Способ культивирования бактерий lawsonia intracellularis, штаммы l.intracellularis, способ культивирования бактерий l.intracellularis (вариант), способ получения аттенуированного штамма l.intracellularis, способ определения наличия антител, вакцина, способ индукции иммунного ответа и аттенуированный штамм l.intracellularis n343np40wk

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения вакцин и диагностических объектов. Бактерии Lawsonia intracellularis культивируют в клетках Нер-2, Me Coys или IEC-18 в суспензии при концентрации кислорода в интервале от более 0 до примерно 18 процентов. Вакцины, содержащие бактерии L.intracellularis, полученные данным способом, используют в способе индукции иммунного ответа у животных на указанные бактерии. Изобретение позволяет культивировать бактерии L.intracellularis в больших масштабах улучшенным способом. 9 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 табл.

 

Область изобретения

Настоящее изобретение направлено на создание вакцины против бактерий Lawsonia intracellularis, способы защиты от них и диагностику инфекций, вызываемых Lawsonia intracellularis. Продукты и способы по изобретению частично достижимы в результате усовершенствованного способа, который разработан для крупномасштабного культивирования бактерий Lawsonia intracellularis.

Описание аналогичных технических решений

Бактерии Lawsonia intracellularis являются причинным агентом пролиферативной энтеропатии свиней (ПЭС) и действует практически на все животные организмы, включая человека, кроликов, хорьков, хомяков, лис, лошадей и других животных, таких различных, как страусы и эму.

Бактерии Lawsonia intracellularis являются особенно значительной причиной потерь в свиных стадах. Оценки распространенности и заболеваемости ПЭС в США достигали 20 процентов свиного стада с номинальными потерями в 20 миллионов долларов ежегодно.

Характерным признаком ПЭС является обнаружение интрацитоплазматических не связанных с мембраной изогнутых палочковых бактерий в энтероцитах поврежденных областей кишечника. Бактерии, ассоциированные с ПЭС, были отнесены к "Campylobacter-подобным организмам". S.McOrist и др., Vet.PathoL, т.26, 260-64 (1989). Впоследствии причинные бактерии были идентифицированы как новый таксономический род и вид, общеупотребительно отнесенный к Heal symbiont (IS) intracellularis. C.Gebhart и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.43, №3, 533-38 (1993). Позднее эти новые бактерии получили таксономическое название Lawsonia (L) intracellularis. S.McOrist и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.45, №4, 820-25 (1995). Эти три названия были использованы равнозначно для обозначения того же организма, что и идентифицированный и описанный в дальнейшем здесь. Заявитель стремился использовать таксономическое название, L.intracellularis, в ходе обсуждения настоящего изобретения.

L.intracellularis - это облигатная внутриклеточная бактерия, которая не может культивироваться нормальными бактериологическими методами на обычных бесклеточных средах и, как считалось, для роста им необходимы прикрепленные эпителиальные клетки. S.McOrist и др. Infection and Immunity, т.61, №10, 4286-92 (1993) и G. Lawson и др., J. of Clinical Microbiology, т.31, №5, 1136-42 (1993) обсуждают культивирование L.intracellularis с использованием монослоев клеток кишечного эпителия крысы IEC-18 в обычных сосудах для культур тканей. Кроме того, Н.Stills, Infection and Immunity, т.59, №9, 3227-36 (1991) обсуждает использование монослоев клеток кишечника человеческого эмбриона Intestine 407 и монослоев клеток аденокарциномы ободочной кишки морской свинки в обычных сосудах для культур тканей. Эти прежние методы культивирования трудоемки и не пригодны для масштабирования.

Современному пониманию инфекции, вызываемой L.intracellularis, лечению и эффективному контролю заболевания серьезно препятствовали изощренные требования к in vitro культурам, L.intracellularis. В настоящее время необходим улучшенный способ культивирования L.intracellularis. Необходимы также вакцины против L.intracellularis и эффективные средства диагностики инфекции, вызываемой L.intracellularis.

