Гены десатураз и их применение

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и медицине. Трансформация растения нуклеиновой кислотой, кодирующей Δ⁶ десатуразу С.elegans, приводит к получению растения с повышенным содержанием гамма-линоленовой кислоты и устойчивостью к холоду. Извлекаемая из растения десатураза может также быть использована для приготовления лекарства для лечения расстройства организма, связанного с дефицитом в нем гамма-линоленовой кислоты. 10 н. и 26 з.п. ф-лы, 9 ил.

 

Настоящее изобретение относится, среди прочего, к новым десатуразам и к их применению.

За последние несколько лет из высших растений, наиболее значительно из Arabidopsis thaliana, был выделен ряд микросомальных и растворимых десатураз жирных кислот. Это явилось результатом комбинированного генетического и биохимического подхода к получению и комплементации мутантных линий Arabidopsis, дефектных по десатурации или элонгации жирных кислот (Somerville С., Browse J. (1996) Trends Cell. Biol., 6, 148-1153). Важность этого подхода подтверждена выделением и характеристикой генов, кодирующих микросомальные десатуразы, такие как десатуразы Δ¹² (Okuley J., et al., (1994), Plant Cell 6, 147-158) и Δ¹⁵ (Arondel V., et al., (1992), Sciеnсе 258, 1353-1355) (кодируемые генами FAD2 и FAD3, соответственно), ферменты, которые прежде оказывались труднообрабатываемыми с помощью классических методик очистки вследствие их гидрофобности. Выделение этих и родственных ферментов, таких как Δ¹² гидроксилаза из Ricinus communis (van de Loo F N et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6743-6747), дало возможность идентификации ряда консервативных мотивов в растительных микросомальных десатуразах, наиболее значительно так называемых “гистидиновых боксов” (Shanklin, J et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6743-6747). Белки, содержащие эти мотивы, можно классифицировать как ферменты, содержащие ди-железо центр (Shanklin, J. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2981-2986).

В WO 93/11245 (Du Pont) описываются различные фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие десатуразы, в частности Δ¹² и Δ¹⁵ десатуразы, которые были выделены из различных растений. Недавно из растения бурачника (Borago officinalis), которое аккумулирует γ-линоленавую кислоту (ГЛК), выделили кДНК клон, используя высоковырожденную ПЦР против этих гистидиновых мотивов. В US 5614393 (Rhone-Poulenc Agrochimie) описывается и заявляется нуклеотидная последовательность Δ⁶ десатуразы бурачника. Хотя в описании изобретения предполагается, что нуклеиновые кислоты, кодирующие Δ⁶ десатуразу, могут быть выделены специалистом из животных клеток без труда, подходящих животных клеток не предлагается (в противоположность грибным и бактериальным клеткам), а также отсутствует описание выделения таких нуклеиновых кислот из животных клеток. С помощью гетерологичной экспрессии в трансгенном табаке было показано, что выделенный кДНК клон кодирует микросомальную Δ⁶ десатуразу (Sayanova О. et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4211-4216). Десатурация в Δ⁶ положении представляет собой необычную модификацию у высших растений, встречающуюся только у небольшого числа видов, таких как бурачник, энотера (Oenothera spp.) и красная смородина (Ribes spp.), которые аккумулируют Δ⁶-ненасыщенные жирные кислоты ГЛК и октадекатетраеноевую кислоту (OTK:18:^4Δ6,9,12,15, также известную как стеаридоновая кислота) в семенах и/или листьях.

ГЛК является растительной жирной кислотой большой значимости и широко применяется при лечении ряда медицинских состояний, включая экзему и масталгию. Утверждают, что применение ГЛК восстанавливает потерю Δ⁶-ненасыщенных жирных кислот или удовлетворяет повышенную потребность в них (Horrobin, D.F. (1990) Rev. Contemp. Pharmakother. 1: 1-45).

В целях ссылки предлагается фиг.5, чтобы показать в упрощенной форме путь метаболизма, который, как считают, встречается у некоторых организмов (включая людей), и в который вовлечены Δ⁶ десатуразы. Можно видеть, что ГЛК может синтезироваться in vivo из линолевой кислоты под действием Δ⁶ десатуразы, и что ГЛК может использоваться для синтеза дигомо-ГЛК, которая может превращаться в арахидоновую кислоту под влиянием Δ⁵ десатуразы. Арахидоновая кислота является предшественником различных важных эйкозаноидов (включая простагландины и лейкотриены). Δ⁶ десатураза также превращает α-линолевую кислоту в ОТК. Таким образом, ясно, что Δ⁶ десатураза является первой обязательной стадией на пути биосинтеза этих биологически активных молекул (см. фиг.5).

Последовательность ранее выделенной микросомальной Δ⁶ десатуразы бурачника отличается от ранее охарактеризованных растительных микросомальных десатураз/гидроксилаз тем, что она содержит N-терминальную протяженность, которая проявляет гомологию с цитохромом b₅, a также тем, что третий (ближайший к С-концу) гистидиновый бокс отличается от консенсуса (Shanklin J et al, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2981-2986) H-X-Х-Н-Н глутамином, заменяющим первый гистидин. Это наблюдалось также в случае Δ⁶ десатуразы цианобактерии Synechocystis (GenBank ID; L11421). В WO 93/06712 (Rhone Poulenc Agrochimie) описывается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая Δ⁶ десатуразу, выделенную из Synechocystis, и заявляются бактериальные Δ⁶ десатуразы и их применение.

Хотя Δ⁶ десатурация жирной кислоты является необычной модификацией у высших растений, считают, что у животных она является обычной. Незаменимая жирная кислота линолевая кислота (18:2Δ^9,12) десатурируется до ГЛК с помощью Δ⁶-десатуразы, что является первой стадией на пути биосинтеза эйкозаноидов (которые включают в себя простагландины и лейкотриены). Это приводит к быстрому метаболизму ГЛК (до ди-гомо-ГЛК и арахидоновой кислоты; то есть 20:3 Δ^8,11,14 и 20:4 Δ^5,8,11,14, соответственно). Следовательно, аккумуляция ГЛК обычно не наблюдается.

Червь нематода Caenorhabitis elegans является крайне полезным в связи с тем, что его генетика хорошо изучена, и он имеет много сходств с высшими животными, как, например, с людьми, и, следовательно, является крайне полезным в разработке десатураз для применения у таких животных.

Согласно настоящему изобретению предлагается полипептид, обладающий десатуразной активностью, который содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг.1.

Аминокислотная последовательность, показанная на фиг.1, представляет собой последовательность Δ⁶ десатуразы, имеющейся у червя нематоды Caenorhabitis elegans. Это является весьма значимым, поскольку до настоящего изобретения не сообщалось об успешном секвенировании или очистке животной Δ⁶ десатуразы. Так как C.elegans не аккумулирует ГЛК, выделение из него Δ⁶ десатуразы было неожиданной целью для выделения гена десатураз.

Десатураза по изобретению значительно отличается от известных десатураз. Гомология между Δ⁶ десатуразой по изобретению и микросомальными Δ¹² и Δ¹⁵ десатуразами из Arabidopsis, описанными в WO 93/11245, составляет 24% и 16%, соответственно, как определили, используя программу BESTFIT. Ген Δ⁶ десатуразы по настоящему изобретению показывает 21%-ную идентичность с десатуразой FAT-1 C.elegans, описанной в статье Spychalla, J.P. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1142-1147. Гомология последовательности между Δ⁶ десатуразой по настоящему изобретению и Δ⁶ Synechochocystis, описанной в WO 93/06712, составляет только 23%.

