Узел контейнера для оплодотворения, культивирования и переноса эмбриона, а также способ оплодотворения и культивирования с использованием такого контейнера
Контейнер содержит корпус, имеющий отверстие для ввода среды культивирования, одного или нескольких ооцитов и спермы с последующим извлечением эмбриона или эмбрионов с помощью катетера извлечения, самогерметизирующееся средство укупорки, предназначенное для избирательного открывания и закрывания отверстия корпуса контейнера. Корпус содержит основную камеру для помещении в нее среды культивирования, ооцитов и спермы и микрокамеру для сбора и последующего извлечения одного или нескольких эмбрионов. Корпус содержит средство, предназначенное для ограничения доступа катетера или пипетки извлечения к указанной микрокамере. Микрокамера соединена с основной камерой. Способ включает следующие этапы: подготовку контейнера; заполнение контейнера средой культивирования и ввода одного или нескольких ооцитов и спермы в среду культивирования и после этого закрывания отверстия; инкубирование закрытого контейнера для осуществления оплодотворения и культивирования ооцитов; создание условий для миграции получаемого эмбриона или эмбрионов в микрокамеру и извлечение одного или нескольких эмбрионов из микрокамеры с помощью катетера или пипетки. Технический результат состоит в упрощении процесса искусственного оплодотворения и использования контейнера. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 19 ил.
Настоящее изобретение относится к контейнеру, предназначенному для оплодотворения и культивирования эмбрионов млекопитающих и, в частности, человека, переноса ооцитов и эмбриона, к способу использования такого контейнера, в частности, для интравагинального применения.
Обычные технологии оплодотворения in vitro (IVF) являются чрезвычайно сложными и имеют тенденцию дальнейшего усложнения с тех пор, как к последовательности действий при искусственном размножении был добавлен этап интрацитоплазматической инжекции спермы (ICSI).
Как правило, IVF включает аэробное и стерильное культивирование эмбрионов в чашках Петри при температуре 37°С и в атмосфере, обогащенной СО2 до уровня 5%. При этом требуется использовать громоздкое и дорогостоящее оборудование, такое как СO2 инкубатор, с поддержанием температуры 37°С 24 часа в сутки, в течение двух или трех дней, необходимых для оплодотворения и культивирования.
IVF также включает использование большого количества оборудования и средств одноразового использования для выполнения множества этапов, проводимых в течение 48 или 72 часов обработки гамет и эмбрионов в инкубаторе, обогащенном СO2. На многих из них необходимо производить тонкие манипуляции, требующие высокого уровня профессиональных навыков и сноровки биолога лаборатории. В частности, это требуется при снятии с эмбриона овариальных клеток перед имплантацией.
Один из соавторов настоящего изобретения Клод Рано (Claude Ranoux) разработал новую процедуру, известную как интравагинальное культивирование (ИВК (IVC)), которая содержит созревание гамет, оплодотворение и развитие эмбриона в герметично закрытом контейнере, заполненном подходящей средой культивирования и помещенном в вагинальную полость, которая служит в качестве инкубатора. Эта процедура, оплодотворение, и контейнер для культивирования описаны в патентах US 4,902,286, выданном 20 февраля 1990 года, и US 5,135,865, выданном 4 августа 1992 года.
Все процедуры ИВК, проводимые для экспериментальных и клинических целей, до настоящего времени должны были выполняться с использованием полипропиленовой криотрубки 100, показанной на фиг.2, производства компании Nunc, г. Камтруп, Дания, герметично закрытой и запаянной в оболочке 101 из полиэтиленового материала cryoflex, также производимой компанией Nunc. Криотрубки и используемые с ними оболочки из материала cryoflex были разработаны для сохранения образцов тканей в криогенных условиях. Криотрубка Nunc и оболочка из материала cryoflex имеют существенные недостатки при использовании их для ИВК.
К этим недостаткам относится то, что трубка должна быть заполнена практически до кромки или до краев горлышка трубки (с внешней резьбой) для предотвращения образования пузырьков воздуха, которые могут, в противном случае, отрицательно повлиять на оплодотворение. Кроме того, при применении на практике сперму необходимо вводить в трубку перед вводом ооцитов, поскольку турбулентность, образующаяся при инжектировании спермы в среду культивирования, в противном случае, может вынести один или несколько ооцитов на поверхность среды, так что они могут перелиться через край. Скопление ооцитов содержит некоторое количество окклюдированных пузырьков воздуха, что может привести к всплыванию ооцитов на поверхность среды культивирования и будут потеряны при навинчивании колпачка 103 на горлышко трубки.
Аналогично, когда колпачок с резьбой навинчивают на горлышко, существует риск перелива среды культивирования, с выносом одного или нескольких ооцитов из трубки.
Оболочка 101 из материала cryoflex должна быть герметизирована вокруг трубки для защиты трубки от загрязнений во время нахождения в вагине. На практике это выполняется путем нагрева обжимного инструмента или щипцов с последующим размягчением и обжимом каждого конца трубки так, что формируются гофрированные сварные или герметизирующие швы 104.
Свободные кромки сварных швов, в свою очередь, требуется подрезать и/или формовать с помощью резака, для удаления углов, но это не устраняет все неудобства, также существует вероятность повреждения в процессе установки в области заднего свода, поскольку свободные расположенные друг напротив друга кромки сварного шва остаются грубыми и острыми. Кроме того, невозможно учитывать все индивидуальные особенности при использовании трубки с одним размером из-за возможной анатомической несовместимости.
Многие из этих недостатков криотрубки Nunc устранены с помощью контейнера, описанного в патентах автора Рано US 4,902,286 и US 5,135,865. Корпус такого контейнера содержит мембрану или клапан, который предотвращает потерю ооцитов в ходе их введения или в процессе введения спермы. Кроме того, мембрана или клапан ограничивают площадь контакта между средой культивирования и окружающей средой и позволяет поддерживать стабильное значение рН среды культивирования. В этих патентах также описано гибкое обрезиненное кольцо, к которому прикреплен резиновый мешочек для установки в него контейнера. Диаметры кольца и диафрагмы должны определяться индивидуально, в зависимости от размера шейки. Трубка предназначена для установки в области заднего свода вагины, но может выпадать, удерживаясь в висячем положении на кольце при отсутствии контакта со стенками вагины.
