Штамм бактерий burkholderia thailandensis км 161 - авирулентный имитатор возбудителя мелиоидоза
Владельцы патента RU 2257413:
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (RU)
Изобретение относится к медицинской микробиологии. Штамм Burkholderia thailandensis KM 161 по фенотипическим признакам обладает высокой степенью сходства с B.pseudomallei, но отличается от возбудителя мелиоидоза авирулентностью - не вызывает гибели морских свинок в дозе 1×108 КОЕ. Это позволяет использовать его в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учебных занятий по бактериологии и индикации возбудителей особо опасных инфекций, 3 табл.
Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения авирулентного штамма Burkholderia thailandensis KM 161 - имитатора возбудителя мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) для проведения учебных занятий по бактериологии и индикации возбудителей особо опасных инфекций, контроля питательных сред, в том числе и селективных, а также учений по ГО (гражданской обороне), на которых в качестве имитаторов для других бактериальных агентов используются известные вакцинные штаммы - Y.pestis EV, F.tularensis 15, B.anthracis СТИ и др. Для В.pseudomallei аналогичные вакцинные штаммы не существуют, в связи с чем на учебных занятиях отсутствует бактериологический раздел работы, так как используется только инактивированная культура возбудителя, с которой можно проводить лишь ограниченное количество исследований, что в конечном итоге снижает качество обучения курсантов.
Целью изобретения является получение штамма из рода Burkholderia, который по своим культуральным, биохимическим и антигенным свойствам способен служить авирулентным имитатором возбудителя мелиоидоза.
Для достижения цели из имевшегося в нашем распоряжении авторского набора культур непатогенных буркхольдерий (всего более 30), выделенных из внешней среды эндемичных по мелиоидозу регионах с помощью селективных сред для В.pseudomallei, отобран штамм В. thailandensis KM 161, который из всех имеющихся в коллекции авирулентных буркхольдерий агглютинируется специфической мелиоидозной сывороткой и по другим фенотипическим признакам обладает наибольшей степенью сходства с В.pseudomallei, но отличается от возбудителя мелиоидоза авирулентностью и способностью ассимилировать L-арабинозу. Данный штамм имеет определенные отличия от В.pseudomallei в последовательностях нуклеотидов секвенированных фрагментов ДНК, что имеет прямое отношение к дополнительной верификации родовой и видовой принадлежности В.thailandensis KM 161.
Выявленный штамм В.thailandensis KM 161 представляет собой подвижные, грамотрицательные, неспороносные палочки, размером 0,5-1,0×2,0-4,0 мкм. Хорошо растет в аэробных условиях на простых питательных средах, которые используют при работе с типичными видами буркхольдерий: мясо-пептонном агаре (бульоне), триптиказо-соевом агаре (бульоне) с добавлением 4-5% глицерина при 37°С и оптимуме рН от 6,8 до 7,2.
На плотных питательных средах через 24 ч роста образует гладкие, круглые, полупрозрачные колонии кремового цвета. На 3-4 с колонии становятся непрозрачными и шероховатыми. На жидких питательных средах образует интенсивную муть с выраженной пленкой на поверхности.
Биохимическая активность В.thailandensis KM 161 и типичного вирулентного штамма В.pseudomallei С-141, проверенная по стандартным методам, предусмотренным для изучения основных родовых и видовых свойств возбудителя мелиоидоза (Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Пивень Н.Н. Идентификация Pseudomonas pseudomallei. Лаб. дело. - 1983. - №7.- С.61-62), у данных микроорганизмов была идентичной.
При подкожном введении морским свинкам 0,5 мл суточной агаровой культуры дозой 1 млрд м.к./мл животные не падали в течение 30 сут (срок наблюдения). В конце опыта животных усыпляли хлороформом, вскрывали и проводили посевы внутренних органов на МПА отпечатками с целью выявления бактериальной обсемененности. Чашки с посевами инкубировали в течение 5 сут при 37°С. Рост микроорганизмов не обнаружен.
Уровень вирулентности штамма B.thailandensis KM 161 сохранялся в течение 2 лет (срок наблюдения) при хранении как в лиофилизированном состоянии при +4°С, так и в полужидком МПА под вазелином.
Данный штамм принят на депонирование 28 ноября 2002 г. В Государственной коллекции патогенных бактерий “Микроб” штамму присвоен номер В.thailandensis KM 161.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Оценка культурально-морфологических свойств B.thailandensis KM 161.
Для культивирования штамма используют общепринятые для экспериментов с бурхольдериями твердые или жидкие питательные среды - на основе мясо-пептонного или триптиказо-соевого бульонов. Селективную среду Эшдауна (Ashdown L.R. Pathology. - 1979. - Vol.11, №2. - P.293-297) готовят на основе триптиказо-соевого агара (ТСА) с добавлением 5 мг/л кристалл виолета, 50 мг/л нейтрального красного и 4 мг/л гентамицина.
Через 24 ч на плотных питательных средах вырастают однородные колонии диаметром 3-5 мм в S-форме, почти бесцветные, со слабым кремовым оттенком, проявляющимся все более по мере старения культуры. На 3-4 с колонии становятся непрозрачными и шероховатыми. На селективной среде Эшдауна - колонии розового цвета, просветление вокруг них не выражено.
При световой микроскопии - грамотрицательные палочки (0,5-3,0 мкм), в “раздавленной” капле - выраженная подвижность бактерий.
Пример 2. Сравнение основных биохимических характеристик штаммов B.thailandensis KM 161 и В.pseudomallei С-141.
Культуры B.thailandensis KM 161 и В.pseudomallei С-141 выращивают на триптиказно-соевом агаре и селективной среде Эшдауна при 37°С в течение 24 ч.
