Клеточный микрочип и его применение в способе исследования живых клеток

Изобретение относится к области биотехнологии. Микрочип представляет собой совокупность гелевых микроячеек на подложке из стекла, металла, полимера, керамики или композитного материала, внутри которых находятся иммобилизованные прокариотические или эукариотические клетки. Микроячейки с иммобилизованными клетками формируют с помощью гелеобразующего раствора, включающего глицерин. Клеточный микрочип используют для исследования живых клеток. Для этого клеточный микрочип инкубируют в присутствии маркера, регистрируют сигнал, например флуоресценцию клеток, и по сигналу оценивают жизнедеятельность клеток микрочипа. Использование микрочипа сохраняет жизнеспособность клеток, упрощает способ исследования живых клеток. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил.

 

Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биологии, микробиологии и биотехнологии и касается способа изготовления микрочипов на основе клеток, иммобилизованных в его элементах. Такие микрочипы могут найти применение в молекулярной и клеточной биологии, биотехнологии, микробиологии, при определении антимикробной активности антибиотических препаратов в экспериментальной фармакологии, при исследовании окружающей среды, в медицине и для других приложений. Описывается способ изготовления микрочипа, в гелевых элементах которого иммобилизованы прокариотические или эукариотические клетки. Микрочип изготавливается путем полимеризации гелеобразующего раствора, содержащего иммобилизуемые клетки. Причем гелеобразующие растворы перед полимеризацией наносят на подложку в виде микрокапель.

Уровень техники

Известен ряд методов анализа наследственных признаков, закономерностей роста и развития и прочих свойств прокариотических и эукариотических клеток. В частности, существует группа методов мониторинга жизнедеятельности клеток в условиях воздействия на них различных факторов.

Для получения данных о развитии бактериальной популяции наиболее распространены методы:

1. регистрации оптической плотности бактериальной суспензии;

2. подсчета колоний на твердой среде [C.E.Clifton. Introduction to bacterial physiology. 1957];

3. подсчета числа клеток в камере Petroff-Hauser [C.E.Clifton. Introduction to bacterial physiology. 1957];

4. проточной цитометрии [H.B.Steen. Flow cytometry of bacteria: glimpses from the past with a view to the future. J. of Microbiological Methods 42 (2000) 65-74].

Однако методы 1,2 и 3 довольно трудоемки, требуют значительного участия исследователя, часто не позволяют проводить параллельный анализ нескольких образцов, обладают низким потенциалом для автоматизации, следовательно, затратны по времени и стоимости. Проточная цитометрия - высокоавтоматизированный метод, позволяющий быстро получать данные при минимальных усилиях со стороны исследователя. Однако, помимо того, что проточные цитометры и расходные материалы к ним имеют высокую стоимость, этот метод предназначен более для многопараметрического скрининга, чем для наблюдений одного или нескольких параметров в динамике.

Клетки, как многокомпонентные биокаталитические системы, используются в биосенсорах для анализа окружающей среды [Simonian A.L. et al. A biosensor for L-proline determination by use of immobilized microbial cells. / Appl. Biochem, Biotechnol. 1992 Sep;36(3):199-210; Rainina E.I. The development of a new biosensor based on recombinant E.coli for the direct detection of organophosphorus neurotoxins. / Biosens. Bioelectron. 1996;11(10):991-1000]. Однако методы, использующие подобные биосенсоры, позволяют определять одномоментно незначительное число (чаще -один) загрязнителей окружающей среды. Биосенсоры на основе ферментов [Simonian A.L. et al. A tryptophan-2-monooxygenase based amperometric biosensor for L-tryptophan determination: use of a competitive inhibitor as a tool for selectivity increase. /Biosens. Bioelectron 1997; 12(5):363-71] в большинстве своем обладают тем же недостатком.

Методом определения активности противомикробных препаратов в отечественной фармакопее является метод диффузии антибиотиков в агар путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов [Государственная фармакопея СССР: Вып.2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье/ МЗ СССР. - М.: Медицина, 1989]. Он обладает недостатками, указанными выше для методов 1, 2 и 3.

