Способ очистки, выделения и споруляции цист и ооцист

Изобретение относится к области микробиологии. Способ предусматривает получение кокцидиальных ооцист из фекальной суспензии, гомогенизацию фекальной суспензии, отделение ооцист от фекальных остатков органических веществ солевой флотацией с использованием сульфата натрия и других флотационных агентов, споруляцию ооцист с использованием перекиси водорода и барботирования воздуха, отбеливание спорулированных ооцист, промывание отбеленных ооцист, концентрирование стерильных промытых ооцист и объединение концентратов различных видов кокцидиальных ооцист и получение вакцины. Способ позволяет получать высококачественные вакцины без примесей токсичных веществ. 3 н. и 30 з.п. ф-лы, 3 ил.

 

Данное изобретение в целом относится к способам очистки, выделения и споруляции инцистированных простейших (protozoa), используемых для получения вакцин. Известно, что протозоа являются паразитами, поражающими желудочно-кишечный тракт хозяина. В том случае, если хозяин имеет слабую или подавленную иммунную систему, например, если это очень молодой, очень старый и иммунологически «скомпрометированный» хозяин, то инфекция может оказаться для него фатальной. Такой исход может также вызвать экономические потери. Протозоа присутствуют в окружающей среде в относительно стабильной инцистированной форме, также называемой «ооцистой», если протозоа представляют собой спорозоа. При попадании внутрь хозяина инцистированные протозоа реагируют на условия желудочно-кишечного тракта и инфицируют хозяина.

Для того чтобы предотвратить или ослабить эту проблему, были разработаны неяйцевые вакцины. Такие вакцины обычно подвергают хозяина воздействию небольшого количества протозоа для развития у него иммунитета, не вызывая болезни. Такие вакцины включают вакцину против кокцидиоза у птиц, вызываемого любым из многочисленных видов кокцидий (патент США 5055292), вакцину для кошек против токсоплазмоза (патент США 5045313), а также вакцины для свиней и других жвачных животных (патент США 4808404). Такие вакцины лишь отчасти эффективны, потому что они должны вводиться через зонд либо подмешиваться к воде или пище для животного. Введение через зонд является неэффективным, поскольку требует ручного введения вакцины. Эта процедура приводит к гибели многих цыплят. Добавление вакцины к пище или воде также неэффективно, поскольку свежевылупившиеся цыплята едят мало, поэтому борьба с заболеванием задерживается. В результате уменьшаются привесы и удлиняется период для достижения рыночного веса.

Для получения вакцины необходимо получить некоторое количество соответствующим образом очищенных инцистированных протозоа. Современные методы отделения и восстановления включают применение едких, опасных, токсичных материалов. Чтобы предотвратить воздействие на животного таких материалов, необходимо принимать определенные меры, например проводить тщательное промывание, чтобы удалить указанные материалы, что приводит к низкому выходу продукта. Обычный способ получения инцистированных протозоа включает получение их источника, такого как содержимое кишечника или фекалии инфицированных животных. Кишечную или фекальную массу необходимо отделить от инцистированных простейших, для чего применяют метод флотации. Такой метод включает флотацию или седиментацию в тяжелой среде, при этом в качестве тяжелой среды применяют раствор хлористого натрия (патент США 4863731) или сахарозы (патент США 5068104). Тяжелую среду применяют в виде водной смеси. К сожалению, применение водных смесей тяжелых сред оказывает побочное действие. Например, водные смеси хлористого натрия могут вызвать сильную коррозию оборудования.

До того, как инцистированные спорозоа станут инфекционно-способными, отделенные ооцисты должны быть спорулированы путем умеренного воздействия кислорода. Это воздействие осуществляют, помещая суспензию на встряхиваемый столик или барботируя воздух через суспензию ооцист. Для подавления любого нежелательного микробиального роста во время споруляции обычно применяют бихромат калия. Однако бихромат калия является опасным материалом. Его применение связано с проблемами при использовании и утилизации. Его удаление приводит к снижению выхода и повышению стоимости.

Конечная стадия отбеливания с применением гипохлорита натрия предназначена для устранения любого оставшегося органического материала и нежелательных микроорганизмов. Отбеленные инцистированные протозоа должны быть промыты, чтобы снизить концентрацию остаточного отбеливающего агента до приемлемого уровня. Промывание включает ряд стадий разбавления и извлечения ооцист, чтобы снизить содержание отбеливающего агента при получении концентрата ооцист. Конечный концентрат инцистированных протозоа превращают в вакцину в стерильных условиях. Каждая вакцина может включать различные виды протозоа, чтобы обеспечить максимальную защиту.

