Способ получения фитопрепарата хрена, обладающего иммунокорригирующей и противовоспалительной активностью
Владельцы патента RU 2247573:
Пермская государственная фармацевтическая академия (RU)
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и относится к способу получения средства, обладающего иммунокорригирующей и противовоспалительной активностью. Способ получения фитопрепарата, обладающего иммунокорригирующей и противовоспалительной активностью, включает измельчение свежих корней хрена обыкновенного, экстракцию сырья методом мацерации при определенном соотношении сырье: экстрагент в течение определенного времени при комнатной температуре и при периодическом перемешивании, отстаивание экстракта при определенных условиях и фильтрование. Способ позволяет получать фитопрепарат из корней хрена обыкновенного для фармакотерапии иммунодефицитных состояний и заболеваний воспалительного характера. 4 табл.
Изобретение относится к медицине и фармации, а именно к способу получения средства, обладающего иммунокорригирующим и противовоспалительным действием.
Ближайшим аналогом предлагаемому по достигаемому эффекту является официнальный экстракт родиолы розовой жидкий (per. номер 75/933/14), получаемый методом этанольной экстракции и применяемый в медицинской практике в качестве адаптогенного, тонизирующего и иммуностимулирующего средства (Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2000. - T.1. - С.134-135).
Исходным сырьем для получения экстракта родиолы розовой жидкого служат корневища и корни родиолы розовой.
Ареал распространения родиолы розовой относительно невелик, основные запасы в РФ сконцентрированы в горах Южной Сибири, где произрастают преимущественно на субальпийских лугах (Борисова А.Г. Новости систематики высших растений, Наука, Л., 1970. -Т.6. - С.112-121), что может существенно затруднять заготовку сырья и являться одним из дестабилизирующих факторов фитопроизводства, связанным с неритмичностью обеспечения сырьем (Быков В.А., Запесочная Г.Г., Куркин В.А. - Хим.-фарм.журн., 1999. - №1. - С.28-39).
Заросли родиолы розовой восстанавливаются очень медленно - через 10-15 лет при условии рациональной эксплуатации (Балабас Г.М., Сацыперова И.О., Синицкий В.Г. - Растительные ресурсы, 1981. - т.17. - вып.3. - С. 325-337). В настоящее время в результате нерегулируемых заготовок природные запасы данного растения сильно истощены. Родиола розовая занесена в Красную книгу и промысловые заготовки сырья возможны лишь в очень маленьких объемах. По этой причине выпуск экстракта родиолы розовой жидкого осуществляется в небольших количествах, недостаточных для удовлетворения потребностей здравоохранения (Быков В.А., Запесочная Г.Г., Куркин В.А. - Хим.-фарм.журн., 1999. - №1. - С.28-39). Плантационное выращивание родиолы розовой трудоемко и нерентабельно (Крендаль Ф.П., Левина Л.В., Аркавый И.В., Ванюшкин А.Н. Актуальные проблемы современной фармации, М., 1986. - С.131-134).
При выраженных терапевтических свойствах получаемые из родиолы препараты не лишены ряда недостатков. Исследования в этой области позволяют однозначно говорить о гормоноподобном действии препаратов родиолы розовой (Куркин В.А., Запесочная Г.Г. - Хим.-фарм.журн., 1986, - т.20. - №10. - С. 1231-1244). У настоя родиолы розовой в опытах на рыбках гуппи выявлены андрогенные свойства (Комар В.В., Грицюк Я.Г., Кит С.Л. и др. - Фармацевтический журнал 1980. - т.53. - №5. - С.49-52), что может существенно ограничивать применение препарата.
Установлено, что препараты родиолы розовой могут повышать артериальное давление (Сорокина А.А. Здоровье, 1999. - №10. - С.66), что также является одним из основных аспектов, ограничивающих их применение.
