Способ приготовления питательной среды для культивирования бифидобактерий и лактобацилл
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии, в частности в производстве питательных сред для культивирования бифидобактерий и лактобацилл. Способ предусматривает приготовление питательной среды на основе воды. Воду, используемую для приготовления среды, предварительно обрабатывают нефильтрованным модулированным светом ультрафиолетового излучения с содержанием в лучистом потоке не менее 30% ультрафиолетовых квантов с длиной волны короче 350 нм, в течение времени, необходимого для увеличения внутренней энергии воды не менее чем в 2 раза. Измерение параметров, характеризующих изменение внутренней энергии воды до обработки воды и в течение всего процесса обработки. Способ позволяет значительно активировать культуральные свойства микроорганизмов, сократить время выращивания. 1 з.п. ф-лы, 5 табл.
Изобретение относится к использованию ультрафиолетового излучения в биотехнологии, может быть применено в микробиологической, пищевой промышленности и касается способов приготовления питательных сред для культивирования бифидобактерий и лактобацилл.
Известен способ получения биомассы микроорганизмов, заключающийся в том, что биомассу выращивают в питательной среде заявляемого состава, в котором в качестве стимулятора роста клеток используют комплексный препарат гибберсиб, получаемый на основе культуральной жидкости, образующейся при выращивании гриба Fusarium moniliforma в количестве 1· 10-12-1· 10-60% (Патент РФ №2093570, МПК 6 С 12 N 1/20, опубл. 20.10.1997 г., бюл. №29).
Известно техническое решение, в котором предусматривается приготовление питательной среды для культивирования и выделения бифидобактерий заявляемого состава на основе дистиллированной воды (Патент №2203944, МПК 6 С 12 N 1/20, опубл. 10.05.2003 г., бюл. №13).
Недостатком известных технических решений является недостаточно высокий выход и значительная длительность выращивания биомассы.
Техническая задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в получении максимальных результатов по интенсификации процесса восстановления культур бифидобактерий и лактобацилл из неактивного состояния и увеличения выхода биомассы микроорганизмов при сокращении времени их выращивания путем использования активной воды в процессе приготовления составов питательных сред.
Поставленная техническая задача решается тем, что в способе приготовления питательной среды для культивирования бифидобактерий и лактобацилл, предусматривающем приготовление питательной среды на основе воды, согласно изобретению, воду для приготовления питательной среды предварительно обрабатывают нефильтрованным модулированным светом ультрафиолетового излучения с содержанием в лучистом потоке не менее 30% ультрафиолетовых квантов с длиной волны короче 350 нм, в течение времени, необходимого для увеличения внутренней энергии воды не менее чем в 2 раза. Дополнительное отличие способа состоит в том, что проводят измерения параметров, характеризующих изменение внутренней энергии воды, до обработки воды и в течение всего процесса обработки.
При обработке упомянутым в способе образом воды происходит увеличение энергии объема обрабатываемой жидкости с последующим увеличением внутренней энергии гидросреды автоколебательных систем микрокультуры. При изменении (снижении) мощности излучения внешнего источника поддержания максимального уровня потока энергии в обрабатываемую среду, внутренняя энергия автоколебательной системы гидросреды стремится к восстановлению равновесия с уровнем энергии окружающей среды. При этом освобождается внутренняя энергия гидросреды автоколебательной системы, происходит перераспределение энергетических уровней в межатомных связях. Таким образом, освобождаемая энергия гидросреды при взаимодействии с микрокультурами приводит к увеличению энергии в автоколебательных системах микрокультур, что способствует повышению культуральных их свойств. Экспериментально было установлено, что использование активированной воды в составах питательных сред способствовало выходу из состояния анабиоза наибольшего числа клеток и активации их жизнедеятельности в сотни раз.
Способ осуществляют следующим образом.