Согласно другому аспекту изобретения, таким образом, предлагается выделенная животная Δ⁶ десатураза.

Аминокислотная последовательность, показанная на фиг.1, является значимой также в связи с тем, что она имеет очень низкий уровень идентичности последовательности с Δ⁶ десатуразой бурачника (единственной иной эукариотической Δ⁶ десатуразой, секвенированной до настоящего изобретения). Действительно, этот уровень идентичности последовательности ниже 32%. При таком низком уровне идентичности можно ожидать, что эти два полипептида будут иметь полностью различные функции. Неожиданно, что оба они обладают активностью Д⁶ десатуразы.

Настоящее изобретение, однако, не ограничивается Δ⁶ десатуразой, имеющей последовательность, показанную на фиг.1. Оно также включает в себя другие десатуразы, имеющие по меньшей мере 32%-ную идентичность последовательности с этой последовательностью. Предпочтительные полипептиды по настоящему изобретению имеют по меньшей мере 40%-ную или, более предпочтительно, по меньшей мере 50%-ную идентичность аминокислотной последовательности с этой последовательностью. Более предпочтительно степень идентичности последовательности составляет по меньшей мере 75%. Идентичности последовательности по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99% являются наиболее предпочтительными.

Для целей настоящего изобретения идентичность последовательности (либо аминокислотной, либо нуклеотидной) можно определить с помощью использования программы “BESTFIT” Wisconsin Sequence Analysis Package GCG 8.0.

Там, где имеются высокие степени идентичности последовательности, могут быть относительно небольшие различия в аминокислотной последовательности. Так, например, может быть менее чем 20, менее чем 10 или даже менее чем 5 различий.

Фрагменты полипептидов, описанных выше, также находятся в объеме настоящего изобретения при условии, что они обладают десатуразной активностью, то есть они обладают способностью вводить двойную связь в субстрат в конкретном положении, как определено с помощью ГХ-МС (газовой хроматографии - масс-спектрометрии). Что является низшим пределом активности? Эти фрагменты предпочтительно имеют длину по меньшей мере 100 аминокислот. Более предпочтительно эти фрагменты имеют длину по меньшей мере 150 аминокислот.

В кратком изложении, полипептид по настоящему изобретению обладает десатуразной активностью и:

а) содержит аминокислотную последовательность, показанную на фиг.1;

б) имеет одну или более чем одну аминокислотную делецию, инсерцию или замену относительно полипептида как определено в (а) выше, но вместе с этим имеет по меньшей мере 32%-ную идентичность аминокислотной последовательности; или

в) представляет собой фрагмент полипептида как определено в (а) или (б) выше, который имеет длину по меньшей мере 100 аминокислот.

Термин “полипептид” используется здесь в общем смысле, чтобы указать на то, что конкретная молекула содержит множество аминокислот, соединенных вместе пептидными связями. Следовательно, в объем этого термина включены вещества, на которые в литературе иногда ссылаются как на пептиды, полипептиды или белки.

Желательно полипептид по настоящему изобретению должен иметь домен цитохрома. Домен цитохрома можно определить как переносящий электроны домен, который содержит простетическую группу гем. Предпочтительно присутствует домен цитохрома b. Более предпочтительно присутствует домен цитохрома b₅ (желательно он включает в себя мотив Н-Р-G-G-Х₁₅-Р-Х_3-6-Н, где Х представляет собой любую аминокислоту). Домен цитохрома b₅ присутствует в аминокислотной последовательности как Δ⁶ десатуразы бурачника, так и Δ⁶ десатуразы C.elegans, показанных на фиг.2Б. Домен цитохрома b₅ предпочтительно является N-терминальным доменом - то есть он находится ближе к N-терминальной области десатуразы, чем к С-терминальной области. Это составляет противоположность с другими десатуразами. Например, с дрожжевой Δ⁹ десатуразой, имеющей С-терминальный домен цитохрома b₅, и с растительными Δ¹² и Δ¹⁵ десатуразами, которые не имеют никакого домена цитохрома b₅.

Полипептид по настоящему изобретению предпочтительно имеет один или более чем один гистидиновый бокс (наиболее предпочтительно три). Один из них может иметь замену H→Q. (Она дает вариант гистидинового бокса, который считается консервативным у ряда видов животных/растений).

Полипептиды по настоящему изобретению могут иметь любую пространственную специфичность, включая цис/транс активность, хотя предпочтительно, чтобы они представляли собой десатуразы переднего конца, которые вводят двойную связь между С3 и С7 положениями, отмеренными от СООН (Δ конец) этой группы. Специалист способен легко отличать различные десатуразы с помощью определения различных положений двойных связей, вводимых этими десатуразами. Это можно сделать с помощью известных аналитических методик, например с помощью использования газовой хроматографии и масс-спектрометрии.

Особенно предпочтительными десатуразами по изобретению являются Δ⁶ десатуразы.

Желательно, эти десатуразы встречаются в природе у одного или более чем одного организма, который не аккумулирует ГЛК (то есть, где ГЛК может продуцироваться, но обычно не обнаруживается в связи с тем, что она очень быстро претерпевает метаболизм). Такие десатуразы могут встречаться в природе у одного или более чем одного животного. Эти десатуразы встречаются в природе у одной или более чем одной нематоды, например у C.elegans.

Чтобы более полно представить объем настоящего изобретения, теперь более детально будут обсуждаться полипептиды в объеме каждого из вышеуказанных (а), (б) и (в).

Полипептиды в объеме (а)

Полипептид в объеме (а) может состоять из аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1, либо может иметь дополнительную N-терминальную и/или дополнительную С-терминальную аминокислотную последовательность.

Дополнительные N-терминальные или С-терминальные последовательности можно включать по разным причинам, и методики для включения таких дополнительных последовательностей хорошо известны в данной области техники. Такие методики включают в себя использование методик клонирования генов, в соответствии с которыми молекулы нуклеиновых кислот лигируют вместе, а затем используют для экспрессии полипептида в подходящем хозяине.

Дополнительные последовательности можно включать, чтобы изменить характеристики конкретного полипептида. Это может быть полезным для улучшения экспрессии или регуляции экспрессии в отдельных системах экспрессии. Например, дополнительная последовательность может обеспечить некоторую защиту от протеолитического расщепления.

Дополнительные последовательности также могут быть полезными при изменении свойств полипептида, чтобы способствовать его идентификации или очистке. Например, может присутствовать сигнальная последовательность, чтобы направлять транспорт полипептида к конкретному месту внутри клетки или экспортировать полипептид из клетки. Для различных систем экспрессии можно использовать различные сигнальные последовательности.

В другом примере включения дополнительной последовательности полипептид сшивают с группировкой, которую можно выделить с помощью аффинной хроматографии. Эта группировка может представлять собой эпитоп, и аффинная колонка может содержать иммобилизованные антитела или иммобилизованные фрагменты антител, которые связываются с указанным эпитопом (желательно с высокой степенью специфичности). Полученный в результате слитой белок обычно можно элюировать с колонки добавлением подходящего буфера.

Дополнительные N-терминальные или С-терминальные последовательности могут, однако, присутствовать просто как результат конкретной методики, используемой для получения полипептида по настоящему изобретению, и не должны обеспечивать какую-либо конкретную преимущественную характеристику.

