Инактивированная эмульсионная вакцина против инфекционного ларинготрахеита птиц

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина содержит авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" гомологичного вируса и масляный адъювант в эффективном соотношении. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным наименованием "О №112-ДЕП". Вирус штамма "О №112-ДЕП" репродуцируется в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см. В качестве инактиванта используют димер этиленимина в концентрации 0,1%. Вакцину применяют для иммунизации клинически здоровой птицы в возрасте 25-30-суток в объеме 0,5 см³ внутримышечно. Иммунитет у привитой птицы наступает на 14-21 сутки после вакцинации. Технический результат: расширение арсенала инактивированных эмульсионных вакцин против ИЛТ птиц, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью. 4 з.п. ф-лы, 5 табл.

 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и производстве средств специфической профилактики инфекционного ларинготрахеита (ИЛТ) птиц.

ИЛТ - острое контагиозное заболевание птиц - является причиной высокого процента смертности (обычная смертность составляет 10-20%, известны случаи высокой смертности, которая составляет 50-70%), у переболевших особей снижается суточный привес и яйценоскость. ИЛТ вызывается герпесвирусом. В комплексе мер борьбы с ИЛТ одним из основных средств является вакцинация с помощью живых и инактивированных вакцин.

В мировой практике известно более 20 штаммов вируса ИЛТ, различающихся по своим антигенным свойствам и используемых при изготовлении вирусвакцин против ИЛТ (1-7).

В России при изготовлении вирусвакцин против ИЛТ нашли широкое применение штаммы "ВНИИБП" (8) и клон "НТ" штамма "ЦНИИПП" (9).

Хотя преимущество живых вакцин из-за технологичности производства и простоты применения не вызывает сомнения, однако иммунная реакция у птиц при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации. Кроме того, при ИЛТ введение живых вакцин взрослой птице не формирует напряженный иммунитет.

Для профилактики ИЛТ птиц нашли также применение инактивированные эмульсионные вакцины, для изготовления которых используют вирулентные штаммы гомологичного вируса.

Известна инактивированная эмульсионная вакцины против ИЛТ птиц, содержащая инактивированный этиленимином антигенный материал из штамма SZ-81-ILT гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур, и неполный адъювант Фрейнда при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Антигенный материал 50,0

Неполный адъювант Фрейнда 50,0 (10)

Известна также инактивированная эмульсионная вакцина против ИЛТ птиц, содержащая инактивированный формалином антигенный материал из штамма "Г" гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур или в культуре клеток фибробластов эмбрионов SPF-кур (ФЭК), и масляный адъювант, содержащий минеральное масло "ВМ" и ланолин безводный, при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Антигенный материал 50,0

Минеральное масло "ВМ" 43,0

Ланолин безводный 7,0 (11)

По мнению заявителя наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является инактивированная эмульсионная вакцина против ИЛТ птиц, содержащая авирулентный антигенный материал из штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, и масляный адъювант в эффективном соотношении (11).

Недостатки известных инактивированных эмульсионных вакцин против ИЛТ птиц, в том числе и вакцины-прототипа, состоят в том, что для приготовления антигенного материала используют вирулентные штаммы, которые всегда создают проблемы при соблюдении ветеринарно-санитарной безопасности.

В связи с этим актуальной остается проблема создания инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц, обладающей одновременно высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц на основе нового штамма гомологичного вируса, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и пригодной для изготовления высокоиммуногенной и безвредной инактивированной эмульсионной вакцины.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных эмульсионных вакцин против ИЛТ птиц, обладающих высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью.

