Способ обработки операционно-биопсийного и секционного материала для микроскопического исследования

Изобретение относится к области медицины, в частности к патогистологии. Способ осуществляют следующим образом. Образцы помещают на носитель в виде нити с интервалом 0,5 см с формированием гирлянды длиной 10-12 см, которую свободно помещают в контейнер. Контейнер последовательно проходит ряд сосудов, содержащих соответствующие растворы, при этом он вращается вокруг оси, что способствует более равномерной обработке материала. Время и температурный режим настраиваются в соответствии с выбранной методикой. Обработку начинают погружением в формалин при температуре 34-37°С в течение 2 часов, затем промывают проточной водой 4 часа. Обезвоживают спиртом концентрации 96%, последовательно проводя контейнер по пяти емкостям: в первой емкости обезвоживают пять часов, затем в трех емкостях по 3 часа в каждой. В пятой емкости обезвоживают пять часов. Дубление проводят в спиртово-ксилоловом растворе 1 час и в ксилоле 1 час, заливают парафином при температуре 36°С на 1 час и при температуре 56°С также на 1 час. Затем вырезают блоки, наклеивают на деревянные колодки, делают срезы на микротоме, окрашивают их и направляют на микроскопическое исследование. Изобретение обеспечивает сокращение сроков обработки. 4 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к патогистологии, в частности к подготовке образцов тканей для микроскопического исследования.

Система обработки микропрепаратов существует около 100 лет практически без каких-либо изменений. Появление автоматической обработки хотя и облегчило труд лаборантов и значительно снизило количество погрешностей, связанных с человеческим фактором (невнимательность, забывчивость), но не внесло существенных изменений в технологию и не сократило сроки подготовки материала для микроскопии.

Для обработки операционно-биопсийного материала используются различные способы, в том числе позволяющие получить результаты в более короткие сроки.

Известен быстрый способ обработки операционно-биопсийного и секционного материала с заливкой маленьких кусочков в целлоидин. Целлоидин является лучшей пропитывающей средой, менее всего деформирует ткани. Но на одно лишь пребывание в целлоидине и уплотнение требуется 5-8 дней. Существует укороченный способ заливки в целлоидин, но этот способ может быть применим только к маленьким кусочкам тканей размером 0,2×0,2 см (В.Г.Елисеева, М.Я.Субботина, Ю.А.Афанасьева, Е.Ф.Котовский. Основы гистологии и гистологической техники. М.: Медицина, 1967, стр.143-144).

Стадии метода:

- вырезание острой бритвой небольших кусочков до 2 мм,

- фиксация (и одновременно обезвоживание) в двух порциях 96% спирта по 3 часа в каждой порции,

- заливка в 10% целлоидин на 12 часов,

- наклеивание на деревянные колодки,

- подсушивание на воздухе,

- уплотнение в хлороформе 30-60 минут,

- нарезка микротомом и окрашивание срезов для исследования.

Недостатки способа:

- целлоидин не производится в России и является редким и дорогостоящим препаратом (раньше для его получения в лабораториях использовались старые рентгеновские пленки, сейчас это стало невозможным, т.к. рентгеновские пленки не целлоидиновые, а ацетатные);

- целлоидиновые блоки получаются более мягкими по сравнению с парафиновыми, поэтому срезы получаются не столь тонкими и прочными (минимальная толщина срезов - 15 микрон - в 2 раза толще, чем при обычной заливке);

- применение для исследования только маленьких кусочков тканей и невозможность использования метода для более информативного микроскопического исследования больших кусочков.

Известен способ быстрой заливки маленьких кусочков в парафин (Г.А.Меркулов, курс патологогистологической техники, издание 4, Ленинград, Медгиз, 1961, стр.50).

Этот способ дает возможность сокращения всего процесса обработки материала до 10 часов из-за использования парафина и хлороформа при температуре 35-40°С. Этот способ, так же как и способ заливки в целлоидин, применяется только для обработки маленьких кусочков тканей.