В ходе клинических испытаний было установлено, что встречаются случаи индивидуальной чувствительности к препарату, раздражительность, бессонница, головная боль. У больных гипертонией, вызванной вегетососудистой дистонией, диэнцефалитом, климактерическим состоянием, препарат может вызвать извращенную реакцию: снижение артериального давления или же резкое его повышение, что сопровождается ухудшением состояния больных (Саратиков А.С. Золотой корень. Томск, 1973. - с.110).
В свете вышеизложенных фактов представляется целесообразным поиск новых эффективных иммунокорригирующих и противовоспалительных препаратов растительного происхождения.
Целью изобретения является получение фитопрепарата из корней хрена обыкновенного, обладающего иммуномодулирующим и противовоспалительным действием.
Для достижения вышеозначенной цели свежие корни хрена обыкновенного после измельчения экстрагировали этанолом методом мацерации в соответствии с требованиями ГФ XI, вып.2, с.148.
Пример 1 (вариант 1). 20 г свежих корней хрена обыкновенного измельчали до размеров от >5 мм до ≤10 мм. Измельченный корень подвергали экстрагированию 40% этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент (1:5) течение 7 суток при комнатной температуре (+20±2°C) методом мацерации при периодическом (1 раз в сутки) перемешивании сырья и экстрагента.
Настойку отстаивали в течение 2 суток при температуре не выше +10°С и фильтровали.
Таким образом, из одной весовой части растительного сырья получали пять объемных частей готового продукта (табл.1).
Полученная настойка представляет собой жидкость светло-желтого цвета со специфическим запахом хрена, и жгучим вкусом.
Полученный фитопрепарат хрена имеет оптическую плотность при длине волны λ 220 нм, равную 2,53, при длине волны λ 380 нм - 0,095 и содержит группы биологически активных веществ, указанных в табл.1.
Данный фитопрепарат хрена (в дозе 0,1 мл на 100 г массы тела лабораторного животного) обладает иммунокорригирующим и противовоспалительным действием (табл.1).
Пример 2 (вариант 2). 20 г свежих корней хрена обыкновенного измельчали до размеров от >5 мм до <10 мм. Измельченный корень подвергали экстрагированию 70% этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент (1:5) течение 7 суток при комнатной температуре (+20±2°С) методом мацерации при периодическом (1 раз в сутки) перемешивании сырья и экстрагента.
| Таблица 1. Технологическая, химическая и биологическая характеристика фитопрепаратов, полученных из корней хрена обыкновенного разными способами | |||
| Показатели | Вариант 1 | Вариант 2 | Вариант 3 |
| Сырье | Свежие корни хрена | Свежие корни хрена | Свежие корни хрена |
| Степень измельчения сырья | от >5 мм до ≤10 мм; | от>5 мм до ≤10 мм | >10 мм до ≤30 мм |
| Масса сырья, г | 20 | 20 | 20 |
| Экстрагент | 40% этиловый спирт | 70% этиловый спирт | 70% этиловый спирт |
| Соотношение сырья и экстрагента | 1:5 | 1:5 | 1:5 |
| Объем готового извлечения, мл | 100 | 100 | 100 |
| Биологически активные вещества: | |||
| Гликозиды | + | + | + |
| Восстанавливающие сахара | + | + | + |
| Белковые соединения | + | + | + |
| Стерины | + | + | + |
| Фитонциды | + | + | + |
| Фенольные соединения: | |||
| Дубильные вещества | + | + | + |
| Флаваноиды | + | + | + |
| Алкалоиды | +/- | +/- | +/- |
| Сапонины | - | - | - |
| Синигрин | + | + | + |
| Оптическая плотность: | |||
| λ 220 нм | 2,53 | 1,6 | 2,56 |
| λ 380 нм | 0,095 | 0,052 | 0,092 |
| Биологическая активность: | |||
| Противовоспалительная, % торможения отека | 37,0±2,9*** | 0,0±0,0 | 30,9±1,6*** |
| Иммуномодулирующая, % увеличения числа АОК | 104*** | 0 | 56*** |
| Примечание: ***=р<0,001 |
Настойку отстаивали в течение 2 суток при температуре не выше +10°С и фильтровали.
