Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии и может быть использовано для ускоренного определения лекарственной устойчивости МБТ, выделенных из клинического материала при диагностике туберкулеза. Среда содержит калий дигидроортофосфат, динатрий фосфат обезвоженный, магний серно-кислый, железо лимонно-аммиачное, натрий лимонно-кислый, глицерин, натрий-L-глутаминовокислый кислый, тиамин бромид, марганец -(II)- серно-кислый, дистиллированную воду, нормальную лошадиную сыворотку и один из противотуберкулезных препаратов: рифампицин, стрептомицин, изониазид, этамбутол. Изобретение обеспечивает повышение ростовых свойств среды и облегчение визуального учета результатов при определении лекарственной устойчивости МБТ. 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и может быть использовано для ускоренного определения лекарственной устойчивости культур микобактерий туберкулеза (МБТ), выделенных от больных.

В начале XXI века туберкулез остается важной национальной и международной проблемой. В последнее десятилетие наблюдается повсеместное повышение показателей заболеваемости и появление остропрогрессирующих форм туберкулеза (2).

Известно использование для ускоренного определения лекарственной устойчивости МБТ жидких сред: Сотона, модификации среды Сотона с использованием мясокостного фарша тюленя, вместо бычьей сыворотки - сыворотки тюленя (1, 4, 5).

Недостатком этих сред является низкая чувствительность и использование дефицитных ингредиентов, а отсутствие коммерческого выпуска ограничивает их применение в практике фтизиобактериологии.

Наиболее близким решением технической задачи данного назначения к заявляемому изобретению по совокупности признаков является среда Сотона (4), содержащая в качестве источника азотистого питания аспарагин, калий фосфорно-кислый двузамещенный, магний серно-кислый, лимонную кислоту, лимонно-аммиачное железо, глицерин, дистиллированную воду. рН среды необходимо доводить до 7,2-7,3 раствором аммиака.

Для определения лекарственной чувствительности в качестве противотуберкулезных препаратов используется рифампицин или стрептомицин, или изониазид, или этамбутол.

Задача предлагаемого изобретения - повышение ростовых свойств среды и улучшение визуального учета результатов при определении лекарственной устойчивости МБТ.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что предлагаемая среда содержит магний сернокислый, глицерин, источник калия и фосфора, дистиллированную воду и один из противотуберкулезных препаратов: рифампицин, или стрептомицин, или изониазид, или этамбутол, дополнительно содержит нормальную лошадиную сыворотку, являющуюся адсорбентом продуктов метаболизма и источником ростовых факторов, в качестве источника азотистого питания - натрий-L-глутаминовокислый кислый, в качестве ростового фактора - тиамин бромид, в качестве вещества, действующего на МБТ как витамин - марганец (II) серно-кислый, с целью улучшения роста вирулентных штаммов и синтетических процессов в культурах МБТ использован натрий лимонно-кислый трехзамещенный, для корректировки рН среды использован динатрий фосфат, а в качестве источника калия и фосфора - калий дигидроортофосфат при следующем соотношении, г/л:

Натрий-L-глутаминовокислый кислый - 18,0-22,0

Калий дигидроортофосфат - 0,9-1,1

Динатрий фосфат обезвоженный - 4,4-4,6

Магний серно-кислый - 0,01-0,03

Железо лимонно-аммиачное - 0,01-0,03

Натрий лимонно-кислый трехзамещенный - 1,2-1,8

Марганец (II) серно-кислый - 0,004-0,006

Тиамин бромид - 0,001-0,003

Глицерин - 55,0-65,0

Вода дистиллированная - до 1 л

Нормальная лошадиная сыворотка - 80,0-120,0 мл

Один из противотуберкулезных препаратов:

рифампицин - 0,002

или стрептомицин - 0,005

или изониазид - 0,001

или этамбутол - 0,002

При конструировании питательных сред для определения резистентности бактерий к химиопрепаратам необходимо иметь в виду, что она должна быть оптимальной для роста тех микроорганизмов, в данном случае культур МБТ, которые подлежат тестированию. Кроме того, питательная среда должна обеспечивать диффузию и активность препарата - с одной стороны, а также проявление генетических свойств бактериальной клетки - с другой (6).

Учитывая вышеизложенное, нами разработана среда, содержащая натрий-L-глутаминовокислый кислый, имеющий значение в азотистом питании МБТ в сочетании с ростстимулирующими веществами - тиамином бромидом, серно-кислым марганцем и минеральными солями, которые создают оптимальные условия для роста МБТ, что облегчает учет результатов лекарственной устойчивости (по наличию розового осадка) культур МБТ, выделенных от больных, ускоренным методом (через 7 суток), не дожидаясь данных, которые будут получены методом абсолютных концентраций через 3-4 недели.

Среду получают следующим образом.

Пример 1. В 945 мл дистиллированной воды, содержащей 55 г глицерина, растворяют 18,0 г натрия-L-глутаминовокислого кислого, 0,9 г калия дигидроортофосфата, 4,4 г динатрия фосфата обезвоженного, 0,01 г магния серно-кислого, 0,01 железа лимонно-аммиачного, 1,2 г натрия лимонно-кислого трехзамещенного, 0,004 г марганца (II) серно-кислого, 0,001 г тиамина бромида, кипятят в течение 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в стерильные пробирки по 2 мл, стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 20 мин.