Развитию ИВК препятствовало отсутствие контейнера, обеспечивающего простое и безопасное использование, для применения которого не нужно было бы привлекать лабораторных работников с высокой квалификацией, что требовалось до настоящего времени из-за сложности операции переноса эмбрионов из контейнера в чашку Петри для микроскопического исследования перед окончательным помещением их в полость матки.
Для подтверждения приведем ссылку на патент автора Рано US 5,084,004, в котором описан контейнер для внутриматочного оплодотворения с выходной областью, предназначенной для обеспечения доступа в полость матки и переноса одного или нескольких оплодотворенных ооцитов из контейнера в полость. Такие устройства не пригодны для использования во влагалище из-за невозможности обеспечить стерильные условия, что может привести к загрязнению эмбрионов. Кроме того, предпочтительные варианты воплощения включают использование специального устройства держателя, которое вводят в шейку, и второй секции, расположенной во влагалище снаружи от шейки так, что она упирается в шейку. Изнутри влагалища приводят в действие поршень для выталкивания содержимого контейнера в маточную полость. Это устройство имеет сложную конструкцию из-за установки средства выталкивания эмбриона и не позволяет непосредственно проводить микроскопическое исследование эмбрионов перед выталкиванием. Кроме того, невозможно обеспечить простое и точное размещение эмбрионов в контейнере для исследования.
Целью настоящего изобретения является контейнер, предназначенный для оплодотворения и культивирования, в котором легко могут быть размещены эмбрионы и/или может быть проведено их исследование на месте и которые могут быть извлечены путем непосредственного переноса из контейнера, например, в полость матки, с помощью катетера или пипетки или подобного устройства.
Кроме того, настоящее изобретение направлено на упрощение работы специалистов в области деторождения с помощью улучшенного нового способа проведения оплодотворения и культивирования, а также исследования эмбриона и переноса его с использованием соответствующего контейнера так, чтобы способ мог выполняться непосредственно в кабинете врача без сложного лабораторного оборудования, без необходимости привлечения использовавшихся до настоящего времени лабораторных биологов с соответствующими навыками и опытом работы.
В соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение направлено на контейнер для оплодотворения и культивирования, содержащий корпус контейнера, имеющий отверстие и самогерметизирующееся средство укупорки, предназначенное для избирательного открывания и закрывания отверстия в корпусе контейнера. Корпус контейнера содержит основную камеру, предназначенную для помещения в нее среды культивирования ооцитов и спермы, и микрокамеру для сбора и последующего извлечения одного или нескольких эмбрионов. Предпочтительно, корпус контейнера содержит средство для ограничения доступа катетера извлечения или подобного средства по отношению к микрокамере.
Предпочтительно микрокамера содержит одну или несколько параллельных прозрачных боковых стенок с оптическим качеством для обеспечения возможности микроскопических исследований одного или нескольких эмбрионов, находящихся в микрокамере.
Предпочтительно внутренний объем основной камеры составляет от приблизительно 1 мл до приблизительно 5 мл и микрокамера имеет внутренний объем меньше, чем приблизительно 100 мкл и предпочтительно в диапазоне от приблизительно 30 мкл до 70 мкл и выполнена с обеспечением возможности сбора одного или нескольких эмбрионов для микроскопических исследований и/или извлечения.
Предпочтительно используют капсулу оболочки контейнера, изготовленную из мягкого эластичного материала, имеющего гладкую и непрерывную внешнюю поверхность, и деформируемое средство амортизации расположено вблизи к концу капсулы для адаптации продольных размеров узла к хордальному размеру заднего свода, когда в нем установлен контейнер для интравагинального оплодотворения и культивирования.
Предпочтительно в качестве оболочки для контейнера используют трубчатую капсулу, состоящую из двух частей, причем одна из частей содержит проходящую внутрь центральную пробку, выполненную с возможностью установки в проходе средства укупорки с его герметизацией.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение направлено на улучшенный способ, включающий этапы создания благоприятных условий для развития гамет в закрытом контейнере ИВК, в котором обеспечивается миграция получаемого в результате эмбриона или эмбрионов в микрокамеру, извлечение эмбриона или эмбрионов непосредственно из микрокамеры с помощью катетера или пипетки для переноса.
Эта и другие цели и преимущества настоящего изобретения будут раскрыты при описании вариантов его воплощения, которые представлены в виде примера со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых
на фиг.1 изображен общий вид с покомпонентным представлением деталей в перспективе узла контейнера для интравагинального оплодотворения и культивирования или ИВК, в котором воплощены различные аспекты настоящего изобретения;
на фиг.2 изображен вид сбоку криотрубки Nunc и оболочки из материала cryoflex известного уровня техники, использовавшихся до настоящего времени для ИВК;
на фиг.3А представлен вид в продольном разрезе колпачка контейнера и элемента клапана контейнера ИВК в соответствии с настоящим изобретением, которые совмещены по оси, но разнесены друг от друга;
на фиг.3В изображен вид в продольном разрезе корпуса контейнера ИВК в соответствии с настоящим изобретением, отдельно от других деталей;
на фиг.4А изображен вид в продольном разрезе контейнера ИВК в соответствии с настоящим изобретением с элементом клапана в открытом положении;
на фиг.4В изображен вид в продольном разрезе контейнера ИВК в соответствии с настоящим изобретением с пипеткой для введения в основную камеру среды культивирования, ооцитов и/или спермы;
на фиг.5А изображен вид в продольном разрезе задней части капсулы;
на фиг.5В изображен вид в продольном разрезе передней части капсулы;
на фиг.6 изображен вид в продольном разрезе узла контейнера ИВК с поворотом на 90° по сравнению с изображением на фиг.4А, с закрытым концом элемента клапана, причем на контейнер частично установлена капсула;
на фиг.7 изображен вид в продольном разрезе всего узла контейнера ИВК с элементом клапана в закрытом положении и капсулой, полностью окружающей контейнер;
на фиг.8А изображен вид заднего конца элемента клапана в открытом положении;
на фиг.8В изображен вид, аналогичный фиг.8А, представляющий элемент клапана в закрытом положении;
на фиг.9 изображен детальный вид в продольном разрезе переднего конца корпуса контейнера с микрокамерой; на фиг.10 изображен вид в поперечном сечении вдоль линии Х-Х, обозначенной на фиг.9;
на фиг.11 изображен вид, аналогичный представленному на фиг.9, для альтернативного варианта воплощения микрокамеры;
на фиг.12 изображен вид, аналогичный изображению, представленному на фиг.10, в сечении вдоль линии XII-XII, обозначенной на фиг.11;
на фиг.13 изображен вид в продольном разрезе контейнера с элементом клапана в открытом положении, так, что катетер проходит в канал, соединяющийся с микрокамерой, для извлечения эмбрионов;
на фиг.14 изображен вид части устройства клапана контейнера ИВК в продольном разрезе в соответствии с альтернативным вариантом воплощения, с клапаном в открытом положении и
на фиг.15 изображен вид, соответствующий фиг.14, с клапаном в закрытом положении.