Существует потребность в более эффективном способе вакцинации, при котором применялась бы живая вакцина, дозированная в количестве, достаточном для генерирования иммунного ответа и создания иммунитета, однако достаточно небольшом, чтобы не вызвать острые симптомы. Например, яйцевая вакцина против кокцидиоза птиц может сократить сроки лечения и обеспечить более равномерную дозировку. Данный способ также может быть использован для сбора и получения вакцин человека для защиты от протозоа, включающих Cryptosporidium и Giardia lamblia. Такой способ включает метод флотации в некоррозионной плотной среде либо метод газовой флотации, полностью устраняющий применение соли. Такой усовершенствованный способ не включает применение опасного биоцида, такого как бихромат калия. Подобный альтернативный биоцид или окислитель также может служить отбеливающим агентом, устраняя еще одну стадию процесса и применение еще одного опасного соединения.

Настоящее изобретение предлагает способ очистки и выделения инцистированных протозоа, включая их отделение от суспензии, содержащей инцистированные протозоа, либо методом солевой флотации, в котором солью является такая соль, как сульфат натрия, сульфат магния, хлорид магния, хлорид кальция или их смеси, либо методом газовой флотации.

В соответствии с одним из вариантов выполнения изобретения для отделения инцистированных протозоа используют метод солевой флотации, причем солью является сульфат натрия. В соответствии с указанным вариантом данный способ предусматривает приготовление смеси, включающей инцистированные протозоа и сульфат натрия, центрифугирование полученной суспензии и выделение из нее надосадочной жидкости, образование разбавленного раствора указанной надосадочной жидкости, центрифугирование этого разбавленного раствора и выделение концентрата из центрифугированного разбавленного раствора. Указанный вариант также может включать гомогенизацию смеси посредством ее гомогенизирования с высокой интенсивностью. Сульфат натрия присутствует в смеси в количестве, составляющем от около 3 до около 30% мас. Кроме того, плотность разбавленного раствора может быть ниже плотности инцистированных протозоа. Концентрат содержит приблизительно от 1×10⁴ до 1,5×10⁶ инцистированных протозоа в 1 мл концентрата.

В соответствии с другим вариантом выполнения изобретения для отделения инцистированных протозоа используют метод газовой флотации. Данный метод предусматривает регулирование рН суспензии до уровня, обеспечивающего адгезию пузырьков газа в суспензии к инцистированным протозоа, кондиционирование суспензии с отрегулированной рН путем добавления достаточного количества поверхностно-активного агента для селективного покрытия частиц в суспензии и достаточного количества гетерополярного соединения для получения устойчивой пены, пропускание кондиционированной суспензии через по меньшей мере одну камеру газовой флотации и выделение инцистированных протозоа из указанной камеры. Подходящие для этой цели газы включают воздух. При использовании (в качестве газа) воздуха рН может составлять от около 2,5 до около 3,5. Поверхностно-активные соединения упомянутого агента включают натриевую соль кислого сульфата с длинноцепочечным алкилом, четвертичное аммониевое основание, смесь жирного ацетата аммония и 2-этилгексанола, соединение сложного эфира/амида, алкоксиполиэтилен-оксиэтанол, а также их смеси. Гетерополярные соединения включают амиловые спирты, бутиловые спирты, терпинолы, крезолы, а также их смеси. Подходящий расход газа в газовой флотационной камере составляет от около 0,25 до около 1,1 объемов газа на один объем суспензии в минуту. В соответствии с предпочтительным вариантом газовая флотационная камера включает по меньшей мере два последовательных газовых флотационных узла, причем данные узлы могут иметь различные скорости расхода газа.

Настоящее изобретение также предлагает способ споруляции ооцист, предусматривающий образование водной суспензии ооцист с водой и перекисью водорода, в которой перекись водорода присутствует в количестве, достаточном для предотвращения нежелательного микробиологического роста, а также аэрацию водной суспензии для споруляции ооцист. Водная суспензия может аэрироваться в течение периода более чем около 40 часов в следующих условиях: водная суспензия во время аэрации имеет содержание растворенного кислорода более чем около 80% от уровня насыщения, при температуре от около 22 до около 32°С, возможно при перемешивании, достаточном для адекватного суспендирования всех твердых веществ. В этом варианте водная суспензия может иметь концентрацию ооцист от около 10⁴ до около 10⁶ ооцист/мл и концентрацию перекиси водорода от около 1000 до около 20000 мг/л.