Предназначенную для приготовления питательной среды воду обрабатывают нефильтрованным модулированным светом ультрафиолетового излучения с содержанием в лучистом потоке мощности не менее 30% ультрафиолетовых квантов с длиной волны короче 350 нм. Путем экспериментальных исследований было установлено, что наиболее оптимальным является использование ультрафиолетовых квантов с длиной волны 190-250 нм. Модулирование потока осуществляют по законам квантовой механики, описывающим явление суперпозиции в жидких средах (“Открытая физика”. Полный интерактивный курс физики. Версия 2,5 под редакцией проф. МФТИ С.М. Козелла). Модулировать ультрафиолетовое излучение целесообразно, например частотой (любой) одного из известных биологических ритмов объекта, который будет подвергаться воздействию активированной водой, модуляция может быть амплитудной или импульсной. Обработку проводят в течение времени, необходимого для увеличения внутренней энергии воды не менее чем в 2 раза. При этом измерения параметров, характеризующих изменение внутренней энергии воды, проводят предварительно до обработки воды и в течение всего процесса обработки известными методами с помощью вискозиметра. В качестве устройства водоподготовки, снабженного источником ультрафиолетового излучения, может быть использовано известное устройство для тех же целей либо, например, устройство водоподготовки, конструкция которого описана в заявке №2003107495 с приоритетом от 19.03.2003 г. на изобретение " Устройство водоподготовки".
Например, если подготавливаемый объем воды для активирования составляет 3000 мл и выбирают рабочую длину волны - 230 нм 30% мощности лампы, сопутствующее излучение - видимый и инфракрасный свет; источник излучения мощностью 500 Вт. Фиксированная световая экспозиция составляет 240 минут.
Далее активированную воду (с измененной внутренней энергией) используют для приготовления питательной среды для культивирования бифидобактерий и лактобацилл. Использование активированной воды в составах питательных сред для культивирования бифидобактерий и лактобацилл способствует выходу из состояния анабиоза наибольшего числа клеток и активации их жизнедеятельности в сотни раз.
Способ поясняется следующими примерами.
Пример 1. Для активации использовали штамм культуры вида Lactobacillus casei из коллекции ГНЦ РФ ИМБП РАН. На основе воды, обработанной ультрафиолетовым излучением упомянутым в способе образом, приготовили стандартную питательную среду МРС для культивирования лактобацилл. Культура изначально находилась в лиофилизированном состоянии. Культура регидрировалась и 10-кратно раститровывалась в питательной среде. Инкубировали 48 часов при 37° С.
Выживаемость оценивали по количеству выросших колоний. Данные представлены в таблицах 1-4.
| Таблица 1 Выживаемость лактобацилл в питательной среде, приготовленной по предлагаемому способу | |||
| Среда МРС 0,2%, приготовленная на основе воды, не обработанной ультрафиолетом | 1 сутки роста | 2 сутки роста | |
| Разведения | 6 | 5× 108±1× 106 | 108±1× 106 |
| 7 | 1,4× 109±1× 107 | 109±1× 107 | |
| 8 | нет роста | нет роста | |
| Среда МРС 0,2%, приготовленная на основе воды, обработанной ультрафиолетом | |||
| Разведения | 6 | Сливной рост | Сливной рост |
| 7 | 1× 109±1× 107 | 2× l09±1× 107 | |
| 8 | 3× 1010±1× 108 | 3× 1010±1× 108 |
Также с помощью питательной среды, приготовленной по предложенному способу, успешно оживляли из лиофильного состояния хранившийся в ампуле в течение 13 лет штамм лактобацилл Lactobacillus casei K-25 (см. таблицу 2).
| Таблица 2 Оживление штамма Lactobacillus casei К-25 с помощью питательной среды, приготовленной по предложенному способу | ||
| Среда МРС 0,2%, приготовленная на основе воды, не обработанной ультрафиолетом | ||
| Разведения | 5 | Роста нет |
| 6 | ||
| Среда МРС 0,2%, приготовленная на основе воды, обработанной ультрафиолетом | ||
| Разведения | 5 | сливной рост |
| 6 | 3× 1010 |
При этом количества живых клеток в колониях в питательной среде, приготовленной по предложенному способу, были крупнее в размере, чем выросшие на обычных средах (таблица 3 и 4).