В соответствии с предпочтительным вариантом воплощения настоящего изобретения контейнер 1 ИВК содержит корпус 10 контейнера, самогерметизирующееся средство 2 укупорки, включающее элемент 30 клапана и рабочий элемент 50 клапана. Части контейнера показаны на фиг.1, 3А и 3В, контейнер в собранном виде показан на фиг.4. Корпус контейнера и рабочий элемент предпочтительно сформованы из полиэтилена, полипропилена или других биосовместимых, относительно жестких пластических материалов. Такие пластические материалы должны быть проницаемыми для углекислого газа СO2 для обеспечения возможности проникновения газа через стенки контейнера из влагалища в содержащуюся в нем среду культивирования. (См. публикацию авторов Мисао Фукуда и др. (Misao Fukuda et al.), Unexpected low oxygen tension of intravaginal culture (Неожиданно низкое давление кислорода в интравагинальной культуре), Human Reproduction, том №6, стр.1285-1295, 1996 г.).
Корпус контейнера имеет, по существу, цилиндрическую боковую стенку 11, формирующую основную камеру 12 и микрокамеру 13, соединенную с основной камерой. Согласно предпочтительному варианту воплощения микрокамера расположена на закрытом переднем конце корпуса контейнера, выходя за пределы переднего конца основной камеры, на противоположной стороне от открытого заднего конца 17А корпуса 10 контейнера. (Термины "передний" и "задний" и т.п. используются в описании и в формуле настоящего изобретения только для удобства описания, и сами по себе не являются определяющими в отношении ориентации контейнера в любой конкретный момент процедуры, описанной в настоящем изобретении). В качестве альтернативы, что не показано на чертежах, микрокамера может быть расположена вдоль образующей или продольной линии основной камеры так, что она выходит в сторону от боковой стенки. Для упрощения извлечения эмбриона с помощью катетера и в массе представленная компоновка микрокамеры, в общем, будет предпочтительной.
Микрокамера 13, показанная на фиг.9 и 10, содержит расположенные друг напротив друга плоские параллельные боковые стенки 24А, 24В, по меньшей мере, одна из которых и предпочтительно обе выполнены с обеспечением возможности микроскопических оптических исследований эмбрионов при сквозном просмотре. Расстояние между внутренними поверхностями параллельных боковых стенок 24А, 24В микрокамеры выбирают так, чтобы оно было больше, чем диаметр эмбриона, с тем чтобы предотвратить зажатие эмбрионов в микрокамере, но предпочтительно достаточно близким для предотвращения смещения эмбриона в среде культивирования. Расстояние между боковыми стенками микрокамеры должно быть приблизительно меньше 1 мм и предпочтительно должно составлять приблизительно 0,5 мм или меньше для эмбрионов человека, а также коровы. Боковые стенки микрокамеры соединяются проходящей продольно, частично цилиндрической поперечной стенкой 24С с одной стороны микрокамеры. Микрокамера 13 также включает сужающийся по направлению вперед, смещенный по радиусу, воронкообразный канал 20, проходящий от входного отверстия 12А, связанного с основной камерой 12, по направлению к передней конечной стенке 13А микрокамеры. Остальная часть микрокамеры представляет собой, в общем, плоскую прямоугольную часть 24, соединенную с каналом 20 вдоль изогнутого продольного прохода 25, проходящего между ними. Изогнутый продольный проход 25 содержит широкую верхнюю часть воронкообразной формы, которая проходит практически до поперечной стенки 24С микрокамеры, расположенной напротив прохода. Передний конец канала 20, находящийся дальше всего от входного отверстия 12А, связанного с основной камерой, расположен на некотором удалении от оконечности микрокамеры на расстоянии, по меньшей мере, 0,5 мм. Это составляет пространство для, по меньшей мере, пяти эмбрионов человека со средним диаметром 0,1 мм на этом этапе развития и приблизительно для четырех эмбрионов коровы со средним диаметром 0,12 мм на том же этапе развития.
Передний конец канала 20 частично сформирован частью круглой (приблизительно на 270°) полочки 13В, образованной на поперечной стенке и на боковых стенках микрокамеры (см. фиг.10). Передняя часть канала 20 предпочтительно выполнена с обеспечением входа кончика катетера 120 извлечения, как показано на фиг.13, такого как катетер Фридмана или Уолисса, широко используемых для переноса эмбрионов в IFC и ИВК или некоторые другие катетеры извлечения и переноса эмбриона или подобные устройства.
Очевидно, что внутренняя поверхность основной камеры 12 и микрокамеры 13 выполнены гладкими и закругленными со всех сторон, чтобы исключались любые шероховатости поверхности или острые кромки, которые могли бы повредить гаметы или эмбрионы.