В соответствии со следующим объектом изобретения предлагается способ очистки, выделения и споруляции ооцист, включающий отделение ооцист от первой суспензии, содержащей ооцисты, а также споруляцию отделенных ооцист способами по изобретению. Подходящими ооцистами являются Eimeria maxima, Eimeria mitis, Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria brunetti, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, а также их смеси. В соответствии с одним из вариантов отделение ооцист производят методом флотации с использованием сульфата натрия, включающим получение смеси, содержащей ооцисты и сульфат натрия, центрифугирование полужидкой массы и выделение из нее надосадочной жидкости, образование разбавленной надосадочной жидкости, ее центрифугирование и выделение концентрата из центрифугированной разбавленной жидкости.

В еще одном варианте отделение ооцист осуществляют методом газовой флотации, включающим регулирование рН первой суспензии до уровня, достаточного для адгезии пузырьков газа в суспензии и инцистированных протозоа, кондиционирование суспензии с отрегулированной рН путем добавления достаточного количества поверхностно-активного соединения для селективного покрытия частиц в суспензии и достаточного количества гетерополярного соединения для получения устойчивой пены, пропускание кондиционированной суспензии через по меньшей мере одну газовую флотационную камеру и выделение инцистированных протозоа из указанной камеры. Данный вариант также может включать добавление отбеливающего агента к спорулированным ооцистам в количестве, достаточном для инактивации остаточных микроорганизмов, удаления остаточных органических веществ и отбеливания спорулированных ооцист. В варианте отбеливание проводят одновременно со споруляцией, при этом отбеливающим агентом служит перекись водорода. В другом варианте отбеливающим агентом является гипохлорит натрия, присутствующий в количестве от около 5000 до около 10000 частей на миллион (ppm) свободного доступного хлора, озон, присутствующий в количестве до около 3% в воздухе, и их комбинации.

Данный способ может также включать промывание отбеленных ооцист мембранной фильтрацией с поперечным потоком для снижения концентрации остаточного отбеливающего агента до приемлемого уровня. В еще одном варианте отбеливающим агентом является гипохлорит натрия, присутствующий после промывки в концентрации, достаточной для подавления роста остаточных микробов, при этом отбеленная и промытая суспензия ооцист имеет концентрацию от около 1×10⁵ до около 2,5×10⁶ ооцист/мл, максимальный размер твердых частиц, составляющий менее чем около 200 микрон, и содержит сульфат натрия, присутствующий в достаточно малом количестве, чтобы не оказывать влияния на жизнеспособность и инфекционность цист или ооцист, предпочтительно менее чем около 3% и еще предпочтительнее менее чем около 0,9%. Данный способ может также включать концентрирование отбеленных и промытых ооцист в виде стерильного концентрата, объединение стерильных концентратов одного или нескольких видов ооцист в один общий концентрат, а также упаковку общего концентрата в стерильных условиях.

Краткое описание чертежей

Фиг.1А - технологическая схема, иллюстрирующая варианты первой части способа по изобретению;

фиг.1В - технологическая схема, иллюстрирующая варианты второй части способа по изобретению;

фиг.2 - график, показывающий концентрацию ооцист против концентрации сульфата натрия,

фиг.3 - график, показывающий процент споруляции против времени после сбора цист.

Подробное описание изобретения

Данный способ предусматривает получение концентрата цист или спорулированных ооцист, применяемого при производстве вакцины. Конкретно данный способ предусматривает получение концентрата спорулированных ооцист кокцидиоза птиц, применяемого при производстве яйцевых вакцин против кокцидиоза. Получение подходящей и приемлемой вакцины требует проведения многостадийного процесса обработки, включающего большое количество отдельных процессов. Как показано на фиг.1А и 1В, способ получения вакцины может включать отбор суспензии инцистированных протозоа, гомогенизирование суспензии, отделение инцистированных протозоа от суспензии солевой или газовой флотацией; если требуется, спорулирование инцистированных протозоа, отбеливание спорулированных инцистированных протозоа, промывание отбеленного продукта, концентрирование инцистированных протозоа, объединение концентратов различных инцистированных протозоа и стерильное заполнение (упаковок) с получением вакцины. Указанные стадии описаны более подробно ниже.