Известный метод выявления чувствительности микроорганизмов к антибиотикам - метод серийных разведении - состоит в регистрации наличия (или отсутствия) роста культуры в ряде пробирок с жидкой питательной средой, содержащих серию концентраций антибиотика. [Bryan L.E. Bacterial resistance and susceptibility to chemotherapeutic agents. Cambridge University press. Cambridge, London, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney, 1982]. Несмотря на высокую информативность, этот метод не нашел широкого применения в лабораторной диагностике по совокупности следующих недостатков:

- требует проведения пробы отдельно для каждой исследуемой культуры;

- требует большого количества расходных материалов (пробирок, плашек, антибиотиков и пр.);

- результат анализа может быть получен через 18-20 часов.

Кроме того, существующие рутинные методы определения резистентности бактерий к антибиотикам обладают общими недостатками, отмеченными выше для методов 1,2 и 3.

Выявление активности цитостатических и прочих фармацевтических препаратов по отношению к животным клеткам, на стадиях разработки, производства (текущий контроль) и применения (индивидуальный подбор) сопряжено с использованием следующих методов: МТТ-тест [Carmichael, J.. et al. (1987) Cancer Research 47: 936}, проточная цитометрия, ArrayScan™-цитометрия. Одним из серьезных недостатков МТТ-теста является высокая частота (до 30%) неудачных экспериментов, результаты которых не могут быть корректно интерпретированы. Недостатком двух других методов является высокая стоимость оборудования и расходных материалов.

Несмотря на наличие большого числа способов анализа свойств клеток и исследования различных объектов окружающей среды с помощью клеток, потребность в разработке новых, более совершенных сохраняется.

Задачей данного изобретения является разработка способа, который бы позволил:

1. упростить анализ признаков, закономерностей роста и развития и прочих свойств клеток прокариот и эукариот;

2. упростить мониторинг жизнедеятельности клеток в условиях воздействия на них различных факторов;

3. расширить возможности анализа объектов окружающей среды (вода, почва и пр.) на предмет наличия в них определенных химических веществ;

4. упростить определение активности антибиотических, цитостатических и других фармацевтических препаратов по отношению к клеткам прокариот и эукариот; что приведет к снижению стоимости описанных исследований, сокращению времени их проведения и трудоемкости.

Решение поставленных задач мы видим в применении технологии биологических микрочипов. А именно, биологического микрочипа на основе клеток (или т.н. клеточного микрочипа). В настоящее время известны способы изготовления биологических микрочипов на основе ДНК [патент РФ №2157385] и белков [Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A., Voloshchuk S., Chupeeva V., Mirzabekov A. Protein Microchips: Use for Immunoassay and Enzymatic Reactions. Analytical Biochemistry 278, 123-131 (2000)]. Однако точное перенесение существующей технологии их изготовления для создания клеточного микрочипа не представляется возможным, т.к. вышеуказанная технология предусматривает применение процессов, губительных для эукариот и большинства прокариот. Это полимеризация под действием ультрафиолетового облучения, контакт с органическим растворителем и пр.

Иммобилизация клеток в различных гелях широко освещена в научной литературе. Описаны способы иммобилизации прокариотических и эукариотических клеток в агарозе, альгинате [D.Roger, A.David, H.David (1996) Plant Physiol. 112: 1191-1199], акриламиде и других гелях [Н.С.Егоров, Н.С.Ландау, Е.А.Борман, И.Б.Котова (1984) Прикладная биохимия и микробиология, т.XX, вып.5, с.579-592]. Практически любой вид клеток может быть иммобилизован [D.Roger, A.David, H.David (1996) Plant Physiol. 112: 1191-1199].

Таким образом, поставленные задачи решаются в результате использования в способе исследования клеточного микрочипа.