Указанный технический результат достигнут созданием инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:

1) инактивированная эмульсионная вакцина против ИЛТ птиц;

2) авирулентный антигенный материал из штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе;

3) в качестве чувствительной биологической системы используют 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур;

4) в качестве вакцинного штамма вакцина содержит штамм "О" №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц;

5) авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³;

6) авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³, в эффективном количестве;

7) авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³ в количестве 30,0 мас.%;

8) инактивант;

9) из инактивантов-димер этиленимина (ДЭИ);

10) ДЭИ в концентрации 0,1%;

11) по окончании инактивации ДЭИ нейтрализуют тиосульфатом натрия;

12) масляный адъювант;

13) из масляных адъювантов масляный адъювант Montanide ISA-70;

14) масляный адъювант по п.13 в эффективном количестве;

15) масляный адъювант по п.13 в количестве 70,0 мас.%;

16) авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³, и масляный адъювант по п.13 в соотношении, мас.%:

Авирулентный антигенный материал 30,0

Масляный адъювант 70,0

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1) инактивированная эмульсионная вакцина против ИЛТ птиц;

2) авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в чувствительной биологической системе, в эффективном количестве;

3) масляный адъювант.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:

1) авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³;

2) авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³, в количестве 30,0 мас.%;

3) из масляных адъювантов -масляный адъювант Montanide ISA-70;

4) масляный адъювант по п.3 в эффективном количестве;

5) масляный адъювант по п.3 в количестве 70,0 мас.%;

6) авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³, и масляный адъювант по п.3 в соотношении, мас.%:

Авирулентный антигенный материал 30,0

Масляный адъювант 70,0

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1) инактивированная эмульсионная вакцина против ИЛТ птиц;

2) авирулентный антигенный материал из штамма вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в чувствительной биологической системе;

3) масляный адъювант.

По сравнению с вакциной - прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:

1) антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц;

2) антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:

1) антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³;

2) антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³ в количестве 30,0 мас.%;

3) из масляных адъювантов масляный адъювант Montanide ISA-70;

4) масляный адъювант по п.3 в эффективном количестве;

5) масляный адъювант по п.3 в количестве 70,0 мас.%;

6) авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД50/см³, и масляный адъювант по п.3 в соотношении, мас.%:

Авирулентный антигенный материал 30,0

Масляный адъювант 70,0

Предлагаемая вакцина обладает высокой антигенной и иммуногенной активностью, является безвредной и расширяет арсенал инактивированных эмульсионных вакцин против ИЛТ птиц.

Достижение технического результата от использования предлагаемой вакцины объясняется использованием в ее составе авирулентного антигенного материала из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, обладающего по сравнению со штаммами "ВНИИБП" и "ЦНИИПП" более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью как в нативном виде, так и после инактивации.

Штамм "О №112-ДЕП" является новым, ранее не известным. Исходный вирус (авторское наименование штамм "О") для получения штамма "О №112-ДЕП" выделен из гортани и трахеи курицы с признаками латентной формы заболевания в Казахстане в 1992 году. Производственный штамм "О №112-ДЕП" получен путем многократных последовательных пассажей на 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 05.06.2000 г. под регистрационным наименованием "О №112-ДЕП".

Штамм "О №112-ДЕП" обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц.

Штамм "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "О" вируса ИЛТ относится к семейству Herpesviridae. При электронной микроскопии (инструментальное) увеличение 4,5×10⁵ и 5×10⁵ в поле зрения микроскопа наблюдают хорошо различимые вирусные частицы ИЛТ со свойственной им морфологией. Вирионы имеют сферическую форму, их размеры варьируют от 200 до 250 нм (у некоторых до 330 нм). Вирионы ИЛТ состоят из сферического нуклеокапсида, окруженного суперкапсидной оболочкой сложной формы. Вирион обладает икосаэдрическим типом симметрии. Икосаэдрический капсид покрыт липопротеидной оболочкой, имеющей на своей поверхности морфологические единицы-пепломеры. Диаметр нуклеокапсида равен 113+2 нм, усредненный диаметр нуклеокапсидной оболочки около 350 нм.

Нуклеокапсиды размером 100-110 нм располагаются в вирусной частице, как правило эксцентрично, реже - в центре частиц. Геном вируса ИЛТ имеет длину 155000 полинуклеотидов и состоит из длинной уникальной последовательности И1 (120000 полинуклеотидов) и короткой уникальной последовательности И3 (17000 полинуклеотидов). Вирус содержит гликопротеины (205, 160, 115, 90, 85, 74, 60 и 50 кД). Гликопротеин В (дВ) является первым структурным белком вируса ИЛТ.