Стадии метода:

- вырезание острой бритвой небольших кусочков до 2 мм,

- фиксация (и одновременно обезвоживание) в двух порциях 96% спирта по 3 часа в каждой порции,

- помещение кусочков в хлороформ на 1-2 часа при температуре 35-40°С,

- помещение кусочков в хлороформ с парафином на 30 минут - 1 час,

- заливка в 1 порцию парафина при температуре 54-55°С на 1 час и во вторую порцию той же температуры на 30 минут - 1 час,

- охлаждение, вырезывание блоков, наклеивание на колодки,

- нарезка микротомом и окрашивание срезов для исследования.

Недостатки способа:

- выигрыш во времени приводит к проигрышу в полноте и достоверности диагностики из-за небольшого размера кусочков;

- отрицательное воздействие хлороформа на здоровье персонала лаборатории.

Наиболее близким к заявляемому является классический способ заливки материала в парафин (Г.А.Меркулов, Курс патологогистологической техники, издание 4, Ленинград, Медгиз, 1961, стр.49). Этот способ состоит из следующих этапов.

1. Подготовка к обработке. Материал для гистологического исследования может быть двух видов: биопсийный (прижизненный, из органов и тканей больных) и секционный (из органов и тканей умерших). Берутся кусочки тканей для исследования размером от 1×1 см до 0,2×0,2 см. Процесс обработки материала происходит с использованием аппарата АТ-4 (автомат универсальный для гистологической обработки тканей, производство Ждановского завода технологического оборудования). Кусочки тканей величиной 1×1 см размещаются в решетках по 5 кусочков в каждой и кладутся в контейнеры, вмещающие не более 10 решеток (итого 50 кусочков за одну проводку в аппарате АТ-4). Контейнер последовательно проходит ряд сосудов, содержащих соответствующие жидкости, при этом он вращается вокруг оси, что способствует более равномерной обработке материала. Время и температурный режим настраиваются перед пуском автомата в соответствии с выбранной методикой посредством механизма управления. При проведении диагностики количество кусочков биопсийного материала не должно превышать 3, а для операционного материала - 10, за одну проводку обычно обрабатывается в среднем 30% биопсийного материала и 70% - операционного, то есть в среднем исследуется материал от 11 больных.

2. Погружение кусочков тканей в 20% формалин при температуре 18°С для долговременного сохранения формы ткани или органа без уменьшения объема - 24 часа.

3. Промывание проточной водой для вымывания формалина - 8 часов.

4. Обезвоживание обводненных кусочков в серии восходящих спиртов (концентрация от 50°С до 100°С).

5. Дубление исследуемого материала. В связи с тем, что после спиртов кусочки становятся хрупкими, для придания им эластичности производится дубление ксилолом. С целью более плавного воздействия вначале используется спирт-ксилол, а затем - чистый ксилол.

6. Уплотнение. Эластичный кусочек не может быть тонко порезан на микротоме, поэтому он должен быть уплотнен проведением через парафиновые ванны.

7. Наклеивание на колодки, нарезка на микротоме и окраска препаратов.

Недостатки способа:

- малая пропускная способность аппарата АГ-4 ограничивается объемом и вместимостью контейнера, при большой загруженности лаборатории требуется дополнительное приобретение автоматов;

- нагревание формалина лишь до комнатной температуры 18°С снижает интенсивность и полноту пропитывания тканей;

- дополнительная фиксация в спирте-формалине удлиняет исследование, хотя на качество существенно не влияет;

- длительное пребывание тканей в формалине требует и такого же длительного промывания тканей в проточной воде, так как остается артефакт фиксации - формалиновый пигмент, мешающий диагностике;

- обезвоживание в серии спиртов и заливка в парафин происходят с большими затратами времени;

- основной недостаток способа - длительность процесса обработки материала.