Сущность изобретения

Одним из аспектов изобретения является клеточный микрочип, который представляет собой подложку, содержащую гелевые элементы, в которых иммобилизованы клетки. Основу гелевых элементов выбирают из группы, состоящей из акриламида, альгината, каррагенана, коллагена, фибрина, агара, агарозы, желатина, поливинилового спирта, производных кремниевой кислоты (например, силикагель) и т.д. Гелевый элемент клеточного микрочипа имеет размер пор, достаточный для проникновения питательных веществ и веществ, взаимодействие которых с клетками необходимо исследовать. Материал подложки клеточного микрочипа выбирают из группы, состоящей из стекла различных сортов, металлов, пластических материалов, керамических материалов, полимерных носителей (полиметилметакрилат, полистирол, полипропилен, и т.д.), любых композиционных материалов и т.д. Подложка представляет собой пластину, изготовленную и обработанную таким образом, чтобы удерживать на своей поверхности гелевые элементы микрочипа. Подложка клеточного микрочипа также может представлять собой пористую пластину, изготовленную и обработанную таким образом, чтобы удерживать в своем объеме гелевые элементы микрочипа. Клетки, иммобилизуемые в элементах клеточного микрочипа, могут быть представителями как эукариот, так и прокариот. Клеточный микрочип может быть применен в области создания биосенсоров, тестирования питательных сред, определения активности антибактериальных и цитостатических препаратов, для мониторинга развития популяции микроорганизмов в условиях воздействия на них различных факторов, выявления антибиотикочувствительности микроорганизмов, скрининга клонов при создании геномных библиотек, генодиагностики инфекций различной природы, а также других приложений.

Изобретением предлагается также способ исследования живых клеток на клеточном микрочипе, включающий инкубацию микрочипа, регистрацию флюоресцентного сигнала, обусловленного исследуемым свойством, с последующей его оценкой в сравнении с контролем.

Способ предполагает использование клеточного микрочипа, раскрываемого в данном изобретении.

Способ предполагает, что основу гелевого элемента клеточного микрочипа выбирают из группы, состоящей из акриламида, альгината, каррагенана, коллагена, фибрина, агара, агарозы, желатина, поливинилового спирта, производных кремниевой кислоты (например, силикагель), и т.д.

Кроме того, в способе используют микрочип, в котором гелевый элемент имеет размер пор, достаточный для проникновения питательных веществ и веществ, взаимодействие которых с клетками необходимо исследовать.

Далее, в способе материал подложки клеточного микрочипа выбирают из группы, состоящей из стекла различных сортов, металлов, керамических материалов, полимерных носителей (полиметилметакрилат, полистирол, полипропилен, и т.д.), любых композиционных материалов и т.д., и подложка клеточного микрочипа представляет собой пластину, изготовленную и обработанную таким образом, чтобы удерживать на своей поверхности гелевые элементы микрочипа, или подложка клеточного микрочипа представляет собой пористую пластину, изготовленную и обработанную таким образом, чтобы удерживать в своем объеме гелевые элементы микрочипа.

Способ характеризуется тем, что клетки, подлежащие иммобилизации, выбирают из группы эукариот или из группы прокариот, причем клетки находятся не обязательно в лиофилизированном состоянии.

Кроме того, в изобретении раскрывается способ изготовления микрочипа на основе клеток, иммобилизованных в геле, приготовленного путем полимеризации гелеобразующего раствора, содержащего иммобилизуемые клетки. Причем гелеобразующие растворы, содержащие взвесь клеток, наносят на подложку в виде микрокапель, после чего проводят полимеризацию.

Перечень фигур

На фигуре 1 схематически представлена инкубационная камера и цифрами обозначены: 1 - заглушки; 2 - кварцевое стекло; 3 - прокладка; 4 - микрочип.

На фигуре 2 графически представлена кинетика роста сигнала от ячеек бактериального микрочипа, инкубировавшегося в среде LB с ампицилином (50 мкг/мл), и где кривые цифрами обозначены: 1 - кривая от ячеек с Е.coli, устойчивыми к ампицилину; 2 и 3 - кривые от ячеек с E.coli, чувствительными к ампицилину.