Инцистированные протозоа, включающие цисты и ооцисты, могут быть получены из различных источников, включающих очищенные суспензии, содержимое кишечника и фекальные суспензии. Особенно при получении инцистированных протозоа из фекалий суспензии или водные смеси могут включать значительное количество нежелательных суспендированных твердых веществ. Например, суспензии могут включать от около 1 до около 20 мас.% твердых веществ или фекалий. Суспензия предпочтительно включает от около 5 до около 20 мас.% твердых веществ при использовании солевой флотации и около 1 мас.% при использовании газовой флотации. Чтобы освободить цисты от связанных органических веществ, суспензия должна быть подвергнута гомогенизации. Продолжительность гомогенизации может составлять от более чем около 0 до около 5 минут, предпочтительно 1 минуту, в зависимости от интенсивности гомогенизации. Условия гомогенизации должны быть достаточно интенсивными для освобождения цист и ооцист и достаточно умеренными для предотвращения их разрушения.

Инцистированные протозоа должны быть отделены от указанной первой суспензии, выделяя при этом предпочтительно по меньшей мере 70% инцистированных протозоа и по меньшей мере 80% выбрасываемых твердых веществ. Обычно это отделение приводит к получению концентрации от около 1×10⁴ до около 1,5×10⁶ инцистированных протозоа/мл. Отделение может быть осуществлено посредством солевой или газовой флотации.

При использовании солевой флотации приготавливают смесь неочищенных инцистированных протозоа и соли. Подходящие солевые растворы включают плотные (насыщенные) растворы водорастворимых солей, включая хлориды, сульфаты, фосфаты, нитраты и ацетаты аммония, натрия, калия, кальция, магния и цинка. Подходящие сильно водородносвязанные органические вещества включают мочевину и соли гуанидина. Указанные соли предпочтительно включают сульфат натрия, хлорид натрия, сульфат магния, хлорид магния, хлорид кальция, а также их смеси. Более предпочтительно соль представляет собой сульфат натрия. Данные соли обладают тем преимуществом, что они значительно меньше коррелируют оборудование. Соль добавляют в количестве, достаточном для обеспечения разницы между плотностью инцистированных протозоа и смеси. Плотность протозоа предпочтительно ниже плотности смеси. Соль присутствует в количестве от около 3 до около 30 мас.%, предпочтительно от около 14 до около 20 мас.%, более предпочтительно около 20 мас.%.

Затем смесь подвергают центрифугированию и собирают надосадочную жидкость и концентрат. В зависимости от свойств смеси инцистированные протозоа могут содержаться в надосадочной жидкости или концентрате. Смесь центрифугируют с ускорением от около 3000 до около 15000 g, предпочтительно 12000 g, в течение времени, необходимого для адекватного отделения инцистированных протозоа, обычно около 10 минут. При использовании 20% раствора сульфата натрия инцистированные протозоа содержатся в надосадочной жидкости, поэтому указанную жидкость собирают, а осадок направляют на утилизацию. Как показано на фиг.2, 20% концентрация сульфата натрия обеспечивает высокую концентрацию инцистированных протозоа (в данном случае ооцист) в надосадочной жидкости (продукт) и всего лишь небольшое количество инцистированных протозоа в осадке (отходах). Разбавленный раствор получают, добавляя воду к выделенной надосадочной жидкости. Данную жидкость разбавляют таким образом, чтобы плотность инцистированных протозоа стала выше плотности разбавленного раствора. Вследствие этого инцистированные протозоа будут осаждаться в разбавленном растворе. При 20% концентрации сульфата натрия отношение массы разбавленного раствора к массе надосадочной жидкости составляет приблизительно от 4 до 8.

Разбавленный раствор затем центрифугируют во второй раз при условиях центрифугирования, сравнимых с условиями при первом центрифугировании, таким образом, чтобы остаточная концентрация соли составила менее чем около 10 мас.%, предпочтительно менее около 1 мас.%, а полученная концентрация цист составила от около 10⁴ до около 10⁶ цист/мл, что составляет от около 80 до около 95% выделения. Удаление твердых остатков органических веществ предпочтительно составляет от около 90 до около 99%. В соответствии с данным вариантом инцистированные протозоа выделяют из концентрата, а надосадочную жидкость направляют на утилизацию.

В соответствии с другим вариантом изобретения отделение инцистированных протозоа осуществляют методом газовой флотации. Предпочтительно газ представляет собой воздух, хотя может быть использован любой газ, включая кислород и азот. При использовании газовой флотации рН суспензии доводят до уровня, достаточного для создания адгезии пузырьков газа в суспензии и инцистированных протозоа путем изменения химии поверхности инцистированных протозоа. рН обычно доводят до величины от около 2 до около 9, предпочтительно от около 2,5 до около 3,5, более предпочтительно около 3.