Полипептиды в объеме (б)

Теперь, переходя к полипептидам, определенным в (б) выше, следует понимать, что они являются вариантами полипептидов, данных в (а) выше.

В аминокислотной последовательности полипептида, который обладает желаемым свойством, часто можно сделать различные изменения, чтобы получить варианты, которые тем не менее обладают этим свойством. Такие варианты полипептидов, описанных в (а) выше, находятся в объеме настоящего изобретения и более детально обсуждаются в разделах (i)-(iii) ниже. Они включают в себя аллельные и неаллельные варианты.

(i) Замены

Примером варианта настоящего изобретения является полипептид как определено в (а) выше, отличающийся заменой одной или более чем одной аминокислоты одной или более чем одной другой аминокислотой.

Специалист знает, что различные аминокислоты имеют сходные характеристики. Одну или более чем одну такую аминокислоту полипептида часто можно заменить одной или более чем одной другой такой аминокислотой, не устраняя желаемое свойство этого полипептида (как, например, десатуразная активность).

Например, аминокислоты глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин часто можно заменять друг на друга (аминокислоты, имеющие алифатические боковые цепи). Из этих возможных замен предпочтительно, чтобы глицин и аланин использовались для замены друг на друга (поскольку они имеют относительно короткие боковые цепи), а валин, лейцин и изолейцин использовались для замены друг на друга (поскольку они имеют более крупные алифатические боковые цепи, которые являются гидрофобными). Другие аминокислоты, которые часто можно заменять друг на друга, включают в себя фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи); лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, имеющие основные боковые цепи); аспартат и глутамат (аминокислоты, имеющие кислые боковые цепи); аспарагин и глутамин (аминокислоты, имеющие амидные боковые цепи); а также цистеин и метионин (аминокислоты, имеющие серосодержащие боковые цепи).

На замены этой природы часто ссылаются как на “консервативные” или “полуконсервативные” аминокислотные замены.

(ii) Делеции

Делеции аминокислот могут являться предпочтительными, поскольку можно уменьшить общую длину и молекулярную массу полипептида, сохраняя при этом желаемую активность. Это может дать возможность уменьшить количество полипептида, требующееся для конкретной цели.

(iii) Инсерции

Можно также получить инсерции аминокислот в отношении полипептида, как определено в (а) выше. Это можно сделать, чтобы изменить природу полипептида (например, чтобы способствовать идентификации, очистке или экспрессии).

Полипептиды, включающие изменения аминокислот (замены, делеции или инсерции) относительно последовательности полипептида как определено в а) выше можно получить, используя любые подходящие методики. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, включающую в себя желаемое изменение последовательности, можно получить с помощью сайт-направленного мутагенеза. Затем эту последовательность можно использовать, чтобы дать возможность экспрессии полипептида, имеющего соответствующее изменение в своей аминокислотной последовательности.

Полипептиды в объеме (в)

Как обсуждалось выше, часто является предпочтительным уменьшение длины полипептида. Следовательно, признак (в) настоящего изобретения охватывает фрагменты полипептидов (а) или (б) выше, которые имеют длину по меньшей мере 100 аминокислот, но которые могут не быть такими же длинными, как полноразмерный полипептид, показанный на фиг.1. Желательно эти фрагменты имеют длину по меньшей мере 200, по меньшей мере 300 или по меньшей мере 400 аминокислот.

Теперь различные применения полипептидов по настоящему изобретению будут описаны только с помощью примера.

Полипептиды по настоящему изобретению можно использовать, среди прочего, при получении полезных молекул. Например, Δ⁶ десатуразы можно использовать при получении γ-линоленовой кислоты (ГЛК) или при получении метаболитов, в отношении которых ГЛК является предшественником. Например, октадекатетраеноевую кислоту (ОТК; 18:4 Δ^6,9,12,15), член n-3 (или ω-3) жирных кислот, можно производить путем Δ⁶-десатурации α-линоленовой кислоты.

ГЛК, ОТК и их метаболиты являются полезными в медицине. Они могут использоваться при изготовлении лекарства для лечения расстройства, в которое вовлечен дефицит ГЛК или метаболита, образующегося из ГЛК in vivo (например, эйкозаноида). Расстройства, которые можно лечить, включают в себя экзему, масталгию, гиперхолестеринемию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, диабетическую невропатию, вирусные инфекции, угри, гипертензию, цирроз и рак.

Эти метаболиты можно производить in vivo в подходящих хозяевах или in vitro.

Когда метаболит нужно производить in vitro, десатуразу по настоящему изобретению и ее субстрат обычно получают отдельно, а затем объединяют, когда требуется произвести этот метаболит. Таким образом, в объем настоящего изобретения включен способ получения ГЛК или ОТК, при котором Δ⁶ десатуразу по настоящему изобретению используют для превращения субстрата линолевой кислоты или субстрата α-линоленовой кислоты в ГЛК или ОТК, соответственно.

Когда метаболит нужно производить in vivo в организме, таком как растение или животное, субстрат для десатуразы по настоящему изобретению обычно будет обеспечиваться самим соответствующим нечеловеческим организмом. Следовательно, производство метаболита in vivo можно осуществлять с помощью встраивания гена, кодирующего десатуразу по настоящему изобретению, в организм и предоставления возможности для экспрессии десатуразы этим организмом. Эта десатураза затем может действовать на свой субстрат. Таким образом, следует понимать, что полипептиды по настоящему изобретению можно использовать для обеспечения активности десатуразы в организмах, которые в норме не обладали бы такой активностью, или для повышения уровня десатуразной активности в организмах, уже обладающих некоторой десатуразной активностью. Если требуется, полезный метаболит можно очистить из такого организма. Альтернативно сам этот организм можно использовать непосредственно в качестве источника метаболита. Конкретные методики клонирования, которые можно использовать для получения трансгенных организмов с десатуразной активностью, обсуждаются далее.

Полипептиды по настоящему изобретению можно также использовать в качестве индикаторов трансформации организма. Например, если организм, предназначенный для трансформации, не имеет определенной десатуразы, а нуклеиновая кислота, предназначенная для использования при трансформации, кодирует эту десатуразу, после пробной трансформации можно провести анализ, чтобы определить, присутствует ли эта десатураза или нет. Так, в случае Δ⁶ десатуразы можно провести анализ на наличие ГЛК, и ГЛК может служить в качестве простого маркера на присутствие функциональной трансгенной кассеты, содержащей последовательность, кодирующую Δ⁶ десатуразу.

Следующее применение настоящего изобретения состоит в получении антител. В объем настоящего изобретения включены антитела, которые связываются с полипептидами по настоящему изобретению.

Предпочтительные антитела специфически связываются с полипептидами по настоящему изобретению и, следовательно, их можно использовать для очистки таких полипептидов. (Например, их можно иммобилизовать и использовать для связывания с полипептидами по настоящему изобретению. Эти полипептиды затем можно элюировать с помощью промывки подходящим элюентом в соответствующих условиях).

Антитело или его производное в объеме настоящего изобретения можно использовать в диагностике. Например, анализы связывания с использованием такого антитела или производного, можно применять, чтобы определить, присутствует ли определенная десатураза или нет. Это полезно при диагностике расстройств, которые возникают вследствие отсутствия функциональной десатуразы.

Антитела в объеме настоящего изобретения могут являться моноклональными или поликлональными.

