. *** - ЭФК (прототип) - получена от мышей линии C57BL×CBA (излеченных) из группы с прототипом ЭФК эндогенная фармацевтическая композиция. |
| Таблица 3 Влияние эндогенной фармацевтической композиции на продолжительности жизни крыс с карциносаркомой Уокера-256 в сравнении с контролем и прототипом | ||||
| Штамм | Вещество | Количество животных и вид | УПЖ, % | Излечение, % |
| Карциносаркома Уокера-256) | 1. Контроль (У-256) | Крысы линии Вистар 60 штук | - | 0 |
| 2. Прототип* | Крысы линии Вистар 60 штук | 247 | 93 | |
| 3.ЭФК (контроль)** | Крысы линии Вистар 60 штук | 11 | 0 | |
| 4.ЭФК (прототип)*** | Крысы линии Вистар 60 штук | 268 | 100 | |
| * - прототип - субстанция Абисил в дозе 100 мг/кг веса. ** - ЭФК(контроль) - получена от крыс контрольной группы. *** - ЭФК (прототип) - получена от крыс (излеченных) из группы с прототипом ЭФК эндогенная фармацевтическая композиция. |
1. Эндогенная фармацевтическая композиция для лечения патологических состояний с нарушением синтеза нейромедиаторов, характеризующаяся тем, что она представляет собой субклеточную фракцию синаптосом: синаптические мембраны (СМ), "легкие" синаптосомы (ЛС) и "тяжелые" синаптосомы (ТС), полученную из серого вещества больших полушарий головного мозга экспериментальных животных на основе целенаправленной модификации гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, при развитии и регрессии патологического процесса.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанная фракция включает синаптосомы при следующем содержании белка в мг/г ткани:
СМ - 1.4-2,4;
ЛС - 1,81-2,41;
ТС- 1,61-1,83
3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что целенаправленная модификация гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, осуществляется с использованием субстанции Абисил (в оливковом масле) в дозе 100 мг/кг веса животных.
4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что целенаправленная модификация гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, осуществляется у экспериментальных животных с перевитыми опухолевыми штаммами: асцитной карциномой Эрлиха; аденокарциномой молочной железы Са-755; карциносаркомой Уокера-256.
5. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что целенаправленная модификация гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, осуществляется у экспериментальных животных с перевитыми опухолевыми штаммами: асцитной карциномой Эрлиха; аденокарциномой молочной железы Са-755; карциносаркомой Уокера-256.
6. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что целенаправленная модификация гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, осуществляется у экспериментальных животных с перевитыми опухолевыми штаммами: асцитной карциномой Эрлиха; аденокарциномой молочной железы Са-755; карциносаркомой Уокера-256.
7. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она может быть заключена в фармацевтически приемлемый носитель в зависимости от необходимого пути введения.
8. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что она может быть заключена в фармацевтически приемлемый носитель в зависимости от необходимого пути введения.
9. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что она может быть заключена в фармацевтически приемлемый носитель в зависимости от необходимого пути введения.
10. Способ получения эндогенной фармацевтической композиции для лечения патологических состояний с нарушением синтеза нейромедиаторов, характеризующийся тем, что осуществляют целенаправленную модификацию гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, путем введения соответствующего лекарственного средства, способного оказывать терапевтический эффект при данной патологии, при регрессии процесса из серого вещества больших полушарий головного мозга экспериментальных животных выделяют путем препаративного фракционирования нервной ткани субклеточную фракцию синаптосом, включающую синоптические мембраны (СМ), "легкие" синаптосомы (ЛС) и "тяжелые" синаптосомы (ТС).
11. Способ по п.10, в котором целенаправленная модификация гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, осуществляется с использованием субстанции Абисил (в оливковом масле) в дозе 100 мг/кг веса животных.
12. Способ по п.10 или п.11, в котором целенаправленная модификация гуморальных медиаторов нервных окончаний, преобразованных в синаптосомы, осуществляется у экспериментальных животных с перевитыми опухолевыми штаммами: асцитной карциномой Эрлиха; аденокарциномой молочной железы Са-755; карциносаркомой Уокера-256.