Антигенные свойства

Штамм "О" вируса ИЛТ стабильно нейтрализуется гомологичной сывороткой, идентифицируется в сыворотках крови кур, содержащих антитела к данному вирусу, в РДП, РН и ИФА. В РДП идентифицируется гомологичными гипериммунными сыворотками в титре 1:8. В РН индекс нейтрализации гомологичными гипериммунными сыворотками в разведениях 1:10 и 1:20 в среднем составляет 3,8 Ig ЭИД₅₀/см³ соответственно. В ИФА идентифицируется полевыми и лабораторными гипериммунными сыворотками в титре до 1:24579. Антигенные различия штамма "О №112-ДЕП" по отношению к другим штаммам вируса ИЛТ не установлены. Гемагглютинирующими свойствами штамм не обладает.

Биотехнологические характеристики

Штамм "О" проявляет высокую биологическую, иммуногенную и антигенную активность как в нативном виде, так и после инактивациями. Штамм "О №112-ДЕП" используют для изготовления живой и инактивированной вакцины против ИЛТ птиц и диагностических препаратов. Вирус имеет выраженный тропизм к эпителиальным клеткам слизистой оболочки гортани, трахеи и клоаки птиц.

Штамм культивируют в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур. Репродукция вируса происходит в ткани хориоаллантоисной оболочки (ХАО). Инфекционный титр вируса в 10-20% суспензии ХАО на 5 сутки культивирования при условии генерализованного распространения по всей оболочке составляет не менее 6,2 Ig ЭИД₅₀/см³.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм "О №112-ДЕП" является ДНК-содержащим вирусом.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус чувствителен к липолитическим агентам, теплу и различным дезинфектантам. Температура 55°С разрушает вирус в течение 10-15 мин, а 38°С - за 48 час. В замороженных тушках больных и вынужденно убитых кур, хранившихся при температуре минус 10, 18 и 28°С, вирус оставался активным более 19 месяцев, на поверхности скорлупы в условиях термостата инактивируется через 12 час, а в зараженных птичниках сохраняется не более 9 дней. Полностью инактивируется в 1% растворе креола в течение 30 секунд. Он длительно сохраняет свою активность в лиофилизированном состоянии или при минус 20-60°С. В лиофилизированном гомогенате ХАО вирус сохраняет инфекционность не менее 1,5 лет. В замороженной ткани ХАО инфекционность вируса сохраняется не менее 4 лет.

Иммуногенность штамма

При вакцинации кур старше 5-дневного возраста окулярным способом в дозе 1000 ЭИД₅₀ и оральным способом (выпойкой) в дозе 3000 ЭИД₅₀ индуцирует выработку специфических антител и создает иммунитет против ИЛТ у 100% вакцинированных кур. В лиофилизированном гомогенате ХАО вирус создает иммуногенность не менее 1,5 лет.

Эпизоотичность штамма

При совместном содержании вакцинированных и интактных птиц передача вакцинного вируса штамма "О №112-ДЕП" по контакту не установлена.

Условия поддержания штамма

Лиофилизированный материал из штамма "О №112-ДЕП" хранят при температуре 4°С, вируссодержащие ХАО - при температуре не выше минус 40°С. Для лиофилизации используют защитную среду "ВНИИЗЖ". Для ресуспендирования лиофилизированного вируса используют изотонический фосфатно-буферный раствор, рН 7,4-7,6.

Генетическая чистота

После 20 пассажей на ХАО 9-11-суточных эмбрионов SPF-кур каких-либо изменений иммунобиологических свойств штамма "О №112-ДЕП" не установлено.

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность отсутствует.

Патогенность отсутствует.

Вирулентность отсутствует.

Онкогенность отсутствует.

Контагиозность отсутствует.

Стабильность аттенуации отмечена при проведении 4 пассажей на чувствительных цыплятах.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее не известным вариантом вируса ИЛТ.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, приведенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемой вакцины условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемой вакцины), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемой вакцины преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают его объем.