Поликлональные антитела можно получить путем стимуляции их продуцирования у подходящего животного-хозяина (например, мыши, крысы, морской свинки, кролика, овцы, козы или обезьяны), когда этому животному инъецируют полипептид по настоящему изобретению. При необходимости вместе с полипептидом по настоящему изобретению можно ввести адьювант. Затем эти антитела можно очистить вследствие их связывания с полипептидом по настоящему изобретению.

Моноклональные антитела можно получать из гибридом. Их можно создавать с помощью слияния миеломных клеток и клеток селезенки, которые продуцируют желаемое антитело, с целью создания бессмертной клеточной линии. Так, можно использовать хорошо известную методику Kohler & Milstein (Nature 256, 52-55 (1975)) или вариации этой методики.

Методики получения моноклональных и поликлональных антител, которые связываются с определенным полипептидом, хорошо разработаны сейчас в данной области техники. Они обсуждаются в стандартных учебниках по иммунологии, например в Roitt et al., Immunology second edition (1989), Churchill Livingstone, London.

Кроме полных антител, настоящее изобретение включает в себя их производные, которые способны связываться с полипептидами по настоящему изобретению. Так, настоящее изобретение включает в себя фрагменты антител и синтетические конструкции. Примеры фрагментов антител и синтетических конструкций даны Dougall et al., в Tibtech 12 372-379 (September, 1994).

Фрагменты антител включают в себя, например, Fab, F(ab’)₂, и Fv фрагменты. (Они обсуждаются, например, в Roitt et al. (см. выше)). Fv фрагменты можно модифицировать с образованием синтетической конструкции, известной как одноцепочечная Fv (scFv) молекула. Она включает в себя пептидный линкер, ковалентно присоединяющий V_h и V_l районы, которые способствуют стабильности молекулы. Другие синтетические конструкции, которые можно использовать, включают в себя CDR пептиды. Они представляют собой синтетические пептиды, содержащие антиген-связывающие детерминанты. Можно также использовать пептидные миметики. Эти молекулы обычно представляют собой органические кольца ограниченной конформации, которые напоминают структуру CDR петли и которые включают в себя взаимодействующие с антигеном боковые цепи.

Синтетические конструкции включают в себя химерные молекулы. Так, например, гуманизированные (или приматизированные) антитела или их производные находятся в объеме настоящего изобретения. Примером гуманизированного антитела является антитело, имеющее каркасные районы человека, но гипервариабельные районы грызунов.

Синтетические конструкции также включают в себя молекулы, содержащие дополнительную группировку, которая обеспечивает эту молекулу каким-нибудь желаемым свойством дополнительно к связыванию антигена. Например, эта группировка может представлять собой метку (например флуоресцентную или радиоактивную метку). Альтернативно она может представлять собой фармацевтически активный агент.

В объем настоящего изобретения также включены молекулы нуклеиновой кислоты.

Такие молекулы нуклеиновой кислоты:

а) кодируют полипептид по настоящему изобретению; или

б) комплементарны молекулам как определено в (а) выше; или

в) гибридизуются с молекулами как определено в (а) или (б) выше.

Эти молекулы нуклеиновой кислоты и их применение более детально обсуждаются ниже.

Полипептиды по настоящему изобретению могут кодироваться большим разнообразием молекул нуклеиновых кислот, принимая во внимание хорошо известную вырожденность генетического кода. Все эти кодирующие молекулы нуклеиновых кислот входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительные кодирующие молекулы нуклеиновых кислот кодируют полипептид, показанный на фиг.1. Они включают в себя молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие кодирующую последовательность, показанную на фиг.1, и ее вырожденные варианты.

Молекулы нуклеиновых кислот можно использовать непосредственно. Альтернативно их можно встраивать в векторы.

Нуклеиновые кислоты или векторы, содержащие их, можно использовать при клонировании. Их можно вводить в нечеловеческих хозяев, чтобы обеспечить экспрессию полипептидов по настоящему изобретению, используя методики, известные специалистам в данной области техники. Альтернативно можно использовать бесклеточные системы экспрессии.

Методики клонирования, экспрессии и очистки полипептидов хорошо известны специалисту. Различные подобные методики описываются в стандартных учебниках, таких как Sambrook et al. (Molecular Cloning 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)); в Old & Primrose (Principles of Gene Manipulation, 5^th Edition, Blackwell Scientific Publications (1994)); и в Stryer (Biochemistry, 4^th Edition, W H Freeman and Company (1995)).

С помощью использования подходящей системы экспрессии можно производить полипептиды в желаемой форме. Например, полипептиды могут продуцироваться микроорганизмами, такими как бактерии или дрожжи, у культивируемыми клетками насекомых (которые можно инфицировать бакуловирусом) или клетками млекопитающих (как, например, клетками яичника китайского хомячка (СНО)).

Однако предпочтительными хозяевами являются растения или материал размножения растений, например масличная культура рапс, подсолнечник, злаки, включая кукурузу, табак, бобы, включая арахис и сою, сафлор, масличная пальма, кокосовая пальма и другие пальмы, хлопок, кунжут, горчица, лен, клещевина, бурачник и энотера, либо материал их размножения.

Технология получения растений или материала размножения растений в настоящее время хорошо разработана. Она кратко обсуждается, например, в WO 96/21022. Десатуразы, выделенные из животных, успешно экспрессированы в растениях. Например, Spychalla, J.P. et al. (см. выше) описывает экспрессию десатуразы C.elegans в трансгенном Arabidopsis. Кроме того, в ЕР 0550162 (Pioneer Hi-Bred International, Inc.) описывается химерная генная конструкция, кодирующая Δ⁹ десатуразу, выделенную из крысы, а также растения, трансформированные этой конструкцией для получения жирных кислот. Десатураза, описанная в этой публикации, имеет только 22%-ную идентичность с Δ⁶ десатуразой по настоящему изобретению.

Конкретные методики, которые можно использовать, обсуждаются ниже. Конечно, следует понимать, что такие методики не являются ограничивающими.

(i) Векторные системы, основанные на Agrobacterium tumefaciens

Эти векторные системы включают в себя системы, основанные на Ti, такие как pGV3850, в которых Т-ДНК обезврежено. Желательно присутствует селективный маркер (например маркер, который обеспечивает устойчивость к антибиотикам).

Можно также использовать промежуточные векторы (ПВ). Они имеют свойство быть маленького размера и, следовательно, ими обычно легче манипулировать, чем с большими векторами на основе Ti. ПВ в целом представляют собой векторы, полученные из Т-ДНК, клонированной в плазмидные векторы, выделенные из E.coli, такие как pBR322. ПВ часто являются дефектными по конъюгации, и поэтому для придания подвижности ПВ можно использовать способную к конъюгации плазмиду (такую как pRK2013) таким образом, чтобы ПВ можно было трансформировать в реципиент Agrobacterium. Затем в Agrobacterium может происходить гомологичная рекомбинация in vivo, чтобы дать возможность встраивания ПВ в резидентную обезвреженную Ti-плазмиду с целью получения коинтеграта, который способен автономно реплицироваться в Agrobacterium.

Другой альтернативой является использование бинарных Ti векторов. В этом случае модифицированный район Т-ДНК, несущий чужеродную ДНК, может обеспечиваться малой плазмидой, которая реплицируется в E.coli (например pRK252). Затем эту плазмиду (иногда называемая мини-Ti или микро-Ti) можно конъюгативно переносить посредством трехродительского спаривания в A.tumefaciens, которая содержит совместимый vir ген (при условии транс-функции vir).