Суспензию с отрегулированной рН дополнительно кондиционируют, добавляя поверхностно-активное соединение, иногда называемое «собирающим соединением», и гетерополярное соединение, иногда называемое «пенообразующим соединением». Поверхностно-активное соединение, также называемое «селективным детергентом, увлажняющим агентом или эмульгатором», добавляют в количестве, достаточном, чтобы обеспечить контакт между определенными твердыми веществами и пузырьками газа, образуя тонкую пленку на всплывающих частицах и делая данные частицы гидрофобными, не образуя пленки на других частицах. Поэтому в результате выбора поверхностно-активного соединения могут быть определены всплывающие частицы. Поэтому инцистированные протозоа могут быть собраны в результате применения метода газовой флотации, при котором они всплывают, либо применения метода обратной флотации, при котором всплывают удаляемые твердые вещества. Подходящие поверхностно-активные агенты включают натриевую соль кислого сульфата с длинноцепочечным алкилом, четвертичное аммониевое основание, смесь жирного ацетата аммония и 2-этилгексанола, соединение сложного эфира/амида, алкоксиполиэтиленоксиэтанол, а также их смеси. Поверхностно-активным соединением предпочтительно является лаурилсульфат натрия. Указанное соединение должно присутствовать в количестве приблизительно от 0,5 до 2 фунтов (от 0,227 до 0,907 кг) на тонну твердых веществ в кондиционированной суспензии, предпочтительно 0,5 фунтов (0,227 кг) на тонну твердых веществ. Альтернативно, поверхностно-активное соединение может быть представлено приблизительно 0,5 фунтами (0,227 кг) додециламина на тонну твердых веществ, подкисленного соляной кислотой до получения нейтральной рН, либо приблизительно 0,5 фунтами (0,227 кг) калиевой соли олеиновой кислоты на тонну твердых веществ.

Гетерополярные соединения выбирают за их способность изменять поверхностное натяжение воды и образовывать устойчивую пену. Обычно данные гетерополярные соединения содержат одну или несколько углеводородных групп, прикрепленных к одной полярной группе, при этом углеводородный радикал имеет свыше 5 или 6 атомов углерода. Подходящие гетерополярные соединения включают амиловый и бутиловый спирты, терпинолы, крезолы, а также их смеси. Гетерополярным соединением предпочтительно является метилизобутилкарбинол (MIBC), также называемый «метиламиловым спиртом», а еще точнее называемый «4-метилпентанол,-2». Гетерополярное соединение присутствует в количестве, достаточном для получения устойчивой пены. Гетерополярное соединение предпочтительно присутствует в количестве, составляющем приблизительно до 2,0 фунтов (0,908 кг) на тонну твердых веществ, более предпочтительно приблизительно от 0,5 до 2,0 фунтов (от 0,227 до 0,908 кг) на тонну твердых веществ, наиболее предпочтительно около 0,5 фунтов (0,227 кг) на тонну твердых веществ.

Кондиционированную суспензию пропускают через газовую флотационную камеру и выделяют инцистированные протозоа. В зависимости от рН выбранных поверхностно-активного и гетерополярного соединений инцистированные протозоа могут флотироваться или остаться в суспензии. Предпочтительно, инцистированные протозоа флотируются. Процесс газовой флотации проводят в течение периода времени и при скорости потока воздуха, достаточных для выделения от около 20 до около 100%, обычно около 85% инцистированных протозоа, отбраковывая приблизительно от 20 до 90%, обычно 70% твердых остатков органических веществ. Процесс газовой флотации проводят в течение периода времени, составляющего от около 3 минут до более чем около 10 минут, предпочтительно около 10 минут. Скорость потока газа в газовой флотационной камере составляет от около 0,25 до около 1,1 объемов газа на объем раствора в минуту, предпочтительно от около 0,25 до около 0,83, более предпочтительно от около 0,25 до около 0,75 объемов газа на объем раствора в минуту. Газовая флотационная камера может включать несколько последовательных флотационных узлов. Газовая флотационная камера предпочтительно включает по меньшей мере два последовательно установленных флотационных узла. Флотационные узлы предпочтительно представляют собой газовые флотационные колонны. Скорость потока газа в последовательных флотационных узлах может быть одинаковой или различной. Потоки газа предпочтительно имеют различную скорость, например, около 0,47 объемов газа на объем раствора в минуту в колонне высотой 32 дюйма (81,28 см) и диаметром 2 дюйма (5,08 см) и около 0,27 объемов газа на объем раствора в минуту в колонне высотой 60 дюймов (152,40 см) и диаметром 2 дюйма (5,08 см).