Пример 1

Для получения инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц матровым вирусом из штамма "О №112-ДЕП" заражают хорошо развитые 9-11-суточные эмбрионы SPF-кур. Для этого в скорлупе куриного эмбриона со стороны воздушной камеры образуют отверстие диаметром 8-10 мм. В подскорлупной оболочке и хориоаллантоисной оболочке (ХАО) инъекционной иглой производят четыре прокола в углы мнимого квадрата с диагональю около 5 мм.

После этого на ХАО наносят вируссодержащий материал в объеме 0.1 см³. Отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем. Инфицированные эмбрионы инкубируют в течение 3-6 суток при 37,7°С и влажности 60%. По результатам овоскопии и последующего вскрытия эмбрионов определяют наличие характерных для вируса ИЛТ поражений ХАО.

Пораженные ХАО используют в качестве вируссодержащего материала. Из пораженных ХАО готовят 15-30-процентную суспензию, которую промораживают и освобождают от крупнодисперсных частиц низкоскоростным центрифугированием. Вируссодержащую надосадочную жидкость осторожно сливают в стерильных условиях в общую емкость и подвергают контролю на инфекционную активность. Для изготовления вакцины используют вируссодержащий материал с титром инфекционной активности, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³. Затем полученный вирус подвергают инактивации. Для инактивации используют ДЭИ. В подогретую до 27°С вируссодержащую суспензию вносят 10% водный раствор ДЭИ до концентрации 0,1%. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 27°С в течение 24 часов. По окончании инактивации ДЭИ нейтрализуют тиосульфатом натрия в течение 120 минут и антигенный материал охлаждают до температуры 2-8°С.

Затем антиген тщательно эмульгируют с масляным адъювантом в соотношении, мас.%: 30,0-70,0. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант Montanide ISA-70. Готовая вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета. Препарат фасуют во флаконы объемом по 200 см³, что соответствует 400 прививным дозам.

Полученную вакцину контролируют на безвредность и иммуногенную активность.

Для определения безвредности из 3 флаконов отбирают по 6 см³ вакцины, образуя общую пробу. Вакцину вводят внутримышечно в область груди 10 цыплятам возраста 25-30 суток в объеме по 1,5 см³. За птицей наблюдают в течение 10 дней. Вакцину считают безвредной, если в период наблюдения в группе привитых птиц не отмечено случаев падежа, клинических признаков заболевания ИЛТ или выраженного угнетения птиц. Кроме этого, не допускается возникновение экссудативного воспалительного процесса на месте введения.

Для определения иммуногенной активности из 3 флаконов отбирают по 6 см³ вакцины, образуя общую пробу.

Вакцину вводят в область груди внутримышечно 20 цыплятам 25-30 суточного возраста в объеме 0.5 см³. Кроме этого, организуют контрольную группу цыплят, состоящую из интактных цыплят того же возраста. За подопытной и контрольной птицей наблюдают в течение 21 суток.

Через 21 сутки после вакцинации подопытных и контрольных цыплят заражают вирулентным штаммом вируса ИЛТ (штамм "Богатищевский"). Вирус вводят интратрахеально в дозе 1000 ЭИД₅₀ в объеме 0,5 см³. За цыплятами наблюдают в течение 10 суток. Перед заражением у вакцинированных цыплят берут кровь, получают сыворотки и исследуют их в ИФА. По результатам ИФА допускается оценка иммуногенности вакцины без контрольного заражения.

Вакцину считают иммуногенной, если она предохраняет от заболевания ИЛТ 16 из 20 цыплят. В контрольной группе должно заболеть с клиническими признаками ИЛТ не менее 8 цыплят из 10 зараженных.

Эффективность вакцинации проверяют по формуле

Ef=[(K-V)/K]×100,

где Ef - оценка эффективности вакцины в процентах;

К и V - доли заболевшей и павшей от ИЛТ птицы в контрольной и вакцинированной группах соответственно.

Применение вакцины считают эффективным, если оценка Ef равна или больше 75%.

Вакцина также признается иммуногенной, если не менее чем у 80% иммунизированных цыплят в сыворотках крови, исследованных в ИФА, установлено присутствие антител к вирусу ИЛТ (индекс S/P равен или больше 0,15). Средняя величина титра антител в группе положительно реагирующих образцов сывороток должна составлять не менее 1:800.