Таким образом, из одной весовой части растительного сырья получали пять объемных частей готового продукта (табл.1).
Полученная настойка представляет собой жидкость светло-желтого цвета со специфическим запахом хрена и жгучим вкусом.
Полученный фитопрепарат хрена имеет оптическую плотность при длине волны λ 220 нм, равную 1,6, при длине волны λ 380 нм - 0,052 и содержит группы биологически активных веществ, указанных в табл.1.
Данный фитопрепарат (в дозе 0,1 мл на 100 г массы тела лабораторного животного) не оказал противовоспалительного и иммунокорригирующего действия (табл.1).
Пример 3 (варианат 3.) 20 г свежих корней хрена обыкновенного измельчали до размеров от >10 мм до ≤30 мм. Измельченный корень подвергали экстрагированию 70% этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент (1:5) течение 7 суток при комнатной температуре (+20±2°C) методом мацерации при периодическом (1 раз в сутки) перемешивании сырья и экстрагента.
Настойку отстаивали в течение 2 суток при температуре не выше +10°С и фильтровали.
Таким образом, из одной весовой части растительного сырья получали пять объемных частей готового продукта (табл.1).
Полученная настойка представляет собой жидкость светло-желтого цвета со специфическим запахом хрена и жгучим вкусом.
Полученный фитопрепарат хрена имеет оптическую плотность при длине волны λ 220 нм, равную 2,56, при длине волны λ 380 нм - 0,092 и содержит группы биологически активных веществ, указанных в табл.1.
Данный фитопрепарат хрена (в дозе 0,1 мл на 100 г массы тела лабораторного животного) обладает иммунокорригирующим и противовоспалительным действием (табл.1). Следует отметить, что при использованном в этом случае способа получения фитопрепарата хрена иммунокорригирующая активность была в 2 раза ниже, чем при способе варианта 1.
Дальнейшее изучение и сравнение биологической активности с препаратами эталонами осуществлено с использование фитопрепарата хрена, полученного по варианту 1.
Острая токсичность настойки хрена изучена на белых беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г с определением DL50 (Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств /Ведомости Фармакологического Комитета, 1998. - №1. - С. 29-30). В каждой серии использовалось пять лабораторных животных. Наблюдение вели ежечасно в течение суток после введения препарата.
В качестве препарата сравнения был использован экстракт родиолы розовой жидкий. Все исследуемые препараты вводили внутрибрюшинно в диапазоне доз 10-25 мл/кг. В качестве контроля использовалось эквиобъемное количество 40% экстрагента. Статистическую обработку результатов проводили по методу Прозоровского.
| Таблица 2. Острая токсичность фитопрепарата из корней хрена обыкновенного | |
| Серии опыта | DL50, мл/кг |
| 40% этанол | 16,8 |
| Настойка хрена | 23,9*** |
| Экстракт родиолы розовой | 20,5*** |
| Примечание: ***=р<0,001 |
При изучении острой токсичности выявлено, что фитопрепарат хрена относится к малотоксичным препаратам. В порядке возрастания токсичности обследованные препараты располагаются следующим образом: настойка хрена<экстракт родиолы розовой <40% этанол. Как следует из табл.2, фитопрепарат хрена имеет преимущество по сравнению с использованными препаратами в плане безопасности.
Данные по DL50 40% этанола и экстракта родиолы розовой жидкого при внутрибрюшинном введении соответствовали результатам Бухановой Н.В. (Возрастные особенности чувствительности организма к некоторым препаратам растительного происхождения/ Автореф.дис.канд. мед. наук. - Челябинск, 2001).
Иммунокорригирующая активность изучена в опытах на белых беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г (Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов/Ведомости Фармакологического комитета, 1999. - №1. -С. 32-33). Об иммунотропной активности судили по изменению фагоцитоза, числа антителообразующих клеток.