Краткое описание изобретения

Одним объектом изобретения является обеспечение вакцин против бактерий L.intracellularis.

Другим объектом изобретения является обеспечение способов определения наличия антител к L.intracellularis в биологических образцах.

Дальнейшим объектом является обеспечение улучшенного способа культивирования L.intracellularis, позволяющего проводить его в больших масштабах с целью получения вакцин и диагностических агентов.

Для достижения этих и других объектов и в соответствии с целью изобретения, как осуществлено и подробно здесь описано, настоящее изобретение обеспечивает способ культивирования L.intracellularis и крупномасштабных поставок образующихся при этом бактерий. В соответствии со способом бактерии L.intracellularis инкубируют при концентрации кислорода от примерно 0 процентов до примерно 18 процентов при перемешивании бактерий для того, чтобы культивировать L.intracellularis, при сохранении бактерий в суспензии.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения обеспечивается способ культивирования бактерий L.intracellularis посредством инокуляции (заражения) монослоя клеток Нер-2, McCoys или IEC-18 со слиянием около 30 процентов с использованием инокулята, включающего бактерии L.intracellularis, для того, чтобы инфицировать клетки бактериями. Затем инфицированные клетки инкубируют при температуре от примерно 36 до примерно 38°С при концентрации кислорода от примерно 0 процентов до примерно 8.0 процентов до тех пор, пока не произойдет слияние клеток. Затем инфицированные клетки и ростовая среда помещаются в ферментер, биореактор, вращающийся сосуд или в какой-либо другой сосуд, пригодный для поддержания клеток в суспензии. Инфицированные клетки инкубируют при перемешивании таким образом, чтобы культивировать бактерии L.intracellularis при поддержании инфицированных клеток в суспензии. Затем часть культивированных бактерий L.intracellularis пассируется в свежие культуральные клетки для того, чтобы увеличить образование бактерий L.intracellularis.

Изобретение обеспечивает вакцины против L.intracellularis и способы получения вакцин против L.intracellularis. Авирулентные бактерии L.intracellularis получаются пассированием культивированных бактерий L.intracellularis достаточное число раз и отбором аттенуированного штамма или путем воздействия на культивированные бактерии химических способов аттенуации. Убитые вакцины L.intracellularis также получаются с использованием методов культивирования данного изобретения. В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления изобретения бактерии непрерывно культивируют в течение, по крайней мере, около 6 и до 8 месяцев при пассировании, по крайней мере, около 7 и до 12 раз с целью получения аттенуированного штамма для использования его в качестве вакцины. Затем аттенуированные бактерии смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и в эффективном количестве вводят животному для того, чтобы получить иммунный ответ. Заявитель сдал на хранение в Американскую Коллекцию Типовых Культур (АКТК) предпочтительный в настоящее время аттенуированный штамм N343NP40wk.

Изобретение обеспечивает также способ определения наличия антител, которые реагируют специфически с бактериями L.intracellularis в биологическом образце, путем выращивания, по меньшей мере, части культивированных бактерий L.intracellularis, заражения биологического образца от животного выращенными бактериями L.intracellularis или их компонентом в условиях, при которых антитело, присутствующее в биологическом образце, реагирует с L.intracellularis или с компонентом, и определения того, происходит ли реакция антитела с антигеном.

Дополнительные признаки и преимущества изобретения будут упомянуты далее в описании, которое следует, и станут очевидными при прочтении описания или могут быть поняты при практическом использовании изобретения.

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Термин "Z.intracellularis", как он используется здесь, означает внутриклеточные, изогнутые, грам-отрицательные бактерии, подробно описанные С.Gebhart и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.43, №3, 533-38 (1993) и S.McOrist и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.45, №4, 820-25 (1995) (каждый из которых включен здесь полностью в виде ссылки), и охватывает, но не только, бактерии, заложенные на хранение как АКТК 55672 в Американской Коллекции Типовых Культур (Роквилл, Мэриленд); бактерии, заложенные на хранение как НКТК 12656 и 12657 в Национальной Коллекции Типовых Культур (НКТК, Колиндейл, Лондон); причинные бактерии, которые повсеместно могут быть получены от свиней или других животных, инфицированных ПЭС, с учетом приведенных здесь специальных сведений и доктрин; варианты или мутанты любых из упомянутых выше бактерий независимо от того, получены они спонтанно или искусственно.