Бинарные векторы можно использовать даже без Ti последовательностей. В этом случае, чтобы способствовать переносу плазмиды, можно использовать бактериальные функции mob и oriT. Кроме того, может обеспечиваться транс-функция vir.

Векторные системы, обсуждаемые выше, можно применять для переноса генов в растения с использованием протокола Horsch et al. (Science 227, 1229-31 (1985)) или его вариантов. В этом случае из листьев двудольного растения компостером можно вырезать небольшие диски, стерилизовать их поверхность, а затем поместить их в среду, имеющую в своем составе A.tumefaciens, которая содержит рекомбинантную Т-ДНК, в которой чужеродный ген, предназначенный для переноса, сопровождается селективным маркером (например nео геном). Затем эти диски можно культивировать в течение 2 суток, а затем переносить в среду для отбора селективного маркера (Для селективного маркера nео это можно сделать с помощью культивирования, используя среду, содержащую канамицин). A.tumefaciens можно убить с помощью использования среды, содержащей карбенициллин. Побеги будут развиваться из каллуса в норме через 2-4 недели. Затем их можно отрезать и пересадить в среду, индуцирующую корни, и когда они станут достаточно большими, пересадить их в почву.

(ii) Векторные системы, основанные на Agrobacterium rhizogenes

Эти системы включают в себя Ri производные плазмиды. Ri Т-ДНК, как правило, считают безвредной, и, следовательно, такие плазмиды можно считать эквивалентными обезвреженным Ti плазмидам. Разработана коинтегративная система ПВ, основанная на Ri плазмидах.

(iii) Системы трансформации, основанные на протопластах растений

Подходящие методики описаны в “Plant Gene Transfer and Expression Protocols” ed. H.Jones, Human Press Methods in Molecular biology, 49, 1995.

Трансформации растений можно способствовать с помощью удаления растительных клеточных стенок с образованием протопластов. Эти клеточные стенки можно удалить любыми подходящими способами, включая механическое разрушение или обработку целлюлолитическими и пектинолитическими ферментами. Затем протопласты можно отделить от остальных компонентов с помощью центрифугирования, а затем для трансформации протопластов гетерологичной ДНК можно использовать методики, такие как электропорация. В подходящих условиях культивирования эти трансформированные протопласты будут наращивать новые клеточные стенки, а также делиться. Затем можно индуцировать побеги и корни, и могут образоваться ростки.

(iv) Трансфекция с помощью биолистиков

Для доставки ДНК или РНК в растительные клетки можно использовать высокоскоростные микроснаряды, несущие эти ДНК или РНК. Это позволило получить широкое разнообразие трансгенных растений и подходит как для однодольных, так и для двудольных растений. Например, можно использовать золотые или вольфрамовые частицы, покрытые ДНК или РНК. Подходящие аппараты для метания этих микроснарядов включают в себя аппараты на основе пороха, аппараты на основе электрического разряда и пневматические аппараты.

(v) Системы на основе вирусов

Векторы растительных ДНК-вирусов включают в себя вирусы мозаики цветной капусты (которые инфицируют ряд двудольных) и геминивирусы (которые инфицируют широкий круг двудольных и однодольных). Растительные РНК-вирусы составляют большинство и включают в себя вирус мозаики костера (который инфицирует ряд Graminae, включая ячмень) и вирус табачной мозаики (который инфицирует растения табака).

Из предшествующего описания следует понимать, что молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению, могут быть клонированы и экспрессированы в широком разнообразии организмов.

Кроме молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды по настоящему изобретению (на которые здесь ссылаются как на “кодирующие” молекулы нуклеиновых кислот), настоящее изобретение также включает в себя молекулы нуклеиновых кислот, им комплементарные. Так, например, обе нити двунитевой молекулы нуклеиновой кислоты включены в объем настоящего изобретения (связаны они друг с другом или нет). Включены также молекулы мРНК и комплементарные молекулы ДНК (например молекулы кДНК).

Молекулы нуклеиновых кислот, которые могут гибридизоваться с одной или более чем одной молекулой нуклеиновой кислоты из обсуждаемых выше, также охвачены настоящим изобретением. На такие молекулы нуклеиновой кислоты здесь ссылаются как на “гибридизующиеся” молекулы нуклеиновой кислоты.

Гибризидующаяся молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может иметь высокую степень идентичности последовательности по всей длине с молекулой нуклеиновой кислоты в объеме (а) или (б), приведенных выше (например, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 90%-ную идентичность последовательности).

Как следует понимать специалистам в данной области техники, чем выше степень идентичности последовательности, которую имеет данная однонитевая молекула нуклеиновой кислоты с другой однонитевой молекулой нуклеиновой кислоты, тем выше вероятность того, что в подходящих условиях она будет гибридизоваться с однонитевой молекулой нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной этой другой однонитевой молекуле нуклеиновой кислоты.

Желательно, чтобы гибридизующиеся молекулы по настоящему изобретению имели длину по меньшей мере 10 нуклеотидов и предпочтительно имели длину по меньшей мере 25, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100 или по меньшей мере 200 нуклеотидов.

Предпочтительные гибридизующиеся молекулы гибридизуются в строгих условиях гибридизации. Одним из примеров строгих условий гибридизации является тот, когда попытку гибридизации осуществляют при температуре от примерно 35°С до примерно 65°С, используя солевой раствор, который является примерно 0,9-молярным. Однако специалисту следует уметь варьировать такие параметры соответствующим образом, чтобы принимать в расчет переменные, такие как длина зонда, состав оснований, тип присутствующих ионов и т.д.

Наиболее предпочтительно гибридизующиеся молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению гибридизуются с молекулой ДНК, имеющей кодирующую последовательность, показанную на фиг.1, с эквивалентной ей РНК или с последовательностью, комплементарной любой из вышеуказанных молекул.

Гибридизующиеся молекулы нуклеиновых кислот могут быть полезны, например, в качестве зондов или праймеров.

Зонды можно использовать, чтобы очищать и/или идентифицировать нуклеиновые кислоты. Например, их можно использовать для идентификации присутствия всего гена десатуразы или его участка, и, следовательно, они являются полезными в диагностике.

Праймеры являются полезными для амплификации нуклеиновых кислот или их участков, например с помощью методик ПЦР.

Кроме использования в качестве зондов или праймеров, гибридизующиеся молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению можно использовать в качестве антисмысловых молекул, чтобы изменить экспрессию полипептидов по настоящему изобретению посредством связывания с комплементарными молекулами нуклеиновых кислот. (Как правило, этого можно достичь с помощью предоставления молекул нуклеиновой кислоты, которые связываются с молекулами РНК, которые в норме должны транслироваться, предотвращая таким образом трансляцию за счет образования дуплексов).

Гибридизующиеся молекулы нуклеиновой кислоты можно также получать в виде рибозимов. Рибозимы также можно использовать, чтобы регулировать экспрессию посредством связывания их с молекулами РНК и расщепления этих молекул, которые включают в себя определенные последовательности-мишени, распознаваемые этими рибозимами.

Из предшествующего обсуждения следует понимать, что большое число нуклеиновых кислот входят в объем настоящего изобретения. Если в контексте не указано иначе, молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут, таким образом, обладать одной или более чем одной из следующих характеристик:

1. Они могут представлять собой ДНК или РНК (включая варианты встречающихся в природе ДНК или РНК структур, которые имеют не встречающиеся в природе основания и/или не встречающиеся в природе остовы).

2. Они могут быть однонитевыми или двунитевыми.