Вакцину применяют для иммунизации клинически здоровой птицы в возрасте 25-30 суточного возраста для создания высокого уровня иммунитета. Препарат в объеме 0,5 см³ вводят внутримышечно. Иммунитет у привитой птицы наступает на 14-21 сутки после вакцинации. Вакцина индуцирует высокий уровень антител против вирулентного вируса ИЛТ.

Пример 2

Инактивированную вакцину против ИЛТ птиц, изготовленную так, как описано в примере 1, и содержащую, мас.%:

Авирулентный антигенный материал

из штамма "О "112-ДЕП" гомологичного вируса 30,0

Масляный адъювант 70,0

подвергли контролю на реактогенность.

Для этого из 3 флаконов отобрали по 6 см³ вакцины, образуя общую пробу. Вакцину ввели 10 цыплятам внутримышечно в область груди по 1,5 см³. За птицей вели ежедневное наблюдение в течение 10 суток. Действие препарата не повлекло за собой случаев падежа, клинических признаков заболевания ИЛТ или выраженного угнетения в группе птиц не отмечено. На месте инъекции вакцины у части цыплят наблюдали возникновение небольшой припухлости.

Пример 3

Инактивированную эмульсионную вакцину против ИЛТ птиц, изготовленную так, как описано в примере 1, и содержащую, мас.%:

Авирулентный антигенный материал

из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц 30,0

Масляный адъювант 70,0

подвергли контролю на антигенную и иммуногенную активность.

Для этого из 3 флаконов вакцины отобрали по 6 см³ препарата, образуя единую пробу. Кроме того, были приготовлены пробы, содержащие 1/4 и 1/16 вышеуказанной концентрации антигенного материала. Эти препараты вакцины были обозначены: "Ц" (цельная), "1/4", "1/16" соответственно. Для испытания указанных препаратов сформировали 3 группы по 15 подопытных птиц 25-30-суточного возраста. Вакцину вводили внутримышечно в область груди по 0,5 см³.

Параллельно образовали контрольную группу, состоящую из 10 интактных птиц, которые в течение всего эксперимента содержались в условиях, аналогичных подопытной птице.

На 21 сутки после прививки у вакцинированных цыплят в ИФА исследовали сыворотки на присутствие антител к вирусу ИЛТ. Для постановки ИФА использовали диагностические наборы фирмы KPL (USA, Catalog N54-93-01; Serial NF032). В соответствии с инструкцией по использованию наборов реакцию считали положительной, если величина титра антител была равной или превосходила значение 1:336.

Через 21 сутки после вакцинации подопытных и контрольных птиц заражали патогенным штаммом "Богатищевский" вируса ИЛТ, который вводили интратрахеально в дозе 1000 ЭИД₅₀ в объеме 0,5 см³.

В течение 10 суток за инфицированной птицей вели наблюдение. Выявляли клинические признаки ИЛТ. Проводили патологоанатомические исследования (устанавливали специфические для ИЛТ поражения: эксудативно-геморрагические воспаления слизистой трахеи и глотки, а также наличие фибринозных пробок в верхнем отделе трахеи). В подопытных и контрольных группах определяли долю заболевших и павших от ИЛТ птиц.

Результаты исследования антигенного и протективного действий эмульсионной вакцины в виде показателей титра сывороточных антител, а также доли заболевших и павших птиц после заражения патогенным штаммом вируса ИЛТ соответственно испытанным концентрациям антигена в препаратах представлены в таблице 1.

Представленные в табл.1 результаты позволяют считать, что эмульсионная вакцина продемонстрировала выраженное антигенное и протективное действие, которое зависело от концентрации антигена в препарате.

Было установлено, что показатель заболеваемости вакцинированных птиц (С) при контрольном заражении патогенным штаммом вируса был устойчиво связан с долей положительно реагирующих сывороток в исследуемой группе. Величины коэффициентов корреляции указанных переменных составили 0,974 для эмульсионной вакцины.