Термин "аттенуированный штамм", как он здесь используется, означает любой штамм L.intracellularis, который получен в соответствии с приемами культивирования и пассирования, приведенными здесь, с целью достижения вирулентности при поддержании иммуногенных свойств при введении животному-хозяину. Как демонстрируется ниже, различные несходные штаммы L.intracellularis были культивированы и аттенуированы в соответствии с доктринами настоящего изобретения с целью получения аттенуированных иммуногенных штаммов, имеющих эффективность как вакцины для свиней, так и для других животных, чувствительных к инфекции, вызываемой L.intracellularis.

Предполагается, что аттенуированные штаммы изобретения полезны в качестве иммуногенов в противомикробных вакцинах для животных, включая птиц, рыб, крупный рогатый скот, свиней, лошадей, вообще млекопитающих и приматов, и человека. Такие вакцины могут быть получены приемами, известными специалистам, с учетом доктрин, содержащихся здесь. Такая вакцина включала бы иммунологически эффективное количество аттенуированного штамма в фармацевтически приемлемом носителе. Вакцина могла бы быть введена в одной дозе или более. Иммунологически эффективное количество поддается определению способами, известными специалистам, без излишнего экспериментирования, с учетом содержащихся здесь доктрин. Количество авирулентных бактерий должно быть достаточным для того, чтобы стимулировать иммунный ответ у восприимчивых к заболеванию животных, оставаясь при этом авирулентным. Оно будет зависеть от конкретного животного, бактерий и вызванного ими заболевания. Рекомендованная доза для введения чувствительному животному составляет предпочтительно около 10³ до 10⁹ бактерий/кг веса тела и наиболее предпочтительно около 10⁵ до 10⁷ бактерий/кг веса тела. Носители известны специалистам и включают стабилизаторы и разбавители. Такая вакцина может содержать также соответствующий адъювант. Вакцины данного изобретения могут использоваться в комбинации с другими вакцинами, например, в качестве разбавителя другой лиофилизированной вакцины или смешиваться с другой вакциной перед лиофилизацией. Препараты вакцин могут быть также высушены, например, лиофилизацией для целей хранения или последующего получения лекарственной формы жидких вакцин.

Соответственно изобретение включает также метод индукции иммунного ответа к вирулентным бактериям L.intracellularis дикого типа у животного-хозяина с целью защиты его от таких бактерий. Метод включает введение хозяину иммунологически эффективного количества аттенуированных бактерий или убитых бактерий этого изобретения и, предпочтительно, введение хозяину вакцины этого изобретения.

Термин "крупномасштабное культивирование", как он использован здесь, означает уровень культивирования L.intracellularis больше чем приблизительно от 2.0 до 3.0 литров и включает производство в масштабе 100 литров или более.

Термин "культивирование", как он использован здесь, означает процесс промотирования роста, репродукции и/или пролиферации L.intracellularis.

При практическом применении способа культивирования по этому изобретению культуральные клетки могут сначала инокулироваться инокулятом, включающим бактерии L.intracellularis таким образом, чтобы инфицировать клетки бактериями. Многочисленные клеточные линии могут использоваться в практике этого изобретения, включая, но не только, IEC-18 (АКТК 1589) - эпителиальные клетки кишечника крысы, Нер-2 (АКТК 23) - клетки человеческой эпидермоидной карциномы, McCoys (АКТК 1696) - мышиные (неспесифицированные клетки), MDCK (АКТК 34) - клетки собачьих почек Madin-Darby, BGMK (Biowhittaker #71-176) - клетки почек зеленой обезьяны Buffalo и эпителиальные клетки кишечника свиньи. Предпочтительными культуральными клетками являются клетки Нер-2, McCoys или IEC-18. В качестве альтернативы бактерии могут культивироваться в бесклеточной среде до тех пор, пока бактерии поддерживаются при соответствующей концентрации растворенного кислорода, как описано здесь.