3. Они могут быть представлены в рекомбинантной форме, то есть ковалентно сшитыми с гетерологичной 5’ и/или 3’ фланкирующей последовательностью с образованием химерной молекулы (например вектора), которая не встречается в природе.

4. Они могут быть представлены без 5’ и/или 3’ фланкирующих последовательностей, которые обычно встречаются в природе.

5. Они могут быть представлены в чистой по существу форме, например с помощью использования зондов для выделения клонированных молекул, имеющих желаемую целевую последовательность, или с помощью использования методик химического синтеза. Таким образом, они могут быть представлены в форме, которая является по существу свободной от примесей белков и/или от других нуклеиновых кислот.

6. Они могут быть снабжены интронами (например в виде полноразмерного гена) или не содержать интронов (например в виде кДНК).

Теперь настоящее изобретение будет описано только с помощью примера со ссылкой на сопровождающие графические материалы, фиг.1-6.

На фиг.1 показана последовательность ДНК и установленная по ней аминокислотная последовательность полноразмерной кДНК pCeD6.1 C.elegans. Положения N-терминального домена цитохрома b₅ и варианта третьего гистидинового бокса подчеркнуты. Выведенная аминокислотная последовательность этой кДНК является идентичной последовательности, спрогнозированной для остатков 1-38 и 68-473 W08D2.4.

На фиг.2А показано сравнение установленных аминокислотных последовательностей кДНК CeD6.1 C.elegans и спрогнозированного белка W08D2.4 C.elegans (MywormD6=CeD6.1; cew08d2=OPC (открытая рамка считывания) W08D2.4).

На фиг.2В показано сравнение установленных аминокислотных последовательностей Δ⁶ десатуразы бурачника (Sayanova et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4211-4216) и кДНК CeD6.1 C.elegans (Boofd6=Δ⁶ десатураза Borago officinatis; ceeld6=CeD6.1).

На фиг.3А и 3В показаны метиловые эфиры суммарных липидов S.cerevisiae, выращенных в индуцирующих условиях (линолеат и галактоза).

На фиг.4 показан ГХ-МС анализ нового пика, идентифицированного у дрожжей, несущих pYCeD6.1.

На фиг.5 показан упрощенный вариант метаболизма n-6 незаменимых жирных кислот у млекопитающих.

На фиг.6А и 6В показаны эфиры жирной кислоты и метила материала листьев, как из контрольного трансформированного растения Arabidopsis (А), так и из трансформированного растения Arabidopsis, экспрессирующего Δ⁶ десатуразу C.elegans (Б).

Пример 1 - Выделение гена Δ⁶ десатуразы и экспрессия в дрожжах

В базе данных последовательностей NCBI EST проводили поиск аминокислотных последовательностей, используя известную Δ⁶ десатуразу жирных кислот бурачника (Sayanova et al. (1997), см. выше) и ограничивая поиск последовательностями, содержащими вариантный гистидиновый бокс Q-X-X-H-Н.

Были идентифицированы EST C.elegans. Они были далее охарактеризованы с помощью поиска в базе данных планов EST C.elegans (лаборатория проф. И.Кохара (Y.Kohara) (National Institute of Genetics, Mishima, Japan); База данных ДНК Японии), чтобы идентифицировать соответствующие космидные клоны.

Из плана EST C.elegans частичный кДНК клон 448 п.о., обозначенный как yk436b12, был идентифицирован с помощью этих поисков, и этот клон использовали для скрининга кДНК библиотеки C.elegans (смешанная стадия; также снабжалась проф. Кохара). Это показало, что клон yk436b12 был гомологичен участку гена, присутствующего на космиде W08D2 (Z70271 номер по каталогу Genbank), который образует участок хромосомы IV. С помощью программы прогнозирования белков Genefinder (Wilson R et al. (1994) Nature 368, 32-38) было спрогнозировано, что основания 21-2957 космиды W08D2 кодируют ОРС из 473 остатков, которая прерывается 5 интронами. Wilson R et al. описывают участок последовательности хромосомы III C.elegans. Был идентифицирован и далее очищен ряд положительных клонов, и с помощью секвенирования подтвердили, что полноразмерные клоны кодируют транскрипт, вероятно, транскрибированный с гена, обозначенного W08D2.4, на космиде W08D2, как определено с помощью поиска в базе данных генов, секвенированных с помощью плана генома C.elegans.

Исследование этого спрогнозированного полипептида (обозначенного W08D2.4 в Sanger Centre Nematode Sequencing Project, Hinxton, UK) выявило, что он имел ряд характеристик, напоминающих микросомальную десатуразу жирных кислот, включая три гистидиновых бокса. Однако эта спрогнозированная белковая последовательность указывала на наличие N-терминального домена, подобного цитохрому b₅, содержащего диагностический мотив H-P-G-G, обнаруженный в белках цитохромах b₅ (Lederer F. (1994) Biochimie 76, 674-692). Поскольку Δ⁶ десатураза, выделенная авторами изобретения из бурачника, также содержала N-терминальный домен b₅, это указывало на то, что W08D2.4 может кодировать Δ⁶ десатуразу.

Более тщательное исследование этой последовательности выявило наличие третьего вариантного гистидинового бокса с заменой H→Q (опять же, как наблюдалось у Δ⁶ десатуразы бурачника). Степень подобия между W08D2.4 и Δ⁶ десатуразой бурачника составляет менее 52% и, следовательно, является низкой. Цифра менее 31%, полученная для идентичности, также является низкой.

Поскольку W08D2.4 кодируется геном, содержащим много (6) интронов, было необходимо выделить полноразмерную кДНК, чтобы проверить последовательность, спрогнозированную программой Genefinder, а также дать возможность экспрессии ОРС, чтобы определить кодируемую функцию.

Скрининг кДНК библиотеки осуществляли EST вставкой yk436b12 (любезно предоставленной проф. И. Кохара) и идентифицировали ряд положительных бляшек. Далее их очистили до гомогенности, вырезали и секвенировали самые большие вставки (~1450 п.о.) из полученных спасенных фагмид. Таким образом подтвердили, что кДНК, выделенные авторами изобретения, действительно гомологичны W08D2.4, причем 5’ и 3’ концы кДНК эквивалентны основаниям 9 и 3079 последовательности космиды W08D2.

Поскольку инициирующий кодом ATG, который, как спрогнозировано программой Genefinder, является стартом генного продукта W08D2.4, действительно представляет собой первый метионин в кДНК клоне, то авторы изобретения убедились, что они выделили действительно полноразмерную кДНК. Последовательность ДНК и установленная по ней аминокислотная последовательность одного репрезентативного кДНК клона (названного pCeD6.1; длиной 1463 п.о.) показана на фиг.1; эта установленная аминокислотная последовательность идентична спрогнозированной для W08D2.4 в большей части белка. Положения N-терминального домена цитохрома b₅ и варианта третьего гистидинового бокса подчеркнуты. Установленная аминокислотная последовательность этой кДНК идентична последовательности, спрогнозированной для остатков 1-38 и 68-473 W08D2.4.

Однако последовательности ДНК, кодирующие остатки 38-67 (Y-S-I......L-Y-F), спрогнозированные для W08D2.4, в этом кДНК клоне не присутствуют. Это означает, что установленная аминокислотная последовательность CeD6.1 в действительности имеет длину 443 аминокислоты в противоположность последовательности, спрогнозированной для W08D2.4, которая имеет длину 473 остатка. Единственным другим различием между двумя этими аминокислотными последовательностями является замена M→V в остатке 401, являющаяся результатом замены основания A→G (основание 1211). Эти две последовательности сравниваются на фиг.2А, так же как сравниваются установленная аминокислотная последовательность Δ⁶ десатуразы бурачника и установленная аминокислотная последовательность CeD6.1 (фиг.2Б). Вероятно, что дополнительная последовательность, спрогнозированная для W08D2.4, является следствием неправильного прогноза интронэкзонных границ.