В задней секции 19 основной камеры 12, на другом конце от микрокамеры 13, расположена первая цилиндрическая часть 16 с овальным поперечным сечением, которая выполнена с возможностью взаимодействия с соответствующей овальной частью 32 фланца элемента 30 клапана, как описано ниже. Вторая цилиндрическая секция 17 с большим диаметром, чем длина главной оси овальной части, проходит от заднего открытого конца 17А до первой цилиндрической секции 16. Посредине вдоль части боковой стенки, определяющей цилиндрическую секцию 17, сформирована пара расположенных диаметрально друг напротив друга и проходящих по окружности направляющих 18А и 18В, частично имеющих кольцевую форму (располагаясь приблизительно на дуге 90°), выполненных с увеличенными вдоль оси оконечностями 19А, 19В щелей. Направляющие и оконечности щелей взаимодействуют с фиксаторами 54А, 54В, сформированными на рабочем элементе 50 и описанными ниже.
Элемент 30 клапана предпочтительно изготовлен из биосовместимого, деформируемого пластического или другого синтетического материала и предпочтительно из силикона с высокой степенью чистоты. Материал, из которого он сформирован, должен быть мягким в такой степени, чтобы самогерметизирующееся отверстие доступа, которое сформировано в нем, могло герметично закрывать основную камеру корпуса контейнера. Элемент 30 клапана содержит проходящую от переднего конца до заднего конца в плоскости осевого сечения коническую юбку 35, овальный фланец 32, выступающий по радиусу наружу, за пределы конической юбки и взаимодополняющий по поперечному сечению овальную цилиндрическую секцию 16 корпуса контейнера, таким образом, что он входит в нее при открытом положении элемента клапана. Позади от фланца 32 расположена цилиндрическая промежуточная часть 31, содержащая пару выступающих в радиальном направлении и проходящих продольно выступов 31А, 31В, расположенных диаметрально напротив друг друга и позади них на заднем конце элемента клапана, пару частично цилиндрических ушек 33А и 33В, обращенных друг к другу и проходящих вдоль дуги окружности приблизительно на 110°.
Внутри элемента 30 клапана от его переднего конца до заднего конца выполнен непрерывный проход, формирующий отверстие доступа к основной камере и включающий расходящуюся по направлению вперед секцию 36 в форме усеченного конуса с эллиптическим поперечным сечением, соединенную со слегка сходящейся вперед промежуточной секцией 37, также с эллиптическим поперечным сечением, после чего следует сильнее сходящаяся вперед задняя секция 38, также эллиптического поперечного сечения. Следует отметить, что главные оси эллиптических поперечных сечений прохода через элемент клапана расположены, по существу, ортогонально к главной оси овального или эллиптического фланца 32.
Рабочий элемент 50 клапана предпочтительно выполнен из относительно жесткого полиэтилена такого, как полиэтилен высокой плотности, полиэтилен низкой плотности или их сополимера высокой плотности, или из гомополимера полипропилена. Рабочий элемент 50 формирует колпачок для корпуса контейнера и содержит боковые стенки, проходящие от переднего конца к заднему концу и включают переднюю секцию 53 и заднюю секцию 55. Передняя и задняя секции имеют, по существу, цилиндрическую форму с незначительным расширением спереди и, в общем, круглым поперечным сечением. Передняя секция 53 содержит расположенные диаметрально напротив друг друга вырезы 53А и 53В, проходящие продольно от передней кромки назад. Каждый из расположенных диаметрально напротив друг друга вырезов 53А, 53В имеет прямую секцию с параллельными продольными сторонами и закругленный задний конец. Конфигурация вырезов взаимно дополняет внешний контур выступов 31А и 31В так, что они плотно входят в них.
Расположенные диаметрально друг напротив друга, проходящие вдоль окружности фиксаторы 54А, 54В установлены посередине вдоль передней секции 53 элемента 50 включения на некотором расстоянии от вырезов 53А, 53В так, что их соответствующие средние точки разнесены приблизительно на 90°. Фиксаторы 54А, 54В выполнены с возможностью соответствующей установки в направляющие 18А, 18В в задней секции 19 корпуса 10 контейнера.
Задняя секция 55 рабочего элемента 50 включения содержит пару расположенных диаметрально напротив друг друга вогнутых частей 58А, 58В стенки, предназначенных для захвата пальцами оператора, которые расположены поочередно с выпуклыми частями 59А, 59В стенки, гладко сопряженными с передней секцией рабочего 53 элемента включения. Элемент включения содержит частично кольцевую заднюю конечную стенку 56, которая проходит между задними кромками вогнутых и выпуклых частей 58А, 58В, 59А, 59В стенок и центральным отверстием 56А. Внутренняя окружность задней конечной стенки 56 соединена с суживающейся по направлению вперед внутренней муфтой 57, отделенной по радиусу от боковых стенок задней секции 55 рабочего элемента 50 так, что между ними устанавливаются имеющие взаимодополняющую форму ушки 33А, 33В элемента 30 клапана.
Предпочтительно для упрощения сборки элемент 30 клапана первоначально устанавливают в рабочий элемент 50 так, что ушки 33А, 33В входят в заднюю секцию колпачка между внутренней муфтой 57 и боковыми стенками задней секции 55 элемента включения и выступами 31А, 31В, установленными в вырезы 53А, 53В. После того как будет сформирован подузел 2 рабочего элемента 50 и элемента 30 клапана, переднюю секцию 53 колпачка проталкивают по направлению оси внутрь задней цилиндрической секции 17 корпуса контейнера, пока фиксаторы 54А, 54В не защелкнутся в направляющих 18А, 18В. Собранный таким образом рабочий элемент 50 может быть повернут по часовой стрелке или по направлению против часовой стрелки в стабильное положение покоя, в котором фиксаторы устанавливаются в увеличенные части 19А и 19В направляющих и где короткие продольные плечи предотвращают непреднамеренный поворот рабочего элемента из стабильного положения покоя. Стабильные положения покоя соответствуют открытому и закрытому положению элемента клапана.