В охлажденные до комнатной температуры пробирки со средой перед использованием вносили по 0,16 мл (соответственно 80,0 мл/л) нормальной лошадиной сыворотки и 0,1 мл раствора одного из противотуберкулезных препаратов, чтобы конечная концентрация их соответствовала стандартным критериям резистентности МВТ: изониазид - 0,001 г, рифампицин - 0,002 г, стрептомицин - 0,005 г, этамбутол - 0,002 г.

В пробирки со средой засевали по 0,1 мл взвесей культур МБТ с концентрацией микробов 2 мг/мл. Инкубировали посевы в термостате при температуре 37°С в течение 7 суток. После окончания инкубации в пробирки вносили по 0,1 мл 2-процентного раствора 2, 3, 5-трифенилтетразолия хлористого в среде Сотона. Учет результатов проводили через 3, 6, 24 часа. Лекарственноустойчивые штаммы образуют осадок розового цвета из-за того, что нормальные живые клетки МБТ восстанавливают 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид с образованием красного пигмента формазана. Чувствительные штаммы не вызывают изменения цвета среды.

Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что в 940 мл дистиллированной воды, содержащей 60 г глицерина, растворяют 20,0 г натрия-L-глутаминовокислого кислого, 1,0 г калия дигидроортофосфата, 4,5 г динатрия фосфата обезвоженного, 0,02 г магния серно-кислого, 0,02 г железа лимонно-аммиачного, 1,5 г натрия лимонно-кислого трехзамещенного, 0,005 г марганца (II) серно-кислого, 0,002 г тиамина бромида. В пробирки со средой вносят по 0,2 мл (соответственно 100 мл/л) нормальной лошадиной сыворотки. Далее согласно примеру 1.

Пример 3. Отличается от примеров 1, 2 тем, что в 935 мл дистиллированной воды, содержащей 65,0 г глицерина, растворяют 22,0 г натрия-L-глутаминовокислого кислого, 1,1 г калия дигидроортофосфата, 4,6 г динатрия фосфата обезвоженного, 0,03 г магния серно-кислого, 0,03 г железа лимонно-аммиачного, 1,8 г натрия лимонно-кислого трехзамещенного, 0,006 г марганца (II) серно-кислого, 0,003 г тиамина бромида. В пробирки со средой вносят по 0,24 мл (соответственно 120 мл/л) нормальной лошадиной сыворотки. Далее согласно примеру 1,2.

Результаты бактериологического контроля предлагаемой и известной сред представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что предлагаемая среда имеет преимущество, так как чувствительность ее по росту большинства культур составляет 10^-4 разведение, а известной 10^-3.

Результаты определения лекарственной устойчивости свежевыделенных культур МБТ от больных туберкулезом легких ускоренным методом в предлагаемой и известной средах представлены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что лекарственноустойчивые штаммы образуют более обильный осадок розового цвета (на ++ и +++) на предлагаемой среде, чем на известной (на + и ++), что облегчает учет результатов.

Библиографические данные

1. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М., “Медицина”, 1973 г.

2. Косарева М.В., Голышевская В.И., Овсянкина Е.С. и др. Микробиологическое исследование крови в диагностике туберкулеза у подростков. Научно-практический журнал “Проблемы туберкулеза”, №1, 2002 г.

3. Матвеев К.И., Соколов М.И. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней. Изд. “Медицина”, М., 1964 г.

4. Методические рекомендации “Современные методы лабораторной диагностики туберкулеза”, М., 1992 г.

5. Приказ №558 от 8 июня 1978 г. “Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе”, М., 1978 г.

6. Reissbrodt R., Witte W., Rische H. Новая полудефинированная питательная среда для тестирования чувствительности бактерий. Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии, 27, 1983 г., №4.

Питательная среда для ускоренного определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза, содержащая магний серно-кислый, глицерин, железо лимонно-амиачное, источник калия и фосфора, дистиллированную воду и один из противотуберкулезных препаратов: рифампицин, или стрептомицин, или изониазид, или этамбутол, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит нормальную лошадиную сыворотку, натрий - L-глутаминово-кислый кислый, тиамин бромид, марганец (II) серно-кислый, натрий лимонно-кислый трехзамещенный, динатрий фосфат обезвоженный, а в качестве источника калия и фосфора - калий дигидроортофосфат при следующем соотношении компонентов, г/л:

Натрий-L-глутаминово-кислый кислый 18,0-22,0

Калий дигидроортофосфат 0,9-1,1

Динатрий фосфат обезвоженный 4,4-4,6

Магний серно-кислый 0,01-0,03

Железо лимонно-аммиачное 0,01-0,03

Натрий лимонно-кислый

трехзамещенный 1,2-1,8

Марганец (II) серно-кислый 0,004-0,006

Тиамин бромид 0,001-0,003

Глицерин 55,0-65,0

Вода дистиллированная До 1 л

Нормальная лошадиная сыворотка 80,0-120,0 мл

Один из противотуберкулезных препаратов:

рифампицин 0,002

или стрептомицин 0,005

или изониазид 0,001

или этамбутол 0,002.