Если инцистированные протозоа представляют собой ооцисты (инцистированные споровики), то эти ооцисты спорулируют. Как показано на фиг.3, споруляцию следует проводить как можно скорее после сбора ооцист, предпочтительно ооцисты должны спорулироваться в течение 3 дней после их сбора. Приготавливают водную суспензию ооцист и оксиданта или биоцида и ее подвергают аэрации в течение времени, достаточного для споруляции ооцист. При использовании для отделения ооцист метода солевой флотации концентрация соли во время споруляции должна быть ниже чем около 10 мас.%, предпочтительно ниже чем около 2 мас.% и еще более предпочтительно ниже чем около 1 мас.%. Концентрация цист во время споруляции предпочтительно составляет от около 10⁴ до около 10⁶ ооцист/мл, более предпочтительно около 10⁵ ооцист/мл. Ооцисты должны быть спорулированы в течение от около 1 до около 24 часов после выделения очищенного концентрата цист. рН водной суспензии должна составлять от около 5,0 до около 7,0, предпочтительно от около 5,2 до около 6,8. Температура водной суспензии в одном из вариантов изобретения составляет от около 20 до около 33°С, предпочтительно от около 22 до около 32°С, более предпочтительно от около 25 до около 29°С и наиболее предпочтительно около 25°С. Скорость аэрации в соответствии с одним из вариантов составляет от около 0,1 до около 10 объемов газа на объем раствора в минуту, предпочтительно от около 0,1 до около 2,0 объемов газа на объем раствора в минуту. В целом степень (интенсивность) перемешивания должна быть достаточной для полного суспендирования всех твердых веществ во время споруляции, но недостаточно высокой для повреждения ооцист. Это может происходить в результате аэрации, встряхивания, перемешивания, а также сочетания данных процедур. Например, при использовании перемешивания оно должно быть достаточным, чтобы удерживать суспендированные твердые вещества в суспензии, но недостаточно сильным, чтобы разрушить цисты или ооцисты. Подходящее перемешивание в емкости диаметром 6 дюймов (15,24 см) может быть осуществлено при скорости от около 121 до около 204 об/мин, предпочтительно от около 197 до около 200 об./мин., более предпочтительно около 200 об/мин. Содержание растворенного кислорода необходимо поддерживать на уровне, обеспечивающем споруляцию ооцист, предпочтительно около 80% концентрации насыщения при заданной температуре. Продолжительность споруляции может составлять до около 72 часов, предпочтительно от около 40 до около 72 часов и еще более предпочтительно от около 48 до около 50 часов.

Оксидант добавляют в количестве, достаточном для инактивации нежелательного роста микробов в водной суспензии. Подходящие оксиданты или биоциды включают перекись водорода, озон, бихромат калия, хлор, а также их сочетания. В одном из вариантов изобретения оксидант представляет собой бихромат калия и присутствует в количестве около 2,5% об./мас. В соответствии с предпочтительным вариантом оксидант представляет собой перекись водорода, присутствует в количестве от около 1000 до около 20000 мг/л, предпочтительно около 5000 мг/л. Использовать перекись водорода проще и дешевле, причем в результате ее применения смягчается проблема образования опасных и нежелательных побочных продуктов.

Аэрация может быть осуществлена путем встряхивания на вибростоле или путем воздушного барботирования в баке для споруляции (например, в резервуаре ферментера). Аэрацию предпочтительно проводят барботированием воздухом, поскольку можно обеспечить больший массоперенос газа, таким образом обеспечивая сокращение продолжительности споруляции и размер необходимого оборудования.

При желании после споруляции ооцисты могут быть промыты, чтобы снизить остаточную концентрацию оксиданта до приемлемого уровня. Перекись водорода обладает тем преимуществом, что позволяет избежать данной стадии. Промывание может быть осуществлено путем последовательных промывок предпочтительно мембранной фильтрацией и еще более предпочтительно диафильтрацией. При использовании мембранной фильтрации выбирают такой размер мембраны, чтобы обеспечить прохождение через нее растворенных веществ и не допустить прохождения ооцист с одной стороны мембраны на другую. В соответствии с одним из вариантов изобретения промывку осуществляют водой при трансмембранном давлении, составляющем до около 30 фунтов на кв. дюйм (2,1093 кг/см²), предпочтительно от около 20 (1,4062 кг/см²) до около 25 фунтов на кв. дюйм (1,7578 кг/см²), скорости поперечного потока, составляющей до около 10 м/сек, предпочтительно около 2 м/сек, и потоке сквозь мембрану, составляющем до около 10 л/мин/м², предпочтительно около 3 л/мин/м².