| Таблица 3 Количество живых клеток в колониях в ростовых средах, приготовленных по предложенному способу (КОЕ*/мл)(Эксперимент 1) | |||
| Колонии, изолированные со среды МРС, приготовленной на необлученной воде | Разведения | 5 | сливной рост |
| 6 | 2,8× 108 | ||
| 7 | 6× 108 | ||
| Колонии, изолированные со среды МРС, приготовленной на облученной воде | Разведения | 5 | сливной рост |
| 6 | 3× 109 | ||
| 7 | 7× 109 | ||
| * КОЕ -колониеобразующие единицы. | |||
| Таблица 4 Количество живых клеток в колониях в ростовых средах, приготовленных по предложенному способу (КОЕ)(Эксперимент 2) | |||
| Колонии, изолированные со среды МРС, приготовленной на необлученной воде | Разведения | 6 | 2,0× 109 |
| 7 | 8,0× 109 | ||
| Колонии, изолированные со среды МРС, приготовленной на облученной воде | Разведения | 6 | 3,6× 109 |
| 7 | 1,4× 1010 |
Данные таблиц свидетельствуют об увеличении количества жизнеспособных колоний лактобацилл при их культивировании в ростовых средах, приготовленных по предложенному способу, приблизительно в 100 раз. Эта тенденция появилась на первые сутки роста и продолжалась в последующие сутки. При этом культуры, выросшие на упомянутых средах, не воспроизводили свои свойства при следующем их пассаже на обычные среды.
Пример 2. Для активации использовали штамм культуры вида Bifidobacterium longum из коллекции ГНЦ РФ ИМБП РАН. На основе воды, обработанной ультрафиолетовым излучением упомянутым в способе образом, приготовляли стандартную питательную среду "Бактофок" для культивирования бифидобактерий. Культура изначально находились в лиофилизированном состоянии. Культура регидрировалась и 10-кратно раститровывалась в питательной среде. Инкубировали 48 часов при 37° С. Выживаемость оценивали по количеству выросших колоний (см. таблицу 5).
| Таблица 5 Характеристика выживаемости бифидобактерий в питательной среде, приготовленной по предложенному способу (КОЕ) | ||
| Среда Бактофок 0,2% приготовленная на основе воды, не обработанной ультрафиолетом. | 1 сутки роста | |
| Разведения | 2 | 6,4× 104 |
| 3 | 3,0× 105 | |
| 4 | 6× 105 | |
| 5 | 1,2× 107 | |
| Среда Бактофок 0,2%, приготовленная на основе воды, обработанной ультрафиолетом | ||
| Разведения | 2 | Сливной рост |
| 3 | 8× 105 | |
| 4 | 1,4× 106 | |
| 5 | 1,8× 107 | |
| 6 | 6× 107 |
Приведенные выше примеры свидетельствуют об активизации культуральных свойств микроорганизмов. В процессе восстановления культур лактобацилл и бифидобактерий рода Lactobacillus и Bifidobacteria, входящих в состав множества кисломолочных продуктов, пробиотиков и биодобавок, из неактивного состояния (лиофилизированного, сухого) с помощью питательных сред, приготовленных по предложенному способу, число колониеобразующих клеток повышается на несколько логарифмов (приблизительно в 100 раз). Данные процессы сопровождаются увеличением биомассы в колониях приблизительно в 10 раз. При культивировании лактобацилл в упомянутых средах увеличивается продукция бактериоцина.
Предложенный способ может быть использован в микробиологической, а также пищевой промышленности в производстве кисломолочных продуктов в процессах, связанных с восстановлением промышленных штаммов микроорганизмов из лиофилизированного состояния, приготовлением заквасок и изготовлением кисломолочных продуктов.
1. Способ приготовления питательной среды для культивирования бифидобактерий и лактобацилл, предусматривающий приготовление питательной среды на основе воды, отличающийся тем, что воду для приготовления питательной среды предварительно обрабатывают нефильтрованным модулированным светом ультрафиолетового излучения с содержанием в лучистом потоке не менее 30% ультрафиолетовых квантов с длиной волны короче 350 нм, в течение времени, необходимого для увеличения внутренней энергии воды не менее чем в 2 раза.
2. Способ приготовления питательной среды для культивирования бифидобактерий и лактобацилл по п.1, отличающийся тем, что измерения параметров, характеризующих изменение внутренней энергии воды, проводят до обработки воды и в течение всего процесса обработки.