Когда рабочий элемент 50 поворачивают на 90° из открытого положения в закрытое положение, овальный фланец 32 деформируется из-за несовпадения с ориентацией овальной цилиндрической части 16 корпуса контейнера, деформируя, таким образом, промежуточную часть элемента 30 клапана, как показано на фиг.6, переводя стенки эллиптической промежуточной секции 37 из положения, показанного на фиг.8А, в сплющенный состыкованный контакт, как показано на фиг.8В, закрывая, таким образом, проход элемента 35 клапана и герметизируя отверстие доступа к основной камере и закрывая связь между основной камерой 12 корпуса контейнера и окружающей средой.
Ниже будет описана работа контейнера ИВК, в соответствии с настоящим изобретением. Вначале собирают контейнер и открывают элемент 32, как показано на фиг.4А. На этом этапе вводят среду культивирования в основную камеру и микрокамеру с помощью стандартной пипетки 112, как показано на фиг.4В. Внутренняя муфта 57, выполненная в форме усеченного конуса, взаимодействует с конической стенкой пипетки так, что в полностью введенном положении выходное отверстие пипетки находится внутри основной камеры и, как показано, ниже переднего конца юбки 35 элемента клапана. Основную камеру и микрокамеру заполняют до уровня секции 36 в форме усеченного конуса и на практике непосредственно ниже его задней части. Среда культивирования по выбору представляет собой среду INRA Menoza B2 Medium, которая поставляется компанией Laboratoire C.C.D., г. Париж. После этого вводят ооциты и сперму с помощью катетера или пипетки. Обычно предпочтительно используют от 60 000 до 300 000 подвижных сперматозоидов и более конкретно 100 000 подвижных сперматозоидов и от 1 до 5 ооцитов. Однако в некоторых случаях, при плохом качестве спермы, может использоваться более чем 300 000 и до 500 000 подвижных сперматозоидов.
Сперма может быть введена перед или после ооцитов или даже одновременно с ними. Обычно предпочтительно вводить сперму перед или одновременно с ооцитами.
На каждом этапе процедуры заполнения элемент клапана может быть закрыт. Таким образом, при использовании катетера элемент клапана может, по существу, закрываться вокруг катетера, не создавая помеху потоку ооцитов и/или спермы. Закрывание элемента клапана, конечно, обеспечивает минимальный контакт между окружающим воздухом и камерами контейнера.
Перед интравагинальной инкубацией закрытый контейнер ИВК предпочтительно подогревают в течение приблизительно одного часа в инкубаторе, с рабочей температурой 37°С. Во время инкубации контейнер предпочтительно не заключают в капсулу.
Для предотвращения загрязнения содержимого контейнера, во время интравагинального размещения и для предотвращения повреждений во время введения, удаления и нахождения контейнера 1 внутри вагины его заключают в оболочку, после предварительного нагрева в инкубаторе, выполненную в виде капсулы из мягкого гладкого биосовместимого материала, такого как силикон. Предпочтительно капсула содержит переднюю и заднюю части 70 и 60 капсулы, которые показаны на фиг.5А и 5В, которые выполнены с возможностью установки на соответствующие концы контейнера 1, как показано на фиг.6. Если требуется, такие отдельные части капсулы могут быть соединены вместе, например, с помощью предпочтительно растягивающегося продольного ремешка или подобного устройства, которое не показано.
Передняя часть 70 капсулы содержит, в общем, цилиндрическую боковую стенку 71 с небольшим расширением назад и закругленной оконечной стенкой 75. Передняя часть 70 капсулы имеет внутреннюю стенку, определяющую основное отделение 73, которое выполнено соответствующим по форме части внешней боковой стенки 11, определяющей основную камеру и, в общем, плоское прямоугольное микроотделение 74, имеющее круглую стенку, расположенную в самой передней части, причем микроотделение сформировано в закрытом утолщенном конце части 70 капсулы, и выполнена взаимодополняющим по конфигурации с внешними стенками микрокамеры 11. Передняя часть 70 капсулы может надеваться или накатываться на корпус 11 контейнера от конца микрокамеры по направлению назад к открытому концу корпуса контейнера. Когда передняя часть 70 капсулы будет полностью установлена на корпусе контейнера, свободная кромка боковой стенки 71 капсулы будет слегка перекрывать переднюю часть суживающейся по направлению вперед части, выполненной в форме усеченного конуса, взаимно соединяющей цилиндрическую боковую стенку 11 и заднюю секцию 19 корпуса контейнера (см. фиг.7).
Задняя часть 60 капсулы также содержит, по существу, цилиндрическую боковую стенку 61, проходящую между открытым передним концом 69 и закрытым задним концом 67. Задняя часть 60 капсулы содержит внутреннюю стенку 63, определяющую расширяющееся вперед отделение 64, которое, в общем, имеет взаимодополняющую форму с рабочим элементом 50. Задняя стенка 67 содержит сужающуюся по направлению вперед пробку 66, выполненную так, что она плотно входит в коническую внутреннюю муфту 57 круглого поперечного сечения рабочего элемента. Внутренняя поверхность задней стенки 67 может оставаться отделенной на некотором расстоянии от конечной стенки 56 рабочего элемента в полностью введенном положении, которое показано на чертеже. Второй ряд герметизации сформирован между пробкой и внутренней муфтой колпачка. Боковая стенка 61 задней части 60 капсулы выполнена так, что она проходит через заднюю секцию 19 корпуса контейнера за пределы прилегающей, соединительной зоны боковой стенки, выполненной в форме усеченного конуса, и поверх части свободной кромки передней капсулы 70, благодаря чему формируется полная оболочка контейнера, как показано на фиг.7.
