Способ получения иммуносорбента
Владельцы патента RU 2265611:
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ставропольский государственный аграрный университет (RU)
Изобретебние относится к иммунохимии и может быть использовано в диагностике для выявления специфической реакции антиген-антитело с использованием иммуноферментного анализа и реакции иммунофлуоресценции. Способ получения иммуносорбента включает модифицирование аэросила раствором хитозана в уксусной кислоте совместно с формиатом железа с последующим окислением и иммобилизацией белкового лиганда. 1 табл.
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к иммунохимии и может быть применено для выявления специфической реакции антиген-антитело в диагностике особо опасных инфекций с помощью иммуноферментного анализа, реакции иммунолуоресценции.
Уровень техники
Известен способ получения иммуносорбента на основе полиакриламидных полимеров, включающий иммобилизацию иммуноглобулинов. Недостатками способа являются: низкий уровень специфической емкости, нестабильность при хранении, кроме того, сорбенты механически не прочны (Пушкарь В.Г., Ефременко В.И., Климова И.М. и др. Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов // ЖМЭИ, 1985, №12, с.30-34).
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения иммуносорбента (Патент РФ №2102134, В 01 У 20/10. Способ получения иммуносорбента, Авторы: Брыкалов А.В., Жарникова И.В. опубл. 20.01.98 г., Бюллетень №2).
Способ включает модифицирование кремнеземного сорбента органическим полимером декстраном, окислением продукта перхлоратом натрия с последующим взаимодействием с чумными и туляремийными иммуноглобулинами.
Недостатком указанного способа является низкий уровень специфической активности иммуносорбента.
Цель изобретения - повышение специфической емкости чувствительности иммуносорбента, имеющего в структуре магнитосоставляющий компонент.
Раскрытие изобретения
Цель достигается тем, что для повышения уровня специфической емкости, чувствительности иммуносорбента проводят модифицирование кремнеземного носителя - аэросила раствором хитозана в 3% уксусной кислоте совместно с формиатом железа с последующим окислением раствором перхлората натрия.
Сущность способа получения иммуносорбента
Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводится модифицирование сорбента хитозаном, который представляет собой полимер -поли[(1-4)-2-амино-2-дезокси-β-Д-глюкозы].
При последующем окислении сорбента раствором перхлората натрия носитель активирован альдегидными группами, способными к химическому взаимодействию с туляремийными иммуноглобулинами. В процессе синтеза сорбента на начальных этапах происходит разложение формиата железа с последующим образованием в структуре сорбента магнетита.
Применение разработанных магносорбентов с магнитными свойствами обеспечит упрощение и ускорение манипуляций на всех этапах иммуноферментного анализа, исключит необходимость предварительного концентрирования микроорганизмов на мембранных фильтрах или путем центрифугирования, и при этом повышается вероятность выделения микробов туляремии из больших объемов исследуемых проб.
Осуществление изобретения
Содержание предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. К 5 г аэросила А-380 добавляли 3% раствор хитозана в 3% уксусной кислоте и 2 г формиата железа. Затем полученный продукт высушивали при температуре 160-175°С в течение 30 минут. К полученному сорбенту в последующем добавляли 40 мл водного раствора, содержащего 2,5 г перхлората натрия, инкубировали смесь в течение 40 минут в темноте. Затем сорбент отмывали 80 мл дистиллированной воды. К 0,02 г магносорбента приливали 1 мл туляремийных иммуноглобулинов с концентрацией по белку 5 мг/мл. Смесь оставляли при 23°С в течение 1,5 часа, далее надосадочную жидкость удаляли, а носитель трижды по 10 мл приливали 0,9% раствором хлорида натрия.