Обратите внимание на наличие мотива H-P-G-G цитохрома b₅ на N-конце (кодируемого основаниями 96-108) и замены Н→Q в третьем гистидиновом боксе (кодируемом основаниями 1157-1172).

Кодирующую последовательность W08D2.4 встраивали в дрожжевой вектор экспрессии pYES2 с помощью ПЦР. Для введения сайтов Крnl и Sacl на 5’ и 3’ концах соответственно использовали нуклеотиды с выступающими 5’ концами. Правильность конструкции проверяли с помощью транскрипции и трансляции in vitro, используя систему TnT (Promega).

Конкретно, затем в качестве матрицы для ПЦР амплификации полной спрогнозированной кодирующей последовательности (длина 443 аминокислотных остатка) использовали клон pCeD6.1 и клонировали в дрожжевой вектор экспрессии pYES2 (Invitrogen) с получением pYCeD6. Правильность этой ПЦР-генерированной последовательности проверяли транскрипцией/трансляцией этой плазмиды in vitro, используя промотор РНК полимеразы Т7, присутствующий в pYES2.

Используя объединенную систему транскрипции/трансляции Promega TnT, генерировали продукты трансляции и анализировали их с помощью электрофореза в ПААГ (полиакриламидный гель) с ДСН (додецилсульфат натрия) и авторадиографии согласно инструкции производителя. Таким образом выявили (данные не представлены), что плазмида pYCeD6 генерирует продукт ~55 кДа, тогда как в контроле (pYES2) не удалось получить каких-либо белковых продуктов, что указывает на то, что конструкция была правильной.

Полученную плазмиду вводили в дрожжи (S.cerevisiae) с помощью литий-ацетатного способа (Guthrie С., Fink G.R. (1991) Meths Enz. 194) и индуцировали экспрессию трансгена добавлением галактозы. К дрожжам добавляли 0,2 М линолеат (натриевую соль) в присутствии 1% тергитола NP-40.

Трансформация и отбор дрожжей, способных расти на урацилдефицитной среде, выявили дрожжевые колонии, несущие рекомбинантную плазмиду pYCeD6 посредством селективного маркера URA3, которого несет pYES2. Экспрессии pYCeD6 добивались с помощью индукции GAL промотора, который присутствует в pYES2. Это осуществляли после того, как клетки вырастали в течение ночи с раффинозой в качестве источника углерода, и среду дополняли добавлением линолеата (18:2) в присутствии низких уровней детергента. Это последнее добавление требовалось, поскольку нормальным субстратом для Δ⁶ десатурации являются жирные кислоты 18:2, которые обычно не встречаются у S.cerevisiae.

Суммарные жирные кислоты дрожжей анализировали с помощью ГХ метиловых эфиров. Подтверждение присутствия ГЛК осуществляли с помощью ГХ-МС (Sayanova et al. (1997) см. выше).

Более детально, культурам затем давали продолжать расти после индукции, при этом отбирали аликвоты для анализа с помощью ГХ. Когда метиловые эфиры суммарных жирных кислот выделяли из дрожжей, несущих плазмиду pYCeD6 и выращенных в присутствии галактозы, и анализировали линолеат с помощью ГХ, наблюдали дополнительный пик (фиг.3). На фиг.3 на панели А представлены дрожжи, трансформированные контрольным (пустым) вектором pYES2, на панели Б представлены дрожжи, трансформированные pYCeD6.1. Общие метиловые эфиры жирных кислот идентифицировали как 16:0 (пик 1), 16:1 (пик 2), 18:0 (пик 3), 18:1 (пик 4), 18:2 (пик 5; добавлен экзогенно). Дополнительный пик (6) на панели Б соответствует 18:3 ГЛК указан стрелкой. Он имел такое же время удерживания, как и стандарт подлинной ГЛК, что указывает на то, что трасгенные дрожжи способны к Δ⁶-десатурации линолевой кислоты. Ни в одном из контрольных образцов (трансформация pYES2) таких пиков не наблюдалось. Идентичность этого дополнительного пика подтверждали с помощью ГХ-МС, что положительно идентифицировало это соединение как ГЛК (фиг.4). В эксперименте фиг.4 образец анализировали с помощью масс-спектров, как ранее (Sayanova О. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 4211-4216), и эти данные использовали для поиска в библиотеке профилей. Этот образец был идентифицирован как ГЛК. Показано сравнение масс-спектров нового пика (А) и подлинной ГЛК (Б); визуальное и компьютерное исследование выявило, что они являются идентичными. Это подтверждает, что CeD6.1 кодирует Δ⁶ десатуразу C.elegans, и что эта кДНК, вероятно, должна транскрибироваться с гена, который, как спрогнозировано, кодирует ОРС W08D2.4, хотя установленная аминокислотная последовательность CeD6.1 на 30 остатков меньше, чем последовательность W08D2.4.

Пример 2 - Экспрессия Δ⁶ десатуразы C.elegans в растениях

Кодирующую последовательность Δ⁶ десатураз C.elegans субклонировали в растительный вектор экспрессии pJD330, который содержит вирусный промотор 35S и терминатор Nos. Затем полученную кассету, или промотор/кодирующая последовательность/терминатор, субклонировали в растительный бинарный вектор трансформации pBin19, и полученную плазмиду вводили в Agrobacterium tumefaciens. Затем этот штамм Agrobacterium использовали для трансформации Arabidopsis с помощью вакуум-инфильтрации соцветий. Семена собирали и помещали на чашки с селективной средой, содержащей канамицин. Поскольку pBin19 придает устойчивость к этому антибиотику, будет расти только трансформированный растительный материал. Устойчивые линии идентифицировали и подвергали самооплодотворению для получения гомозиготного материала. Материал листьев анализировали на профили жирных кислот, используя такой же способ, как тот, что использовался для экспрессии десатуразы нематод в дрожжах. Метиловые эфиры жирных кислот разделяли с помощью ГХ, и новые пики, показанные на фиг.6, идентифицировали путем сравнения с известными стандартами и ГХ-МС. В (Б) видны два новых пика, которые были идентифицированы как γ-линоленовая кислота (пик 1) и октадекатетраеноевая кислота (пик 2). Они представляют собой продукты Δ⁶-десатурации жирных кислот-предшественников линолевой кислоты и α-линоленовой кислоты, соответственно.

Авторы изобретения показали, что кДНК C.elegans (CeD6.1) кодирует Δ⁶ десатуразу, и что эта последовательность является идентичной с спрогнозированной OPC W08D2.4 за исключением вставки 30 остатков, присутствующей в N-терминальном районе последнего белка. Неясно, представляет ли собой установленная аминокислотная последовательность, спрогнозированная для CeD6.1, вариант сплайсинга W08D2.4, или она является результатом ошибочного прогноза интрон/экзонных соединений программой Genefinder. Однако, ясно, что CeD6.1 кодирует Δ⁶ десатуразу.