На фигуре 3 представлен результат инкубации акриламидного микрочипа в среде с антибиотиком.

На фигуре 4 представлены результаты инкубации бактериального микрочипа в среде с антибиотиком, где цифрами 1 и 2 обозначены чувствительные штаммы, а цифрами 3 и 4 - устойчивые штаммы.

На фигуре 5 показаны гелевые элементы микрочипа после инкубации в питательной среде с антибиотиком (А - ячейка с чувствительной культурой, а Б - ячейка с устойчивой культурой).

Подробное раскрытие изобретения

1. Поверхность подложки предварительно обрабатывают таким образом, чтобы микрокапли геля после нанесения и полимеризации прочно удерживались на ней.

2. Готовят серию гелеобразующих растворов, содержащих соответствующие культуры микроорганизмов.

3. Процедура нанесения реализуется вручную, автоматическим микродозатором или иначе. Одинаковые по объему микрокапли геля наносят друг от друга на расстоянии, равном 1/2 их диаметра или большем.

4. Реакция полимеризации осуществляется надлежащим образом после нанесения.

5. Изготовленный микрочип может быть использован сразу, либо законсервирован.

А. Примером кратковременной консервации может служить хранение микрочипа в стерильном изотоническом растворе при 4°С.

Б. В случае долгосрочного хранения микрочипа на основе прокариот или дрожжей можно применить лиофильное высушивание или криоконсервацию при -50°С, -70°С готового микрочипа, либо использование лиофилизированных микроорганизмов на стадии изготовления микрочипа.

Применение полиакриламидного геля при изготовлении микрочипов на основе животных клеток неприемлемо, т.к. вызывает гибель 100% клеток. Наиболее подходящим для этой цели представляется альгинат. Проблема фиксации альгинатных гелевых элементов к поверхности подложки решается следующим образом. На поверхности стекла, обработанного Bind-Silane, формируется тонкий слой (5-10 мкм) полиакриламидного геля (аналогично [Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A., Voloshchuk S., Chupeeva V., Mirzabekov A. Protein Microchips: Use for Immunoassay and Enzymatic Reactions. Analytical Biochemistry 278, 123-131 (2000)], но вместо маски используется прозрачное кварцевое стекло), на который наносятся микрокапли альгината с клетками и полимеризуются в CaCl₂. При этом гелевые элементы прочно фиксируются к подложке. Более технологичным решением является нанесение микрокапель на химически модифицированную поверхность стекла. Для специалистов в области химии не составит особых затруднений найти способ химической пришивки альгината к поверхности стекла.

Нанесение гелеобразующих растворов осуществляют, как описано в патенте РФ №2157385. Предпочтительно для нанесения раствора в виде микрокапель использовать подающее устройство, позволяющее с высокой скоростью распределять микрообъемы большого числа растворов по плоской поверхности.

Предлагаемый способ позволяет в одну стадию нанести микрочип с высокой плотностью элементов матрицы, что необходимо для параллельных манипуляций с большим количеством клеток. Предлагаемый способ дает возможность использовать клеточные микрочипы в качестве биосенсора для анализа элементов окружающей среды (вода, почва и т.д.) на предмет наличия в них широкого спектра загрязнителей, мониторинга развития популяции микроорганизмов в условиях воздействия на них различных факторов, скрининга клонов при создании геномных библиотек, диагностики инфекций различной природы, тестирования активности антимикробных и цитостатических средств, влияния лекарственных препаратов на микрофлору кишчника (в случае иммобилизации представителей кишечной микрофлоры в элементах микрочипа), резистентности выделенных от пациента культур к антибиотикам и т.д.

В качестве подложки для микрочипа можно использовать предметное стекло. Оно обрабатывается реагентом, который модифицирует поверхность стекла ненасыщенными группами. Таким реагентом может являться, например Н-[3-(триэтоксисилил)пропил]акриламид, аллилтриэтоксисилан и другие. Для изготовления клеточного микрочипа на основе бактерий или дрожжей предпочтительно в качестве одного из мономеров использовать акриламид.