Оценку активности расщепления карбогидратов, декарбоксилирования аминокислот, ассимиляции источников углерода и энергии проводят на среде, предложенной G.Gilardi (Gilardi G.L. Mount Sinai J. Med. - 1976. - Vol.43, №6. - P.710-715) по стандартным методам, предусмотренным для изучения основных родовых и видовых свойств B.pseudomallei.
Результаты сравнения штаммов B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei С-141 представлены в таблице 1.
| Таблица 1 Сравнение фенотипических призраков B.ailandensis KM 161 и B.pseudomallei C-141 | ||
| Тесты | B.pseudomallei С-141 | B.thailandensis KM 161 |
| Окисление глюкозы | + | + |
| фруктозы | + | + |
| ксилозы | + | + |
| лактозы | + | + |
| мальтозы | + | + |
| Аргининдигидролаза | + | + |
| Лизиндекарбоксилаза | - | - |
| Орнитиндекарбоксилаза | - | - |
| Желатиназа | + | + |
| Денитрификация | + | + |
| ДНК-аза | - | - |
| Число жгутиков | >1 | >1 |
| Рост при 4°С | - | - |
| Рост при 42°С | + | + |
| Полимиксин | R | R |
| Гентамицин | R | R |
| Рост при 2,5% NaСl | - | - |
| Ассимиляция 1-арабинозы | - | + |
| Ассимиляция β-аланина | + | + |
| Наличие пигмента | - | - |
| R-колонии на агаре | +/- | - |
| Ауксотрофность | - | - |
| Примечание: (+) и (-) обозначают наличие или отсутствие признака у данного штамма; R - устойчивость, S - чувствительность к антибиотикам. |
Пример 3. Определение вирулентности штаммов B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei C-141.
Вирулентность штаммов для лабораторных животных проверяют на двух видах - высокочувствительных к мелиоидозу золотистых хомячках и умеренно чувствительных - морских свинках. Заражение животных производят взвесью суточной агаровой культуры в объеме 0,5 мл подкожно в область внутренней поверхности бедра. Морских свинок и золотистых хомячков заражают возрастающими в геометрической прогрессии дозами от 102 до 108 м.к/мл. Учет опыта - через 1 месяц от момента заражения. Расчет летальной дозы производят с учетом результатов аутопсии.
Результаты опыта представлены в таблице 2.
| Таблица 2 Вирулентность штаммов B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei С-141 для лабораторных животных | ||||||
| Вид животного | Штаммы | Дозы заражения | ЛД50 | |||
| 102 | 104 | 106 | 108 | |||
| З. хомячки | КМ 161 | 0/5 | 0/5 | 2/5 | 5/5 | 1,6×106 |
| З. хомячки | С-141 | 5/5 | 5/5 | - | - | <102 |
| М. свинки | КМ 161 | - | - | - | 0/5 | >108 |
| М.свинки | С-141 | 1/5 | 3/5 | 5/5 | - | 2,5×103 |
Пример 4. Определение иммунологических свойств и фагопродукции штамма В.thailandensis KM 161.
Постановку иммунологических реакций: РА с агглютинирующей мелиоидозной сывороткой, РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом, МФА с люминесцирующей мелиоидозной сывороткой, ТИФА и реакция иммунодиффузии, производят по общепринятым методикам, применительно к возбудителю мелиоидоза (Методические рекомендации “Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза”, Волгоград, 1994, утвержденные Г.Г.Онищенко 1.11.1994 г.).
Для определения спонтанной фагопродукции, как принято в отношении B.pseudomallei (Гришкина Т.А., Меринова Л.К. Изучение спонтанной фагопродукции Pseudomonas pseudomallei и круга “хозяев” мелиоидозных фагов среди представителей рода Pseudomonas. Микробиол. журн. - 1993. - №4. - С.43-47), в качестве индикаторного штамма используют B.mallei 10230.
B.thailandensis KM 161 так же, как и возбудитель мелиоидоза, агглютинировался кроличьей мелиоидозной сывороткой в разведениях не менее 1:200. Методом ТИФА B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei С-141 выявлялись в концентрации клеток 2,5х105 и более. При использовании иммуноглобулинов диагностических флюоресцентных мелиоидозных моноклональных B.pseudomallei С-141 выявляется в МФА в титрах 1:256, B.thailandensis KM 161 - в титре 1:128. Методом РНГА B.thailandensis KM 161 и B.pseudomallei С-141 выявляются в разведении 5×105. Все остальные штаммы буркхольдерий, в том числе и B.thailandensis, имели более низкие титры в сывороточных реакциях и не обладали спонтанной фагопродукцией. Результаты опыта представлены в таблице 3.
| Таблица 3 Сравнительная характеристика диагностических тестов для идентификации возбудителя мелиоидоза и B.thailandensis | |||
| Штаммы | РНГА м.к./мл | МФА (титры) | Спонтанная фагопродукция |
| В. pseudomallei С 141 | 5×105 | 1:256 | + |
| B.thailandensis KM 161 | 5×105 | 1:128 | + |
При использовании кроличьей мелиоидозной сыворотки в реакции иммунодиффузии в геле отмечались идентичные линии преципитации, что дополнительно подтверждает антигенное родство этих видов.
Таким образом, как следует из представленных результатов, полученный штамм B.thailandensis KM 161 обладает основными фенотипическими свойствами В.pseudomallei С-141, является авирулентным и не требует соблюдения режима безопасности при работе с ним. На основании этих данных штамм B.thailandensis KM 161 может быть использован в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учебных занятий по бактериологии и индикации возбудителей особо опасных инфекций.
Штамм бактерий Burkholderia thailandensis KM 161 (коллекция Рос-НИПЧИ “Микроб”) - авирулентный имитатор возбудителя мелиоидоза (В.pseudomallei).