Ооцисты могут быть подвергнуты отбеливанию с целью инактивирования остаточных микроорганизмов и устранения остаточных органических веществ. Вначале добавляют достаточное количество отбеливающего агента, а затем ооцисты подвергают отбеливанию или контакту с отбеливающим агентом в течение достаточного периода времени. Ооцисты могут быть подвергнуты отбеливанию в течение периода до 1,5 часов. Подходящие отбеливающие агенты включают гипохлорит натрия, перекись водорода, озон, а также их смеси. Отбеливающий агент может вначале присутствовать в количестве, составляющем от около 2000 до около 20000 мг/л, предпочтительно от около 8000 до около 10000 мг/л, более предпочтительно 8000 мг/л. Отбеливающий агент не должен присутствовать в количестве, вызывающем коррозию применяемого оборудования. При использовании для споруляции перекиси водорода отбеливание и споруляцию можно проводить одновременно. При необходимости после отбеливания отбеленную суспензию промывают, чтобы снизить концентрацию остаточного оксиданта до приемлемого уровня. При использовании в качестве отбеливающего агента гипохлорита натрия приемлемый уровень составляет менее чем около 1 мг/л. Промывание может быть осуществлено в результате последовательных промывок или диафильтрации.

Отбеленная суспензия может быть сконцентрирована в стерильный концентрат, имеющий достаточно высокую концентрацию для действенной и эффективной обработки. Например, окончательно сконцентрированная суспензия инцистированных протозоа может включать частицы твердых веществ, имеющих максимальный размер ниже чем около 200 микрон, предпочтительно ниже чем около 25 микрон, содержание соли ниже около 0,9%, концентрацию свободного остаточного хлора, составляющую менее чем около 1 мг/л, но достаточную для сдерживания роста остаточных микробов, и концентрацию цист, составляющую от около 1×10⁶ до около 2,5×10⁶ цист/мл.

Если в одной вакцине требуется использовать несколько разных или разных видов одного рода инцистированных протозоа в виде общей вакцины, стерильные концентраты различных видов объединяют в один стерильный концентрат. Например, инцистированные протозоа могут представлять собой ооцисты кокцидиоза птиц, включающие Eimeria maxima, Eimeria mitis, Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria brunetti, Eimeria necatrix, Eimeria praecox и их смеси, включающие различные штаммы каждого из них. Наконец, объединенные концентраты фасуют и упаковывают в стерильных условиях, и вакцина готова.

Несмотря на вышеприведенное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, понятно, что данный способ может использоваться для получения других вакцин для многих видов животных, а также для людей. Фактически данный способ может быть использован для иммунизации людей против типичных водных протозоа, таких как Cryptosporidium и Giardia lamblia. Кроме того, несмотря на вышеприведенное полное описание способа выделения, отдельные его процессы могут применяться независимо или в виде составной части иных схем выделения, мониторинга или обработки без отхода от объема и существа настоящего изобретения.

1. Способ очистки и выделения инцистированных протозоа, предусматривающий их отделение от суспензии, содержащей инцистированные протозоа, методом солевой флотации, в котором соль включает сульфаты, фосфаты или ацетаты аммония, натрия, калия, кальция или магния, водородносвязанные органические соединения, соли гуанидина или их смеси, причем метод солевой флотации включает:

приготовление смеси, включающей инцистированные протозоа и указанную соль,

центрифугирование полученной суспензии и выделение из нее надосадочной жидкости,

разбавление надосадочной жидкости и центрифугирование разбавленной жидкости и

выделение концентрата из центрифугированной разбавленной жидкости.

2. Способ по п.1, в котором указанная соль включает соль, выбранную из группы, состоящей из сульфата натрия, сульфата калия, сульфата магния, фосфата натрия, фосфата калия, фосфата магния, ацетата натрия, ацетата калия, ацетата магния и их смесей.

3. Способ по п.2, в котором указанная соль включает сульфат натрия.

4. Способ по п.2, в котором указанная соль включает сульфат магния.

5. Способ по любому из пп.1-4, дополнительно предусматривающий гомогенизацию смеси высокоинтенсивным гомогенизированием.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором соль присутствует в смеси в количестве от около 3 до около 30 мас.%.

7. Способ по любому из пп.1-6,. в котором плотность разбавленной жидкости меньше плотности инцистированных протозоа.

8. Способ по любому из пп.1-7, в котором концентрат содержит от около 1×10⁴ до около 1,5×10⁶ инцистированных протозоа/мл.

9. Способ по любому из пп.1-8, в котором инцистированные протозоа являются ооцистами Eimeria.