Далее, приводятся примеры изготовления и применения клеточных микрочипов на основе E.coli. Описание данных примеров не должно быть использовано для ограничения притязаний данного патента, оно лишь иллюстрирует возможность для специалистов в данной области осуществить изобретение.

Чтобы показать принципиальную возможность исследования свойств клеток при помощи микрочипа, выполнены модельные эксперименты по определению антибиотикорезистентности различных штаммов E.coli.

Пример 1

В эксперименте используются следующие штаммы: JM-109; DH5a, pBR 322, amp^r; BL21 (DE3) pLysS, chm^r; BL21 (DE3) pLysS, pET23b, chm^r amp^r. Приготавливают гелеобразующую смесь следующего состава: 5% акриламид-N,N'-метиленбисакриламид 19:1, 1×PBS (pH 7,2), 60% глицерин, 0,5% персульфат аммония и 10% (v/v) суспензия ночной культуры E.coli (приведена к оптической плотности OD₆₀₀=2 ОЕ) в питательной среде LB. Нанесение на поверхность стекла осуществляют вручную или на роботе (Arrayer GMS 417, Genetic Microsystems) пином ⊘500 или 375 мкм. Соответственно. Стекло предварительно обрабатывают Bind-Silane. Сформированную матрицу растворов помещают в сосуд известного объема и вносят в него TEMED из расчета 0,1-1 мкл/1 дм³ объема сосуда.

Выдерживают 3 мин. Полученный микрочип помещают в инкубационную камеру (фиг.1), которую заполняют жидкой питательной средой LB, содержащей один из антибиотиков и маркер нуклеиновых кислот в живых клетках SYTO 9. В процессе эксперимента температура в камере поддерживается на уровне 37°С, и каждые 5 мин регистрируется флуоресцентный сигнал от ячеек микрочипа. Результаты отражаются в виде кривых I_норм(t) (фиг.2), где I_норм - нормированная интенсивность флуоресцентного сигнала. Наблюдается яркий сигнал от ячеек, содержащих штаммы, устойчивых к антибиотику бактерий, и сигнал, близкий к фоновому от ячеек со штаммами чувствительных бактерий, что отражено на фиг.3.

Характерный экспоненциальный рост сигнала происходит в результате размножения устойчивых к антибиотику бактерий в ячейках микрочипа и накопления ими флуоресцентного красителя, содержащегося в питательной среде (кривая 1 на фиг.2). При этом в гелевой ячейке образуются отдельные колонии. Сигнал от ячеек с чувствительными к антибиотику микроорганизмами практически не увеличивается (кривые 2,3 на фиг.2). На фиг.3 представлено изображение микрочипа в конце эксперимента. Для регистрации сигнала используется оборудование, состоящее из люминесцентного микроскопа, CCD-камеры и персонального компьютера с соответствующим програмным обеспечением [1. A-Д.Мирзабеков (1992) Биоорганическая химия Т.32, №10-11, с.1361-1374; 2. A.D.Mirzabekov (1994) Tibtech January (vol.12)]. Данный пример показывает возможность применения акриламидного геля для изготовления микрочипа на основе прокариот.

Пример 2

Микрокапли гелеобразующей смеси, находящейся при 37°С и содержащей 3% легкоплавкой агарозы, 25% глицерина и 5% (v/v) суспензию ночной культуры Е.coli, наносились на стеклянную подложку, покрытую тонким слоем (20 мкм) полиакриламидного геля и охлажденную до 0°С. При этом образовывались агарозные гелевые элементы, прочно закрепленные на подложке. Дальнейший ход эксперимента аналогичен описанному в Примере 1. Результаты приведены на фиг.4. Данный пример иллюстрирует возможность использования агарозы в качестве гелевой основы элементов микрочипа.

Пример 3

Приводимый пример иллюстрирует возможность применения клеточного микрочипа в качестве альтернативы методу серийных разведении [Bryan L.E. Bacterial resistance and susceptibility to chemotherapeutic agents. Cambridge University press. Cambridge, London, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney, 1982].