Анализ полученных результатов показал, что связь между оценками D и Т может быть описана эмпирическим уравнением, позволяющим определять ожидаемую величину титра антител (Т) для заданной концентрации антигена в вакцине. Уравнение для эмульсионной вакцины имело вид

lgT’=3,641+(-0,716)×lgD

Установленные значения эмпирических коэффициентов не имели статистических различий. Формально снижение эффекта от эмульсионной вакцины в связи с уменьшением концентрации антигена было несколько менее выражено.

Оценкой протективного действия вакцин для заданной концентрации антигена считали показатель Р=1-С (долю не заболевших птиц). При этом, ориентируясь на получение более осторожных результирующих оценок, экспериментальное значение С=0, принимали как С=0,01. Для описания связи между концентрацией антигена (D) и ожидаемым протективным действием вакцины установленные оценки Р выражали в виде соответствующих им нормальных эквивалентных отклонений (Y - табличное значение). Таким образом, было построено уравнение для эмульсионной вакцины

IgY’=2,042+(-2,294)×lg D,

где Y’ - прогнозируемая величина нормального эквивалентного отклонения доли не заболевших птиц для заданного значения D.

Данное уравнение позволило определить, что для защиты 50% вакцинированного птицепоголовья ожидаемая концентрация антигена (величина разведения цельного препарата) должна составлять D’_50эм=7,76 в эмульсионной вакцине. При этом для защиты 95% птиц эта величина составила D’_95эм=1,41.

Цельный препарат этой вакцины (D=1) имел ожидаемую оценку защиты около 99%.

Таким образом, эмульсионная вакцина продемонстрировала выраженное антигенное и протективное действие. Установлена и количественно оценена связь между концентрацией антигена и долей защищенных птиц, а также величиной среднего титра сывороточных антител. В эксперименте вакцина, содержащая цельный антиген, обусловила защиту 100% птиц. Значение средних титров антител в данных группах составило 1:3048 для эмульсионной вакцины.

Пример 4

Проведены исследования изменений мышечной ткани птиц на месте инъекции инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП" (в объеме иммунизирующей дозы) через 30, 40, 60 и 90 дней после прививки. Для этого из числа вакцинированных, но не заболевших после контрольного заражения птиц, была сформирована группа в количестве 28 голов.

Через 30, 40, 60 и 90 суток у части птиц в группе провели послеубойные исследования мышечной ткани на месте ведения вакцины. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Данные таблицы 2 демонстрируют постепенное уменьшение представительства птиц, имеющих макроскопические поражения мышечной ткани на месте введения эмульсионной вакцины и снижение степени этих поражений по мере увеличения времени после прививки.

Через 30 суток поствакцинальные изменения в мышцах были обнаружены у всех птиц, при этом легкие поражения составляли 60%, средние - 40, сильные поражения отсутствовали. Через 40 суток легкие поражения составили 90%, средние - 10%. Через 60 суток были установлены только легкие поражения у 40% птиц. Исследования, проведенные по истечении 90 суток, следов применения эмульсионной вакцины не выявили.

Таким образом, исследование изменений мышечной ткани на месте инъекции вакцины (в объеме иммунизирующей дозы) в период от 30 до 90 суток после прививки показало, что эмульсионная вакцина обусловила поражения мышц легкой и средней тяжести, которые у части птиц могли быть обнаружены через 60 суток и полностью исчезали через 90 суток. Пример 5

Проведены испытания вакцины, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного на 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 6,2 Ig ЭИД₅₀/см³ 30,0

Масляный адъювант 70,0

Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИЛТ птиц. Вакцину вводили по 0,5 см³ в мышцу бедра. Через 21 день у птиц брали кровь, получали сыворотки и исследовали их в ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Результаты, представленные в таблице 3, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц, приготовленной из антигенного материала штамма "О №112-ДЕП".