Для получения результатов определения специфической емкости и специфичности иммуносорбентов осуществляли метод иммунофлуоресценции, иммуноферментный анализ. Для этого к 5 мл 10% суспензии иммуносорбента приливали 7 мл туляремийного микроба в концентрации 103 микробных тел/мл и инкубировали смесь 1 час при 24°С. Сорбент отмывали 50 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Вносили 0,5 мл иммуноглобулинов туляремийных люминесцирующих в рабочем разведении и инкубировали 30 мин. Отмывали сорбент 0,9% раствором хлорида натрия и проводили регистрацию результатов в люминесцирующем микроскопе Люмам Р-2 по общепринятой DASS-системе. Параллельно с опытной пробой измеряли люминесценцию контрольной пробы (иммуносорбент без контакта с туляремийным микробом).
Чувствительность иммуносорбента, измеренная методом иммунофлуоресценции, составляет 103 м.т/мл туляремийного микроба.
Для проведения иммуноферментного анализа к 0,2 мл 10% взвеси магноиммуносорбента добавляли 1 мл туляремийного микроба в концентрации 109 м.т/мл смесь инкубировали при температуре 27°С в течение 20 минут, затем трехкратно промывали фосфатным буфером с рН 7,2-7,4. На следующем этапе вносили 0,2 мл коньюгата пероксидазного туляремийного и инкубировали в течение 30 минут при температуре 23°С. После четырехкратного промывания вносили по 0,2 мл субстрат-индикаторной смеси (10 мл 0,1 М цитратного буферного раствора рН 5,0 с 0,02 мл 33% перекиси водорода и 5 мг о-фенилендиамина). Через 4 минуты реакцию останавливали 2 М раствором серной кислоты в объеме 0,1 мл. Результаты учитывали на анализаторе иммуноферментном АКИ-Ц-0,1.
Чувствительность иммуносорбента, измеренная иммуноферментным анализом, составляет 103 м.т/мл туляремийного микроба.
Пример 2. Способ получения магноиммуносорбента осуществляли по методике примера 1, но для модифицирования аэросила использовали 3,5% раствор хитозана в 3% растворе уксусной кислоты. Специфическая емкость по флуоресцентному анализу составила 15 у.е/мг, а чувствительность метода по ИФА составила 102 м.т. туляремийного микроба.
Пример 3. Способ получения магноиммуносорбента осуществляли по методике примера 1, но для модифицирования аэросила использовали 4,5% раствор хитозана в 3% растворе уксусной кислоты. Специфическая емкость по флуоресцентному анализу составила 15 у.е/мг, а чувствительность метода по ИФА составила 102 м.т. туляремийного микроба.
Пример 4. Способ получения магноиммуносорбента осуществляли по методике примера 1, но для модифицирования аэросила использовали 5% раствор хитозан в 3% растворе уксусной кислоты. Специфическая емкость по флуоресцентному анализу составила 15 у.е./мг, а чувствительность метода по ИФА составила 102 м.т. туляремийного микроба.
Сравнительные результаты предлагаемого способа и прототипа представлены в таблице.
В отличие от прототипа предлагаемый способ получения иммуносорбента повышает специфическую емкость препарата в 1,8 раза, увеличивает чувствительность на порядок.
Эксперименты показали, что для модифицирования аэросила оптимален 3,5-4,5% раствор хитозана. При увеличении концентрации полимера до 5% не наблюдается увеличения специфической емкости иммуносорбента, тогда как уменьшение концентрации активатора до 3% снижает специфическую емкость.
Основные преимущества и положительный эффект способа получения иммуносорбента определяется на основании того, что в процессе синтеза одновременно осуществляется активирование поверхности сорбента хитозаном и образование в структуре носителя магнитной составляющей.
При последующем окислении функциональных групп хитозана образуются альдегидные группы, реагирующие с иммуноглобулинами туляремийными. Синтез иммуносорбентов отличается простотой и обеспечивает при их использовании в иммуноферментном анализе повышение специфической емкости, чувствительности.
Способ получения иммуносорбента, предусматривающий ковалентную иммобилизацию лиганды белковой природы с модифицированным носителем, таким, как аэросил, отличающийся тем, что модифицирование проводят 3,5-5%-ным раствором хитозана в уксусной кислоте совместно с формиатом железа с последующим окислением раствором перхлората натрия.