10. Способ по п.9, в котором указанные ооцисты выбирают из группы, состоящей из ооцист Eimeria maxima, Eimeria mitis, Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria bruetti, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, и их сочетаний.

11. Способ споруляции ооцист, предусматривающий образование водной суспензии ооцист с водой и перекисью водорода, причем перекись водорода присутствует в количестве, достаточном для устранения нежелательного микробиологического роста, при исходной концентрации перекиси водорода в суспензии от около 1000 до около 20000 мг/л, и спорулирование ооцист.

12. Способ по п.11, дополнительно предусматривающий аэрацию водной суспензии.

13. Способ по п.11 или 12, в котором указанные ооцисты являются ооцистами Eimeria.

14. Способ по п.13, в котором ооцисты Eimeria выбирают из группы, состоящей из Eimeria maxima, Eimeria mitis, Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria bruetti, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, и их сочетаний.

15. Способ по любому из пп.11-14, в котором водную суспензию дополнительно инкубируют в течение периода более чем около 40 ч, причем во время инкубирования водная суспензия имеет уровень растворенного кислорода более чем около 80% уровня насыщения при температуре от около 22 до около 32°С, с интенсивностью перемешивания, достаточной для адекватного суспендирования всех твердых веществ.

16. Способ по любому из пп.11-15, в котором водную суспензию инкубируют в течение периода до около 72 ч.

17. Способ по п.16, в котором водную суспензию инкубируют в течение периода от около 40 до около 72 ч.

18. Способ по любому из пп.11-17, в котором водная суспензия имеет концентрацию ооцист от около 10⁴ до около 10⁶ ооцист/мл.

19. Способ очистки, выделения и споруляции ооцист, предусматривающий отделение ооцист от первой суспензии, содержащей ооцисты, и спорулирование отделенных ооцист способом по любому из пп.11-18.

20. Способ по п.19, в котором ооцисты являются ооцистами Eimeria.

21. Способ по п.20, в котором ооцисты Eimeria выбирают из группы, состоящей из ооцист Eimeria maxima, Eimeria mitis, Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria bruetti, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, и их сочетаний.

22. Способ по любому из пп.19-21, в котором отделение ооцист осуществляют методом солевой флотации.

23. Способ по п.22, в котором метод солевой флотации предусматривает приготовление смеси, содержащей ооцисты и соль, центрифугирование полученной суспензии и выделение из нее надосадочной жидкости, разбавление надосадочной жидкости и центрифугирование разбавленной жидкости и выделение концентрата из центрифугированной разбавленной жидкости.

24. Способ по п.22 или 23, в котором указанная соль включает соль, выбранную из группы, состоящей из сульфата натрия, сульфата калия, сульфата магния, фосфата натрия, фосфата калия, фосфата магния, ацетата натрия, ацетата калия, ацетата магния, и их смесей.

25. Способ по п.24, в котором указанная соль включает сульфат натрия.

26. Способ по п.24, в котором указанная соль включает сульфат магния.

27. Способ по любому из пп.19-26, дополнительно предусматривающий добавление отбеливающего агента к спорулированным ооцистам в количестве, достаточном для инактивации остаточных микроорганизмов и удаления остаточных органических веществ, и отбеливание спорулированных ооцист.

28. Способ по п.27, в котором отбеливающим агентом является перекись водорода, гипохлорит натрия, озон или их смесь.

29. Способ по п.28, в котором отбеливающий агент представляет собой перекись водорода, а отбеливание осуществляют одновременно со спорулированием.

30. Способ по п.28, в котором отбеливающий агент представляет собой

а) гипохлорит натрия в количестве от около 5000 до около 10000 частей на миллион свободного доступного хлора, или

b) озон в количестве до около 3% в воздухе, или

c) перекись водорода в количестве от около 2000 до около 20000 мг/л, или

d) комбинацию а) и b).

31. Способ по любому из пп.27-30, дополнительно предусматривающий промывание отбеленных ооцист посредством мембранной фильтрации с поперечным потоком для снижения концентрации остаточного отбеливающего агента до приемлемого уровня.

32. Способ по п.31, в котором отбеленная и промытая суспензия имеет концентрацию ооцист от около 1×10⁶ до около 2,5×10⁶ ооцист/мл, максимальный размер твердых частиц менее чем около 200 мкм и содержание соли менее чем около 0,9%.

33. Способ по п.31 или 32, дополнительно предусматривающий концентрирование отбеленных и промытых ооцист с получением стерильного концентрата, объединение стерильных концентратов одного или более видов ооцист в общий концентрат и упаковку общего концентрата в стерильных условиях.