Пример 6

Проведены испытания вакцины, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Авирулентный антигенный материал из штамма "О №12-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного на 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 6,2-6,6 Ig ЭИД₅₀/см³ 30,0

Масляный адъювант 70,0

Определение иммуногенной активности проводили на цыплятах 25-30-суточного возраста, свободных от антител к вирусу ИЛТ птиц. Вакцину вводили по 0,5 мл в мышцу бедра. Через 21 день после вакцинации у птиц отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в ИФА на наличие антител. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Результаты, представленные в табл.4, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц, изготовленной из штамма "О №112-ДЕП".

Пример 7

Проведены испытания вакцины, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мас.%:

Авирулентный антигенный материал из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц, репродуцированного на 10-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью 6,2-6,6 ЭИД₅₀/мл 30,0

Масляный адъювант 70,0

Иммуногенную активность вакцины определяли на цыплятах 25-30-дневного возраста, свободных от антител к вирусу ИЛТ птиц. Вакцину вводили внутримышечно в область бедра по 0,5 см³. Через 21 день отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их в ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Результаты, представленные в таблице 5, свидетельствуют о высокой иммуногенной активности инактивированной эмульсионной вакцины из штамма "О №112-ДЕП" вируса ИЛТ птиц.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- инактивированная эмульсионная вакцина против ИЛТ птиц, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- инактивированная эмульсионная вакцина против ИЛТ птиц, приготовленная из штамма "О №112-ДЕП" в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммунногенной активностью и является безвредной.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение "Инактивированная эмульсионная вакцина против ИЛТ птиц"

1. Пат. США №3331736; 167-78, 18.07.67 г.

2. Пат. США №3444293; 167-78, 13.05.69 г.

3. Авт. свид. СССР №129791; 30h, 6; 1960 г.

4. Авт. свид. СССР №1750683, А 61 К 39/245, 30.07.92 г.

5. Пат. РФ №2138290; А 61 К 39/245, 39/265, 35/78; 27.09.99 г.

6. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1998, 672-683.

7. Glissen J.R. Proceedings, 1988, 137.

8. Малушко В. В., Соколов В.Д. и др. Опыт борьбы с инфекционным ларинготрахеитом // Птицеводство, 1983. - №12. - С.21-23.

9. Дутко Ю.С., Шевченко А.А. и др. Иммунологическая эффективность вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита кур // Ветеринария, 1991. - №3. - С.32-34.

10. Barhoom S., Forgacs A. and Solyom F. Development of an inactivated vaccine against infectious laryngotracheitis (ILT)-serological and protection studies // Avian Pathology, 1986. - V.15. - №2. - P.213-221.

11. Бабкин В.Ф. Инфекционный ларинготрахеит птиц (Разработка инактивированных вакцин, методов диагностики и системы противоэпизоотических мероприятий): Автореф. дис. докт. вет. наук. - Харьков, 1996. – 33 с. (на украинском языке) (прототип).

Таблица 1 Антигенное и протективное действие инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ, содержащей различные концентрации антигена
Значение титров сывороточных антител, их средние оценки (Т), а также доля заболевших (С) и павших (L) птиц после контрольного заражения ИЛТ, соответственно концентрации антигена
Концентрация антигена (D*)	Контроль
Ц(D=1)	1/4 (D=4)	1/16 (D=16)
3280	940	64{-}**	109{-}
3598	1016	808	-***
4737	167{-}	-	-
1650	1432	121{-}	54{-}
3125	142{-}	-	46{-}
3860	1349	89{-}	-
2475	686	512	17{-}
650	203{-}	184{-}	-
3530	503	113{-}	-
4988	307{-}	664	-
1096	860	37{-}	203{-}
2306	623	-	-
3102	98{-}	29{-}	74{-}
5059	1034	223{-}	32{-}
3933	230{-}	102{-}	-
Т****=3048	Т=893	Т=490	Т=0
С=0/15	С=7/15	С=10/15	C=15/15
L=0	L=2/7	L=2/10	L=8/15
*- указана величина, обратная разведению цельного препарата (L); **- значение титра ниже минимального положительного показателя (реакция отрицательная); ***- значение титра ниже или равно показателю отрицательного контроля (реакция отрицательная); ****- среднегеометрическая величина, установленная в группе положительно реагирующих сывороток.