Приготавливается гелеобразующая смесь следующего состава: 5% акриламид-N,N'-метиленбисакриламид 19:1, 1×PBS (pH 7,2), 60% глицерин, 0,5% персульфат аммония. Бактериальные культуры, выделенные у пациентов, предварительно выращиваются на твердой среде. Все интересующие колонии отбирают петлей и вносят в отдельные пробирки с гелеобразующим раствором, тщательно суспендируют. Автоматическим микродозатором отбирают по 0,1-0,2 мкл из каждой пробирки и в определенном порядке наносят на предметное стекло, обработанное Bind-Silane. Полимеризуют в парах TEMEDa (см. Пример 1). Количество изготавливаемых микрочипов определяется числом антибиотиков, чувствительность к которым необходимо проверить и колличеством разведении этих антибиотиков. На каждый микрочип наносят каплю (покрывающую все элементы) жидкой среды LB, содержащей определенную концентрацию одного из антибиотиков. Микрочипы помещаются во влажную камеру и инкубируются 3-4 часа при 37°C. Регистрацию результатов осуществляют следующим образом. Микрочипы промывают водой, помещают под микроскоп (400^х) и оценивают наличие колоний в каждой ячейке микрочипа (фиг.5А). Отсутствие колоний в ячейке (фиг.5Б) свидетельствует об эффективности данного антибиотика в данной концентрации в отношении данной культуры.

Как следует из описания заявки, специалисты в данной области без особых трудностей смогут найти усовершенствования предложенного изобретения, которые тоже подпадают под его объем, который отражен в формуле изобретения.

Источники и публикации, перечисленные в описании, являются неотъемлемой его частью, как если бы все их содержание было включено в описание.

1. Клеточный микрочип, представляющий собой совокупность гелевых микроячеек на подложке, внутри которых находятся иммобилизованные живые клетки, при этом микроячейки с иммобилизованными живыми клетками формируют путем нанесения на подложку микрокапель гелеобразующего раствора, включающего глицерин.

2. Клеточный микрочип по п.1, отличающийся тем, что гелеобразующий раствор приготовлен на основе акрилатов, в частности акриламида, альгината, каррагенана, коллагена, фибрина, агара, агарозы, желатина, поливинилового спирта.

3. Клеточный микрочип по п.1, отличающийся тем, что гелевые микроячейки имеют размер пор, обеспечивающий проникновение необходимых веществ к иммобилизованным клеткам.

4. Клеточный микрочип по п.1, отличающийся тем, что подложка представляет собой стекло, металл, керамический материал, полимерный носитель или композитный материал.

5. Клеточный микрочип по п.4, отличающийся тем, что полимерный носитель представляет собой полиметилметакрилат, полистирол или полипропилен.

6. Клеточный микрочип по п.1, отличающийся тем, что подложка представляет собой пластину, химически модифицированную для фиксации на ее поверхности гелевых микроячеек.

7. Клеточный микрочип по п.1, отличающийся тем, что клетки, подлежащие иммобилизации, представляют собой эукариотические или прокариотические клетки,

8. Клеточный микрочип по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что он используется для изготовления биосенсоров, тестирования питательных сред; определения активности антибактериальных препаратов, мониторинга развития популяции микроорганизмов в условиях воздействия на них различных факторов.

9. Способ исследования живых клеток, включающий инкубацию клеточного микрочипа, по любому из пп.1-8 в присутствии маркера, регистрацию сигнала, обусловленного исследуемым свойством клеток, и оценку полученного сигнала.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что маркер представляет собой флуоресцентный маркер, а регистрируемый сигнал обусловлен флуоресценцией клеток микрочипа.

11. Способ по п.9, отличающийся тем, что регистрируемый сигнал обусловлен флуоресценцией белков, экспрессируемых клетками микрочипа.

12. Способ по п.9, отличающийся тем, что результаты оценивают визуально или с помощью программного обеспечения.