Кровь для исследования фагоцитоза брали из хвостовой вены через 24 часа после перорального однократного введения фитопрепарата. В качестве объекта фагоцитоза использовали опсонизированные эритроциты барана в виде 1% взвеси. Для оценки влияния на фагоцитоз использовали следующие показатели: процент фагоцитирующих нейтрофилов (ФАН), фагоцитарный индекс (ФИ), фагоцитарное число (ФЧ).
Фитопрепарат хрена и препарат сравнения (экстракт родиолы розовой жидкий) вводили в дозе, равной 1/50 DL50, a 40% этанол в эквиобъемном количестве.
Иммунокорригирующий эффект изучен на модели первичного иммунного ответа. Оценку проводили путем определения числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке на пятые сутки после иммунизации эритроцитами барана в минимальной дозе (5×106) антигена с помощью метода локального гемолиза по Ерне и Нордину.
Фитопрепарат хрена и препарат сравнения (экстракт родиолы розовой жидкий) вводили в течение трех дней до инъекции антигена в дозе, равной 1/50 DL50, a 40% этанол в эквиобъемном количестве.
Полученные результаты статистически обработаны с помощью программы Excel.
В результате проведенных исследований установлено, что 40% этанол угнетает фагоцитоз и уменьшает количество антителообразующих клеток (табл.3).
Фитопрепарат хрена не только устранял иммунодепрессивное действие 40% этанола, но и активировал фагоцитоз, стимулировал образование антителообразующих клеток. Это свидетельствует о наличии у обследованного препарата иммуностимулирующего эффекта. Препарат сравнения - экстракт родиолы розовой жидкий также проявлял иммуностимулирующий эффект, однако по выраженности эффекта уступал фитопрепарату хрена.
Противовоспалительная активность фитопрепарата хрена оценена на модели каррагенинового воспаления (Методические рекомендации по изучению новых нестероидных препаратов /Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - ЗАО “ИИА “Ремедиум”, 2000. - С. 236). Асептическое воспаление вызывали субплантарным введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина. О выраженности противовоспалительного эффекта фитопрепарата хрена судили по изменению объема воспаленной стопы через 3 и 5 часов после моделирования воспалительной реакции.
В качестве препаратов сравнения использовали экстракт родиолы розовой и бруфен.
Фитопрепарат и препараты эталоны вводили перорально за 1 час до субплантарной инъекции флогогена. Результаты обрабатывали статистически с помощью программы Excel.
Проведенные исследования показали, что фитопрепарат хрена в дозе 0,1 DL50 обладает самостоятельным противовоспалительным действием. Об этом свидетельствует достоверное торможение каррагенинового отека во все сроки наблюдения (табл.4).
Этанол (экстрагент) в эквиобъемном количестве не изменил динамики развития экспериментального воспаления. Фитопрепарат родиолы розовой в дозе 0,1 DL50 не проявил противовоспалительной активности.
Сравнение выраженности противовоспалительного эффекта фитопрепарат хрена не уступает бруфену (нестероидное противовоспалительное средство).
Предлагаемый способ позволяет получить новый фитопрепарат из растительного сырья - корней хрена обыкновенного, обладающего противовоспалительной и иммунокорригирующей активностью. Это расширяет арсенал лекарственных средств природного происхождения для фармакотерапии иммунодефицитных состояний и заболеваний воспалительного характера.
Способ получения фитопрепарата, обладающего иммунокорригирующей и противовоспалительной активностью, включающий измельчение свежих корней хрена обыкновенного до размеров от >5 мм до <10 мм, далее сырье экстрагируют методом мацерации 40% этиловым спиртом при соотношении сырье: экстрагент 1:5 в течение 7 суток при комнатной температуре (+20+2°С) и при периодическом перемешивании 1 раз в сутки, затем отстаивают в течение 2 суток при температуре не выше +10°С и далее фильтруют.