К задней стенке 67 задней части 60 капсулы прикреплена и сформирована как единая деталь проходящая назад U-образная петля 68, имеющая расположенные друг напротив друга продольные ножки и закругленный захват или промежуточную часть, соединяющую ножки на дальних от задней стенки 67 концах. Основное назначение петли 68 состоит в формировании деформируемого по оси средства амортизации, адаптирующего эффективную длину узла ИВК к хордальной длине индивидуального заднего свода. Когда задний свод имеет малые размеры, что часто случается до рождения первого ребенка, деформируемая петля сплющивается по отношению к задней стенке 67 так, что она проходит поперечно к оси узла. Петля выполнена из достаточно мягкого и гибкого материала так, чтобы получаемое сжатие не создавало ощущения дискомфорта. В случае заднего свода с большими размерами деформируемая петля 68 будет изгибаться незначительно, принимая более или менее изогнутую U-образную форму, при этом петля обеспечивает плотное удержание узла ИВК, по существу, устраняя нежелательное смещение или выпадание контейнера ИВК из области заднего свода. С учетом анатомии человека длина узла с петлей в вытянутом положении составляет приблизительно от 7,5 до 9 см, а с петлей, сплющенной по отношению к задней стенке 67, приблизительно от 6 до 6,5 см. При использовании для коров или других крупных млекопитающих общая длина узла с петлей в вытянутом положении составляет от приблизительно 10 до 15 см и предпочтительно приблизительно 12 см. При этом можно получить увеличенную длину путем простого частичного вытягивания задней и передней частей капсулы в положение, показанное на фиг.6, благодаря чему можно использовать контейнер ИВК с одним размером как для человека, так и для других млекопитающих. Следует отметить, что в положении, представленном на фиг.6, промежуточная часть боковых стенок корпуса контейнера оказывается открытой. Для того чтобы закрыть эту открытую часть, можно установить широкую эластичную ленту над частями свободных кромок передней и задней частей капсулы.
Узел ИВК может быть установлен в области заднего свода так, чтобы петля 68 была ориентирована по направлению вперед. В этом случае петля 68 может представлять собой удобное дополнение для закрепления тонкой пластиковой связи или нити с узлом контейнера ИВК. В качестве альтернативы, как показано на чертежах, тонкую пластиковую связь или нить закрепляют в кольцевой выемке 62 на боковой стенке 61 задней части капсулы, вблизи к ее открытому концу. Пластиковая связь 69А, затянутая вокруг выемки 62, таким образом, прижимает и деформирует свободную кромку задней части секции к части свободной кромки передней секции и, таким образом, улучшает герметизацию капсулы. Свисающая нить 69А в таком положении используется для облегчения удаления узла контейнера ИВК из области заднего свода (Следует отметить, что при использовании трубки Nunc удаление выполняется врачом, которому требуется для этого использовать расширитель).
Нормальный период нахождения узла ИВК в вагине составляет от 48 до 72 часов. Узел может быть удален пользователем или врачом из области заднего свода путем вытягивания за связующую нить 69А с последующим удалением узла из влагалища. После этого части 60 и 70 капсулы снимают или скатывают с контейнера 1.
Затем может быть проведено исследование развившегося эмбриона или эмбрионов. С этой целью контейнер вначале ориентируют, как показано на фиг.4А, при закрытом элементе клапана. Это позволяет эмбрионам, всплывшим в среде культивирования, упасть или осесть в микрокамеру под действием силы гравитации. Затем контейнер ориентируют таким образом, чтобы продольная ось была, по существу, горизонтальной и плоская часть 24 микрокамеры находилась ниже канала 22 так, чтобы все эмбрионы собрались в этой части. После этого контейнер поворачивают на 90° так, чтобы стенки 24А и 24В микрокамеры установились горизонтально, и затем их выравнивают (под углом 90°) с оптической осью лабораторного микроскопа (не показан).
После исследования эмбрионов и принятия решения в отношении того, который из них будет имплантирован, в контейнер вводят катетер 120 так, чтобы его кончик вошел в канал, выбранный эмбрион или эмбрионы затем извлекают в катетер и переносят в маточную полость для имплантации в соответствии со стандартными процедурами. Предпочтительно извлечение производят под микроскопом, устанавливая отверстие катетера непосредственно вблизи к извлекаемому ооциту (ооцитам), например, путем наклона контейнера. В ходе извлечения эмбриона элемент клапана может быть закрыт вокруг катетера для ограничения поступления воздуха в содержимое контейнера. Благодаря мягкости материала элемента клапана, в данном случае силикона, отверстие доступа может быть, по существу, герметизировано так, что оно не мешает извлечению эмбриона.
На фиг.14 показан контейнер с элементом клапана в открытом положении так, что формируется отверстие для доступа внутрь корпуса 10 контейнера. Катетер 120 Фридмана или Уоллиса вводят через отверстие доступа, и его конец или кончик 121 входит в канал 20. Проход кончика катетера в канал ограничивается полочкой 13В на его самом переднем конце, в которую упирается кончик катетера при полной его установке. Между полочкой и передней конечной стенкой микрокамеры остается достаточное расстояние (приблизительно 0,5 мм) для того, чтобы в нем поместилось приблизительно пять эмбрионов человека, один поверх другого, без какого-либо риска повреждения их кончиком катетера. Сужающаяся вперед зона соединения или проход 25 между каналом и плоской прямоугольной частью 24 микрокамеры 13 обеспечивает то, что кончик катетера будет направляться в канал, в его самый передний конец, не создавая каких-либо затруднений для врача.
Непосредственно перед вводом катетера контейнер ориентируют так, чтобы его ось, в общем, была расположена горизонтально, чтобы канал находился над плоской прямоугольной частью 24 микрокамеры 13 так, чтобы эмбрионы, которые собрались в канале, могли перемещаться в плоскую часть 24 микрокамеры под действием силы гравитации для предотвращения зажима эмбрионов между катетером и полочкой 13В.
Контейнер затем может быть установлен в вертикальном или горизонтальном положении. После того как кончик 121 катетера будет установлен в требуемом положении по отношению к микрокамере, с помощью катетера можно извлечь эмбрионы из плоской части 24 микрокамеры через отверстие отбора катетера. Загруженный катетер можно затем немедленно использовать для переноса эмбриона или эмбрионов в матку для имплантации.