Недостатки технологии ведут к получению более низкого результата по продолжительности и производительности:

- нередко больным приходится ожидать результата исследования не менее 7 суток (5 суток занимает сама обработка и 2 суток морфологическое исследование врача);

- длительный процесс диагностики может приводить к более позднему началу дифференцированной терапии;

- ожидание не только откладывает начало лечения, но и увеличивает срок пребывания пациента в хирургическом отделении;

- неопределенность и состояние ожидания - тяжелый эмоциональный стресс для больных и их родственников.

Задача изобретения - сокращение сроков обработки операционно-биопсийного и секционного материала для микроскопического исследования без потери качества образцов и ускорение постановки морфологического диагноза.

Поставленная задача достигается тем, что образцы для обработки помещают на носитель в виде нити, при этом образцы размещают на нити с интервалом 0,5 см с формированием гирлянды длиной 10-12 см, которую свободно помещают в контейнер. Контейнер последовательно проходит ряд сосудов, содержащих соответствующие растворы, при этом он вращается вокруг оси, что способствует более равномерной обработке материала. Время и температурный режим настраиваются перед пуском автомата в соответствии с выбранной методикой посредством механизма управления. Обработку начинают погружением в формалин при температуре 34-37°С в течение 2 часов, затем промывают проточной водой 4 часа. Обезвоживают спиртом концентрации 96%, последовательно проводя контейнер по пяти емкостям: в первой емкости обезвоживают пять часов, затем в трех емкостях по 3 часа в каждой. В пятой емкости обезвоживают пять часов. Дубление проводят в спиртово-ксилоловом растворе 1 час и в ксилоле 1 час, заливают парафином при температуре 36°С на 1 час и при температуре 56°С также на 1 час. Затем вырезают блоки, наклеивают на деревянные колодки, делают срезы на микротоме, окрашивают их и направляют на микроскопическое исследование.

Новизна изобретения

1. Образцы тканей для обработки помещают на носитель в виде нити, при этом образцы нанизывают на нить с интервалом 0,5 см, формируя гирлянды длиной 10-12 см, которые свободно размещают в контейнере.

2. Обработку формалином ведут при температуре 34-37°С в течение 2 часов, потому что такая температура соответствует температуре тела и является физиологической для тканей человека (коагуляция белка происходит при более высокой температуре - 40-41°С).

3. Промывание проточной водой 4 часа, потому что этого срока достаточно для удаления формалина из образцов, подвергшихся обработке на первой стадии за более короткое время - 2 часа.

4. Обезвоживают спиртом с концентрацией 96% последовательно в пяти емкостях: в первой емкости пять часов, в последующем в трех емкостях по 3 часа в каждой и в пятой емкость - 5 часов. Такая концентрация спиртов дает качественное обезвоживание с наименьшими временными затратами.

5. Дубят в спиртово-ксилоловом растворе 1 час и в ксилоле 1 час, что позволяет получить хорошее уплотнение тканей.

6. Заливают парафином при температуре 36°С на 1 час и при температуре 56°С также на 1 час, что сокращает время обработки и позволяет получить качественные срезы толщиной 8 микрон.

Совокупность существенных признаков изобретения позволяет получить новый технический результат.

1. Сокращение сроков обработки операционно-биопсийного и секционного материала с получением образцов без ухудшения их качества.

2. Более ранняя выдача образцов для выполнения морфологического анализа, за счет чего сокращаются сроки пребывания больного в стационаре.

3. Более раннее начало дифференцированного лечения.

В течение 1,5 лет нами проведена серия поисковых исследований, при которых менялись длительность, температурные режимы, концентрация растворов, количество кусочков тканей, подлежащих обработке. Таким образом направленно моделировались возможные погрешности, изучались характерные артефакты при конкретных нарушениях технологии. При этом тщательно анализировалось качество полученных препаратов. В предварительных опытах было изучено около 10 тысяч микропрепаратов, в результате чего были выбраны такие сроки обработки, которые явились необходимыми и достаточными для сохранения качества препаратов.

Способ осуществляется следующим образом.