Таблица 2 Результаты исследования изменений мышечной ткани на месте инъекции эмульсионной вакцины
Степень поражений ткани (по Stone H., 1997) соответственно времени после вакцинации
Время после вакцинации (сутки)	Легкие поражения*	Средние поражения**	Сильные поражения***
30	3/5	2/5	0/5
40	4/5	1/5	0/5
60	4/9	0/9	0/9
90	0/9	0/9	0/9
* - побледнение тканей, окружающих место инъекции, на площади до 1 см, отсутствие воспаления и инкапсулированных остатков вакцины; ** - воспалительная реакция, проявляющаяся в отечности и побелении на площади до 2 см2тканей, где присутствуют остатки инкапсулированной или диффузно распределенной вакцины; *** - очаг воспаления тканей в диаметре до 4 см с вовлечением глубоких и поверхностных мышц с образованием гранулем (вакцина вытекает на разрезе или присутствует в тканях в виде творожистого вещества).

Таблица 3 Иммуногенность инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП"
№№ п/п	Наименование материала	Титр антител в ИФА
1.	Сыворотка вакцин. птиц	3460
2.	Сыворотка вакцин. птиц	2112
3.	Сыворотка вакцин. птиц	3860
4.	Сыворотка вакцин. птиц	2501
5.	Сыворотка вакцин. птиц	2178
6.	Сыворотка вакцин. птиц	3120
7.	Сыворотка вакцин. птиц	2602
8.	Сыворотка вакцин. птиц	3200
9.	Сыворотка вакцин. птиц	2600
10.	Сыворотка вакцин. птиц	2160
11.	Контроль	0

Таблица 4 Иммуногенная активность инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП"
№№ п/п	Наименование материала	Титр антител в ИФА
1.	Сыворотка вакцин. птиц	2400
2.	Сыворотка вакцин. птиц	3250
3.	Сыворотка вакцин. птиц	2800
4.	Сыворотка вакцин. птиц	4200
5.	Сыворотка вакцин. птиц	3500
6.	Сыворотка вакцин. птиц	2500
7.	Сыворотка вакцин. птиц	3200
8.	Сыворотка вакцин. птиц	3250
9.	Сыворотка вакцин. птиц	4150
10.	Сыворотка вакцин. птиц	3600
11.	Контроль	0

Таблица 5 Иммуногенная активность инактивированной эмульсионной вакцины против ИЛТ птиц из штамма "О №112-ДЕП"
№№ п/п	Наименование материала	Титр антител в ИФА
1.	Сыворотка вакцин. птиц	2118
2.	Сыворотка вакцин. птиц	2705
3.	Сыворотка вакцин. птиц	2180
4.	Сыворотка вакцин. птиц	3260
5.	Сыворотка вакцин. птиц	2820
6.	Сыворотка вакцин. птиц	3610
7.	Сыворотка вакцин. птиц	2850
8.	Сыворотка вакцин. птиц	2190
9.	Сыворотка вакцин. птиц	2580
10.	Сыворотка вакцин. птиц	2590
11.	Контроль	0

1. Инактивированная эмульсионная вакцина против инфекционного ларинготрахеита птиц, содержащая авирулентный антигенный материал из штамма гомологичного вируса, репродуцированного в чувствительной биологической системе, и масляный адъювант, отличающаяся тем, что в качестве авирулентного антигенного материала она содержит авирулентный антигенный материал из штамма вируса инфекционного ларинготрахеита птиц, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus, коллекция ВГНКИ "О № 112-ДЕП", в эффективном количестве.

2. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный антигенный материал из штамма "О № 112-ДЕП" гомологичного вируса, репродуцированного в 9-11-суточных эмбрионах SPF-кур с инфекционной активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ЭИД₅₀/см³.

3. Вакцина по п.2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный антигенный материал из штамма "О № 112-ДЕП" гомологичного вируса в количестве 30,0 мас.%.

4. Вакцина по п.1, отличающаяся тем, что она содержит масляный адъювант в количестве 70,0 мас.%.

5. Вакцина по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный антигенный материал из штамма "О № 112-ДЕП" гомологичного вируса и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал 30,0

Масляный адъювант 70,0