Представляется, что OPC, кодируемая этой последовательностью C.elegans, родственна Δ⁶ десатуразе жирных кислот высших растений, ранее выделенной авторами изобретения (Sayanova et al. (1997), см. выше), в том, что обе они содержат N-терминальные домены, которые проявляют гомологию с цитохромом b₅. Продемонстрировано, что микросомальные десатуразы жирных кислот используют свободный микросомальный цитохром b₅ в качестве своего донора электронов (Smith М. А. et al. (1990) Biochem. J. 272, 23-29, Smith M.A. et al. (1992) Biochem. J. 287, 141-144), и похоже, что подавляющее большинство идентифицированных последовательностей для этих ферментов, не содержат этот дополнительный домен цитохрома b₅ (Okuley J. et al. (1994) Plant Cell. 6, 147-158, Aronel V. et al. (1992) Science 258, 1353-1355 и Napier, J.A. et. al. (1997) Biochemical J., 328: 717-8).

До настоящего изобретения было известно только два примера десатураз, содержащих домен цитохрома b₅, причем одна представляет собой Δ⁶ десатуразу бурачника, а другая представляет собой дрожжевую микросомальную Δ⁹ (OLE1) десатуразу (Napier, J.A. et al. (1997) Biochemical J., см. выше, и Mitchell AG, Martin CE (1995) J. Biol. Chem. 270, 29766-29772). OLE1, однако, содержит С-терминальный домен цитохрома b₅ (Napier J.A. et al, (1997) Biochemical J, в печати, и Mitchell AG, Martin CE (1995) J. Biol. Chem. 270, 29766-29772). Причина цитохрома b₅, возможно, в том, что Δ⁶ десатураза представляет собой десатуразу “переднего конца”. (Десатурацию “переднего конца” можно определить как конечную реакцию десатурации на цепи жирной кислоты, обычно вводящую двойные связи между существующей ранее связью и Δ-концом карбокси группы (Mitchell AG, Martin CE (1995) J. Biol. Chem. 270, 29766-29772 и Aitzetmuller К., Tseegsuren, N (1994) J. Plant Physiol. 143, 538-543).

В любом случае, теперь считается фактом, что как вариантный гистидиновый бокс, так и N-терминальный домен цитохрома b₅ являются консервативными как у растений, так и у животных, о чем свидетельствует их наличие в обеих Δ⁶ десатуразах, бурачника и нематоды.

Таким образом, изобретение может давать возможность идентификации других Δ⁶ десатураз, а также других десатураз “переднего конца”, которые нужно идентифицировать по наличию этих мотивов.

1. Выделенный полипептид, обладающий десатуразной активностью, который:

а) имеет аминокислотную последовательность, показанную на фиг.1;

б) имеет одну или более чем одну аминокислотную делецию, вставку или замену относительно полипептида как определено в (а) выше, но вместе с тем имеет с ним по меньшей мере 95%-ную идентичность аминокислотной последовательности; или

в) представляет собой фрагмент полипептида как определено в (а) или (б) выше, который имеет длину по меньшей мере 100 аминокислот.

2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что он имеет домен цитохрома.

3. Полипептид по п.2, отличающийся тем, что он имеет домен цитохрома b₅.

4. Полипептид по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что он имеет по меньшей мере один гистидиновый бокс.

5. Полипептид по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что он имеет три гистидиновых бокса.

6. Полипептид по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что он представляет собой десатуразу, которая вводит двойную связь между уже существующей двойной связью и карбоксигруппой жирной кислоты.

7. Полипептид по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что он представляет собой Δ⁶-десатуразу.

8. Полипептид по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что он встречается в природе в организме, который не аккумулирует γ-линоленовую кислоту (ГЛК).

9. Полипептид по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что он встречается в природе в эукариоте.

10. Полипептид по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что он встречается в природе в животном.

11. Полипептид по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что он встречается в природе в нематоде.

12. Полипептид по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что он встречается в природе Caenorhabitis elegans.

13. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что он состоит из аминокислотной последовательности, показанной на фиг.1, или из ее участка.

14. Полипептид по любому из пп.1-13 для получения или отбора антител.

15. Полипептид по любому из пп.1-13 для применения в медицине.

16. Полипептид по любому из пп.1-13 для приготовления лекарства для лечения расстройства, в которое вовлечен дефицит γ-линоленовой кислоты или метаболита, образующегося in vivo из γ-линоленовой кислоты (ГЛК).

17. Полипептид по п.16, отличающийся тем, что метаболит представляет собой эйкозаноид.

18. Полипептид по любому из пп.15-17, для лечения расстройства, представляющего собой экзему, масталгию, гиперхолестеринемию, атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, диабетическую невропатию, вирусные инфекции, угри, цирроз, гипертензию и рак.

19. Маркер трансформации организма, содержащий полипептид по любому из пп.1-13.

20. Маркер по п.19, отличающийся тем, что организмом является растение.

21. Антитело или его производное, которое специфически связывается с полипептидом по любому из пп.1-13 и получено с использованием этого полипептида.

22. Антитело или его производное по п.21 для диагностики расстройств, которые возникают вследствие отсутствия функциональной десатуразы.

23. Способ оценки того, имеет ли организм полипептид по любому из пп.1-13 или нет, при котором определяют, имеет ли этот организм полипептид, который связывается с антителом или его производным по п.21 или нет.

24. Способ по п.23, отличающийся тем, что организм представляет собой человека.

25. Способ по п.23 или 24, отличающийся тем, что его осуществляют предпочтительно in vitro.

26. Способ получения ГЛК, при котором для превращения линолевой кислоты в ГЛК используют полипептид по любому из пп.1-13.

27. Способ получения октадекатетраеновой кислоты (ОТК), при котором для превращения α-линоленовой кислоты в ОТК используют полипептид по любому из пп.1-13.

28. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая:

а) кодирует полипептид по любому из пп.1-13, или

б) представляет собой комплемент молекулы нуклеиновой кислоты как определено в (а) выше.

29. Молекула нуклеиновой кислоты по п.28 для применения в качестве зонда или в качестве праймера.

30. Молекула нуклеиновой кислоты по п.28 для получения организма, который аккумулирует ГЛК или метаболит, образующийся из ГЛК в этом организме.

31. Молекула нуклеиновой кислоты по п.28 для получения организма, который является хладостойким.

32. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.28.

33. Вектор по п.32 для получения организма, который аккумулирует ГЛК или метаболит, образующийся из ГЛК в этом организме.

34. Вектор по п.32 для получения организма, который является хладостойким.

35. Способ получения полипептида по любому из пп.1-13, при котором хозяина, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по п.28 или вектор по п.32, причем хозяин предпочтительно представляет собой растение, такое как масличную культуру рапс, подсолнечник, злаки, включая кукурузу, табак, бобы, включая арахис и сою, сафлор, масличную пальму, кокосовую пальму и другие пальмы, хлопок, кунжут, горчицу, лен, клещевину, бурачник и энотеру, или материал для размножения растений, инкубируют в условиях, вызывающих экспрессию указанного полипептида, а затем очищают указанный полипептид.

36. Способ создания хозяина, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты по п.28 или вектор по п.32, причем хозяин предпочтительно представляет собой растение, такое, как масличную культуру рапс, подсолнечник, злаки, включая кукурузу, табак, бобы, включая арахис и сою, сафлор, масличную пальму, кокосовую пальму и другие пальмы, хлопок, кунжут, горчицу, лен, клещевину, бурачник и энотеру, или материал для размножения растений, при котором нуклеиновую кислоту по п.28 или вектор по п.32 вводят в организм с обеспечением его трансформации.