Маленькие кусочки тканей 0,2×0,2 см помещают в растворы в марлевых мешочках. Мешочки закрепляют на нити. Исследование крупных кусочков дает возможность более точной диагностики, для обработки образцы помещают на носитель в виде нити, при этом образцы и мешочки с образцами размещают с интервалом 0,5 см с формированием гирлянды длиной 10-12 см, которую свободно помещают в контейнере. Нить проводят по центру образца.

Проводку по растворам и окраску производят на аппарате АТ-4 (автомат универсальный для гистологической обработки и окраски тканей). Контейнер с кусочками тканей, помещенных на нить, последовательно проходит ряд сосудов, содержащих соответствующие растворы, при этом он вращается вокруг оси, что способствует более равномерной обработке материала.

Обработку формалином ведут при температуре 34-37°С в течение 2 часов, затем промывают проточной водой 4 часа. Обезвоживают спиртом концентрации 96% последовательно в пяти емкостях: в первой емкости обезвоживают спиртом концентрации 96% пять часов, затем в трех емкостях по 3 часа в каждой, в пятой емкости - 5 часов. Дубят в спиртово-ксилоловом растворе 1 час и в ксилоле 1 час, заливают парафином при температуре 36°С на 1 час и при температуре 56°С также на 1 час. Охлаждают, вырезают блоки, помещают их на деревянные колодки, делают срезы на микротоме, окрашивают их для микроскопического гистологического исследования.

Подробные данные по отличиям прототипа (классического способа) и предлагаемого способа приводятся в таблице 1.

Таблица 1 Сопоставление способов обработки операционно-биопсийного и секционного материала
№	Прототип	Предлагаемый способ
	Колич. кусочков	Время (час)	Условия	Колич. кусочков	Время (час)
1.	Объем обрабатываемого материала	50			225
2.	Формалин 20% при температуре 18°С		24	При температуре 34-37°С		2
3.	Спирт-формалин		24			-
4.	Промывание в проточной воде		8			4
4.	Спирт 86%		24			-
5.	Спирт 96%		24			5
6.	Спирт 96%		-			3
7.	Спирт 96%		-			3
8.	Спирт 96%		-			3
9.	Спирт 96%		-			5
10.	Спирт-ксилол		3			1
11.	Ксилол		6			1
12.	Парафин-ксилол		3			1
13.	Парафин 36°С		2,5			1
14.	Парафин 56°С		1,5			1
	Итого	50 кусочков (11 больных)	120 часов		225 кусочков (50 больных)	30 часов

Как видно из таблицы 1, этап обработки материала на аппарате АТ-4 сокращается в 4 раза, а количество обрабатываемого материала за одну загрузку при этом возрастает почти в 5 раз, то есть в целом производительность возрастает в 20 раз.

Поскольку пропускная способность аппарата значительно увеличивается, для сохранения хорошего качества образцов при таком увеличении количества исследуемого материала возникает необходимость более частой смены растворов: раз в 3 дня вместо 1 раза в неделю по методике прототипа (классическому способу).

Таблица 2 Зависимость качества препаратов от различных температурных условий фиксации
Этап обработки	Качество препаратов
Фиксация в 20% формалине при разной температуре	18-20°С	25-28°С	35-37°С	38-41°С
Хорошее через 24 часа	Хорошее через 10 часов	Хорошее через 2 часа	Образцы неудовлетворительные (резкое краевое уплотнение кусочков без достаточной проработки середины)
Дополнительная фиксация в спирт формалине	Существенно не влияет	Существенно не влияет	Существенно не влияет	Существенно не влияет
Таблица 3 Зависимость качества препаратов от длительности промывания в проточной воде
Промывание в проточной воде	1 час	2 часа	4 часа	8 часов
Неудовлетворительное (остался формалиновый пигмент)	Неудовлетворительное (остался формалиновый пигмент)	Хорошее	Хорошее

Нами была проведена серия экспериментов по обезвоживанию препаратов в разных условиях: различная концентрация спирта и различное время экспозиции. Эксперименты показали, что обезвоживание в 86% спирте позволяет получить качественные препараты лишь при экспозиции не менее 24 часов с последующей обработкой 96% спиртом 48 часов и спирт ксилолом - 3 часа, как рекомендует классический метод. Если же начинать обезвоживание с более концентрированного 96% спирта, то можно значительно уменьшить время обезвоживания при сохранении хорошего качества препаратов