Показанный на фиг.11-12 модифицированный вариант воплощения узкого прохода 12'А доступа, сформированного парами параллельных кромок и вогнутыми кромками между основной камерой 12 и микрокамерой 24, также предотвращает любое значительное проникновение кончика катетера в микрокамеру, поскольку кончик имеет больший диаметр, чем узкий поперечный размер прохода доступа. В этом варианте воплощения кончик катетера можно свободно передвигать назад и вперед вдоль прохода доступа в ходе извлечения эмбриона. В качестве альтернативы кончик катетера может упираться в вогнутую полочку узкого прохода доступа для установки его в относительно стабильном положении при выполнении этого этапа.
Вместо катетера для извлечения эмбрионов из микрокамеры может использоваться пипетка стандартной конфигурации. Пипетка может иметь конический кончик, выполненный с возможностью установки в канале устройств в соответствии с вариантами воплощения, изображенными на фиг.1-10.
В соответствии с этим с момента, когда гаметы были введены в среду культивирования, находящуюся в корпусе контейнера, до момента извлечения эмбрионов для переноса их в матку, эти гаметы или эмбрионы никогда не находятся в контакте с воздухом и окружающей средой. Благодаря использованию описанного изобретения становится возможным проводить микроскопическое исследование эмбрионов, без удаления их из контейнера ИВК, предотвращая контакт с окружающей средой, а также просматривать их во время установки по отношению к отверстию катетера или пипетки, в частности путем наклона контейнера. Предполагается также, что в ходе всей процедуры оплодотворения и культивирования содержание контейнера ИВК будет защищено от загрязнения с помощью самогерметизирующегося средства укупорки, сформированного элементом клапана, и второго ряда герметизации, сформированного пробкой на задней части капсулы, плотно установленной в коническую внутреннюю муфту колпачка. Дополнительный уровень защиты обеспечивается самой капсулой благодаря тому, что она полностью окружает закрытый и герметизированный контейнер и формирует асептический барьер, предотвращающий проникновение бактерий и вирусов, находящихся в вагинальной полости, таким образом, уменьшая риск загрязнения эмбрионов при открывании контейнера и извлечении эмбрионов для переноса. Следует также понимать, что благодаря узкому эллиптическому отверстию доступа, проходящему через элемент клапана в открытом или в частично открытом положении, при вводе гамет или извлечении эмбрионов, практически устраняется контакт с окружающим воздухом.
В закрытом положении элемента клапана расширяющаяся по направлению вперед передняя секция 36 прохода и прилегающая кольцевая кромка юбки 35 определяют задний конец основной камеры. При этом следует понимать, что такая конфигурация не позволяет ооцитам поступать обратно в промежуточную секцию прохода элемента клапана, где в противном случае они могли бы неизбежно быть захвачены внутри состыковываемых стенок прохода элемента клапана или даже раздавлены и в любом случае оказались бы вне контакта со средой культивирования и спермой. Кроме того, когда элемент клапана открыт или частично открыт, катетер частично заполняет отверстие доступа.
Другие самогерметизирующиеся средства укупорки и, в частности, конструкции клапана могут использоваться в настоящем контейнере ИВК. В соответствии с предпочтительным вариантом воплощения самогерметизирующееся устройство укупорки, изображенное на фигурах 14 и 15, силиконовую пробку 30А с осевым отверстием и полостью центрального элемента клапана устанавливают в задней конечной секции 17А корпуса контейнера, аналогично второй секции 17, без использования какой-либо сформированной по окружности щели и без первой цилиндрической секции 16. Силиконовая пробка 30А цилиндрической конфигурации и с круглым поперечным сечением содержит переднюю и заднюю секции 37А прохода, проходящие, в общем, вдоль оси для обеспечения доступа в основную камеру и/или микрокамеру, когда элемент 30А клапана находится в открытом положении (см. фиг.14). Элемент клапана упирается в боковые стенки задней конечной секции 17А корпуса контейнера с обеспечением возможности вращательного движения вокруг поперечной оси, расположенной ортогонально к оси корпуса контейнера, между открытым положением (фиг.14), в котором проход 30В через элемент 30А клапана совмещается с секциями 37А, 37В прохода через пробку, и закрытым положением (фиг.15), в котором с помощью элемента 30А клапана связь между секциями с совмещенным проходом в пробке перекрывается, при этом секция прохода в элементе клапана располагается под прямым углом к секциям в пробке. В конце вращения в боковых стенках корпуса контейнера дискообразные рабочие элементы 30А, 30D (которые могут быть выполнены со шлицом для отвертки) доступны для пальцев врача, который нажимает на рабочие элементы и поворачивает элемент клапана, преодолевая трение между, в том числе, элементом клапана и прижимаемой к нему полостью в пробке, в которой установлен элемент клапана. В таком варианте воплощения, относительно жесткий элемент клапана входит в относительно мягкую силиконовую пробку 30А и используется для открывания и закрывания доступа к камерам контейнера, в отличие от описанного варианта воплощения, в котором используется эластично деформируемый элемент клапана для закрывания прохода путем вращения относительно жесткого рабочего элемента вокруг оси контейнера.
В качестве альтернативы элемент клапана и полость в пробке могут иметь форму овоида (не показана), главная ось которого расположена ортогонально к оси контейнера. Для любого из этих вариантов воплощения взаимодействующее средство упора (не показано) на секции заднего контейнера и самогерметизирующийся жесткий элемент клапана будут определять диапазон углового смещения элемента клапана, который ограничен приблизительно 90°.
Следует понимать, что эти и другие модификации и варианты контейнера и узла контейнера могут быть изменены без отхода от объема и сущности настоящего изобретения, определяемых прилагаемой формулой изобретения.
1. Контейнер для оплодотворения и культивирования, содержащий корпус контейнера, имеющий отверстие для ввода среды культивирования, одного или нескольких ооцитов и спермы с последующим извлечением эмбриона или эмбрионов с помощью катетера извлечения, самогерметизирующееся средство укупорки, предназначенное для избирательного открывания и закрывания отверстия корпуса контейнера, причем указанный корпус контейнера содержит основную камеру для помещения в нее среды культивирования, ооцитов и спермы, и микрокамеру, предназначенную для сбора и последующего извлечения одного или нескольких эмбрионов, корпус контейнера содержит средство, предназначенное для ограничения доступа катетера или пипетки извлечения к указанной микрокамере, и микрокамера соединена с основной камерой.