Таблица 4 Зависимость качества препаратов от времени заливки в парафин
Условия	Качество препаратов
Прототип	Эксперимент	Предлагаемый способ
Ксилол	6 часов	30 минут	1 час
Хорошее	Неудовлетворительное. Кусочки разволокняются, так как недостаточно уплотнены.	Хорошее
Парафин-ксилол	3 часа	30 минут	1 час
Хорошее	Неудовлетворительное. Уплотнена периферия, не уплотнен центр.	Хорошее
Парафин 36°C	2,5 часа	30 минут	1 час
Хорошее	Неудовлетворительное	Хорошее
Парафин 56°С	1,5 часа	30 минут	1 час
Хорошее	Неудовлетворительное. Центр кусочка не успевает пропитаться парафином	Хорошее

При погрешностях обработки операционно-биопсийного материала, в частности при фиксации в 20% формалине 2 часа при температуре 40-41°С происходило резкое краевое уплотнение кусочков без достаточной проработки середины. После заливки в парафин центр блока был мягким, рыхлым и волокнистым, как вата. При нарезке на микротоме срезы получались неравномерной толщины, рваные. Красители воспринимались тканями неравномерно, что делало гистологическую картину нечеткой.

При недостаточности промывания (менее 2 часов) после фиксации в микропрепаратах появлялись бурые глыбки - формалиновый пигмент, который мог имитировать старое кровоизлияние или наличие пигментной опухоли. Поэтому отработка предлагаемого способа была проделана очень тщательно на большом количестве образцов тканей.

ПРИМЕР.

За один день из лечебно-профилактических учреждений доставлены на исследование:

1. Соскобы из полости матки от 11 пациенток, каждый из которых был разделен на 5 блоков (всего 55 кусочков).

2. 10 гастробиопсий в среднем по 3 кусочка на каждую (всего 30 кусочков).

3. 3 удаленных желчных пузыря по 5 кусочков из каждого (всего 15 кусочков).

4. 2 червеобразных отростка по 5 кусочков из каждого (всего 10 кусочков)

5. 3 папилломы лица по 4 кусочка из каждой (всего 12 кусочков)

6. 5 случаев секционного материала после вскрытия умерших по 20 блоков каждый (100 кусочков)

Всего 222 кусочка тканей от 29 больных и 5 умерших.

Перед фиксацией из операционного, биопсийного и секционного материала были вырезаны кусочки не более 1×1×0,5 см и нанизаны на хлопчатобумажные нити длиной 10-12 см с интервалом 0,5 см, но не более 20-24 кусочков на одну гирлянду, что диктуется высотой стаканов с раствором. Соскобы и кусочки гастробиопсий размером 0,2×0,2 см завязаны в марлевые мешочки и тоже подшиты к гирляндам. Таких гирлянд сформировано 12, они свободно помещены в контейнер и погружены в стаканы, в которых они свободно омываются растворами.

Фиксация проводилась 20% формалином при температуре 36°С в течение 2 часов. Промывали проточной водой 4 часа. После этого кусочки имели консистенцию плотной резины как по краям, так и по центру.

Для обезвоживания контейнеры с материалом для обработки проведены через 5 емкостей со спиртом концентрации 96% (в первой емкости 5 часов, во второй, третьей и четвертой емкостях по 3 часа, в пятой - 5 часов). Хорошее обезвоживание в спиртах позволило сократить время пропитывания кусочков ксилолом, парафин-ксилолом и парафином при температуре 36°С и 56°С до 1 часа. После пропитывания парафином кусочки при прокалывании тонкой иглой имели плотную консистенцию как по краям, так и по центру, что говорит о равномерности процесса уплотнения. Затем кусочки были наклеены не деревянные кубики, соответственно маркированы и стали называться блоками. При резке блоков на микротоме срезы получались полупрозрачные (толщина не более 10 микрон), на ноже микротома закручивались стружкой, при попытке расправить их на предметном стекле они не рвались, что свидетельствовало о достаточной плотности кусочка в сочетании с пластичностью. При окраске срезов щелочные красители окрашивали только ядра, а кислые - все остальные структуры ткани, окрашивание было равномерным и контрастным, что давало возможность качественного исследования во время световой микроскопии.

Готовые препараты для диагностики поступали к врачу через 2 суток. Патогистологическое заключение доставлялось в лечебные учреждения на 3-4 день, а в редких случаях необходимости дополнительных окрасок или консультаций для уточнения диагноза - на 5-6 день.

Такие сокращенные сроки установления окончательного диагноза приводили к более раннему началу лечения.

1. Из 11 больных гинекологического отделения (исследование соскобов из полости матки) в двух случаях были выявлены злокачественные опухоли, что позволило в короткий срок направить женщин в онкодиспансер и раньше начать лечение. Известно, что ожидание результата соскоба всегда сопровождается высоким уровнем тревоги, для 9 больных этот период значительно сократился.

2. При исследовании 10 гастробиопсий один пациент был также направлен в онкодиспансер, а у 9 раньше начато специфическое лечение, что привело у сокращению пребывания больных в стационаре.

3. При исследовании 3 желчных пузырей и 2 червеобразных отростков подтверждено воспаление, что определило тактику ведения в послеоперационном периоде.

4. При исследовании опухолевых процессов на лице 1 определен как злокачественный, больной сразу был направлен в онкодиспансер, 2 - как пороки развития кожи, не требующие лечения после удаления.

Таким образом, при применении предлагаемого способа обработки операционно-биопсийного и секционного материала за один цикл получили диагностическую патогистологическую помощь 29 больных, 4 из них направлены в онкодиспансер для специфической терапии, а 25 начато целенаправленное лечение в среднем на 4 дня раньше, чем при классическом методе обработки материала, что могло дать возможную экономию 120 койко-дней (25×4=120).

Уменьшение сроков оформления протоколов вскрытия с 14 до 7 дней имеет важное значение для своевременной подачи статистической информации по смертности в ЛПУ в конце месяца, квартала и особенно - года.

Предлагаемый способ используется в Новокузнецком онкологическом диспансере, в государственном лечебно-профилактическом учреждении «Муниципальное патологоанатомическое бюро с гистологической и цитологической лабораторией», в патологоанатомическом отделении больницы №1 г.Осинники Кемеровской области, в гистологической лаборатории I роддома г.Санкт-Петербурга.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет без ухудшения качества гистологических препаратов и каких-либо дополнительных затрат сократить сроки обработки операционно-биопсийного и секционного материала, ускорить морфологическую диагностику, сократить пребывание больного в стационаре, уменьшить период эмоционального стресса для пациента, раньше начать дифференцированное лечение.

Способ обработки операционно-биопсийного и секционного материала для микроскопического исследования, включающий обработку образцов различными растворами: формалином при нагревании, промывание водой, обезвоживание спиртом, дубление в ксилоле, заливку парафином, охлаждение и вырезание блоков, наклеивание их на колодки, выполнение срезов на микротоме и окрашивание препарата, при этом образцы размещают на носителе, загружают в контейнер, последовательно перемещают по емкостям с различными растворами, отличающийся тем, что обработку формалином ведут при температуре 34-37°С в течение 2 ч, промывают проточной водой 4 ч, обезвоживают спиртом с концентрацией 96% последовательно в пяти емкостях: в первой емкости 5 ч, затем в трех емкостях по 3 ч в каждой и в пятой емкости 5 ч, дубят в спиртово-ксилоловом растворе 1 ч и в ксилоле 1 ч, заливают парафином при температуре 36°С на 1 ч и при температуре 56°С также на 1 ч, образцы для обработки помещают на носитель в виде нити с интервалом 0,5 см с формированием гирлянды длиной 10-12 см, которую свободно помещают в контейнер.