2. Контейнер для оплодотворения и культивирования по п.1, отличающийся тем, что средство для ограничения доступа катетера или пипетки извлечения сформировано входным проходом микрокамеры через основную камеру с обеспечением ограничения проникновения в микрокамеру.
3. Контейнер для оплодотворения и культивирования по п.1 или 2, отличающийся тем, что средство для ограничения доступа катетера определено каналом, проходящим от основной камеры в микрокамеру и который имеет взаимодополняющую конфигурацию с конечной частью катетера или пипетки извлечения для установки кончика катетера или пипетки на некотором расстоянии от передней конечной стенки микрокамеры в полностью установленном положении катетера или пипетки в корпусе контейнера.
4. Контейнер для оплодотворения и культивирования по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что, по меньшей мере, часть боковой стенки корпуса контейнера, определяющего указанную микрокамеру, выполнена прозрачной с оптическим качеством для обеспечения возможности микроскопического исследования эмбрионов.
5. Контейнер для оплодотворения и культивирования по п.3 или 4, отличающийся тем, что корпус контейнера содержит расположенные друг напротив друга параллельные прозрачные боковые стенки оптического качества, проходящие в поперечном направлении от указанного канала.
6. Контейнер для оплодотворения и культивирования по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что объем микрокамеры выбирают меньше, чем приблизительно 100 мкл.
7. Контейнер для оплодотворения и культивирования по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что объем микрокамеры выбирают от приблизительно 25 до приблизительно 70 мкл.
8. Контейнер для оплодотворения и культивирования по одному из пп.3 - 7, отличающийся тем, что ширина микрокамеры, измеренная между расположенными друг напротив друга параллельными боковыми стенками, составляет от приблизительно 0,3 до приблизительно 0,8 мм.
9. Контейнер для оплодотворения и культивирования по п.8, отличающийся тем, что средний диаметр передней части канала катетера составляет от приблизительно 2 до приблизительно 3 мм.
10. Контейнер для оплодотворения и культивирования по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что отверстие в контейнере включает средство для установки конца катетера или пипетки по отношению к основной камере для введения ооцитов или спермы спереди от самогерметизирующегося средства укупорки.
11. Контейнер для оплодотворения и культивирования по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что предназначен для интравагинального использования, дополнительно содержит мягкую эластичную капсулу, предназначенную для формирования оболочки контейнера, включающую, по меньшей мере, две части, выполненные с возможностью надевания на контейнер с его противоположных концов, причем указанные части капсулы содержат части свободной кромки, которые перекрываются для герметизации капсулы.
12. Контейнер для оплодотворения и культивирования по п.11, отличающийся тем, что вблизи к одному из концов указанной капсулы расположено деформируемое средство амортизации, предназначенное для адаптации продольных размеров узла к хордальному размеру заднего свода, когда контейнер установлен в его области.
13. Контейнер для оплодотворения и культивирования по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что зона свободного доступа определена между основной камерой и микрокамерой для прохода среды культивирования, через которую после оплодотворения проходят один или несколько эмбрионов, плавающих в среде культивирования.
14. Контейнер для оплодотворения и культивирования ооцитов и извлечения эмбрионов по одному из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что дополнительно содержит в комбинации с ним средство для извлечения из микрокамеры одного или нескольких эмбрионов, находящихся в указанной среде культивирования, причем указанная микрокамера содержит одну или несколько прозрачных зон для наблюдения за одним или несколькими эмбрионами, находящимися в ней перед и/или во время извлечения.
15. Способ оплодотворения и культивирования, содержащий следующие этапы: подготовка контейнера для оплодотворения и культивирования, имеющего отверстие и основную камеру для оплодотворения и культивирования, а также микрокамеру для исследования и извлечения одного или нескольких эмбрионов и самогерметизирующееся средство укупорки, предназначенное для избирательного открытия и закрытия отверстия; заполнение контейнера средой культивирования и ввода одного или нескольких ооцитов и спермы в среду культивирования, и после этого закрывания отверстия; инкубирование закрытого контейнера для осуществления оплодотворения и культивирования ооцитов; создание условий для миграции получаемого эмбриона или эмбрионов в микрокамеру и извлечение одного или нескольких эмбрионов из микрокамеры с помощью катетера или пипетки.
16. Способ оплодотворения и культивирования по п.15, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап микроскопического исследования эмбриона или эмбрионов в микрокамере перед и/или в ходе извлечения.
17. Способ оплодотворения и культивирования по п.15 или 16, отличающийся тем, что перемещение получаемого эмбриона или эмбрионов осуществляется с помощью ориентирования контейнера таким образом, чтобы микрокамера была расположена ниже основной камеры.
18. Способ оплодотворения и культивирования по пп.15, 16 или 17, отличающийся тем, что для интравагинального использования дополнительно содержит этап заключения контейнера в оболочку в виде мягкой гибкой капсулы перед инкубацией во влагалище.
19. Способ оплодотворения и культивирования по п.15, 16, 17 или 18, отличающийся тем, что для интравагинального использования дополнительно содержит этап прикрепления нити к капсуле для облегчения извлечения контейнера из области заднего свода.
20. Способ оплодотворения и культивирования по п.16, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап ограничения доступа катетера или пипетки в микрокамеру и ориентирования контейнера таким образом, чтобы основная камера была расположена над микрокамерой перед извлечением с помощью катетера или пипетки.
21. Способ оплодотворения и культивирования по одному из пп.15 - 20, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап ограничения проникновения свободного конца катетера или пипетки в канале микрокамеры или вблизи к нему так, чтобы между свободным концом катетера и передней конечной стенкой микрокамеры помещалось, по меньшей мере, пять эмбрионов.
22. Способ оплодотворения и культивирования по п.15, отличающийся тем, что для интравагинального использования дополнительно содержит этап формирования в контейнере прохода доступа вверх по потоку от средства самогерметизирующейся укупорки и герметичного закрывания прохода доступа путем помещения контейнера в капсулу.