Если используются культуральные клетки, то перед инокуляцией предпочтительно, но не обязательно, клетки должны быть в виде монослоя. Для образования монослоя клетки можно сеять в обычных сосудах. Каждый сосуд, как правило, засевается в интервале от примерно 1×10⁵ до примерно 10×10⁵ клеток на 25 см² площади сосуда, смешанных с ростовой средой. Ростовой средой может служить любая среда для культивирования клеток, которая включает источник азота, необходимые ростовые факторы для выбранных культуральных клеток и источник углерода, такой как глюкоза или лактоза. Предпочтительной средой является среда Игла в модификации Дюльбекко (МДСИ) с 2-5% эмбриональной бычьей сыворотки, хотя и различные другие коммерчески доступные среды могут использоваться с хорошими результатами.

Было обнаружено, что успешное культивирование L.intracellularis усиливается поддержанием культуральных клеток в постоянном состоянии роста. Поэтому у монослоя культуральных клеток во время инокуляции слияние должно быть примерно от 20 до 50%. Предпочтительно слияние клеток во время инокуляции должно быть примерно от 30 до 40%, причем 30% слияния являются наиболее предпочтительными.

Инокулят может быть чистой культурой L.intracellularis, полученной, например, из депозита АКТК 55672, депозитов НКТК 12656 либо 12657 или от инфицированных свиней или других животных с использованием доктрин выделения и очистки, обсужденных здесь.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения инокулят для практического применения изобретения представляет собой гомогенат кишечника, полученный соскабливанием слизистой оболочки подвздошной кишки свиньи или другого животного, инфицированного ПЭС. При получении гомогената кишечника отделы подвздошной кишки, выбранные для культивирования, должны иметь тяжелые повреждения с выраженным утолщением кишки. Вследствие недолговечности бактерий образцы должны сохраняться предпочтительно при -70°С как можно быстрее после аутопсии.

К инокуляту предпочтительно добавляют антибиотик, к которому бактерии L.intracellularis устойчивы, такой как ванкомицин, амфотерицин В или члены группы аминогликозидных антибитиков, включающей, например, гентамицин и неомицин, для того, чтобы подавить контаминирующие бактерии и дать возможность расти L.intracellularis. Независимо от того, является ли инокулят чистой культурой или гомогенатом кишечника, инокуляция культуральных клеток может осуществляться различными приемами, известными специалистам, с учетом приведенных здесь доктрин.

Затем бактерии и/или инокулированные культуральные клетки инкубируют при пониженной концентрации кислорода. При концентрации растворенного кислорода выше 18% рост L.intracellularis меньше оптимального, и в конечном итоге рост прекращается, если концентрации кислорода выходят за пределы этого значения. Предпочтительно инокулированные культуральные клетки инкубируют при концентрации растворенного кислорода в интервале от примерно 0% до примерно 10%. Более предпочтительно клетки инкубируют при концентрации кислорода в интервале от примерно 0% до примерно 8%, причем наиболее предпочтительной является концентрация кислорода в интервале от примерно 0% до примерно 3.0%.

Для правильного роста L.intracellularis необходима также надлежащая концентрация двуокиси углерода. При концентрациях двуокиси углерода более 10% и менее 4% наблюдается неоптимальный рост, и в конечном итоге - прекращение роста, если концентрации двуокиси углерода выходят за пределы этого интервала. Предпочтительно концентрация двуокиси углерода находится в интервале от примерно 6% до примерно 9%, причем наиболее предпочтительная концентрация двуокиси углерода составляет 8.8%.

Кроме того, клетки предпочтительно инкубируются при концентрации водорода в интервале от примерно 73% до примерно 94%. Вместо некоторого количества или всего водорода может быть использован азот. В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления изобретения клетки инкубируют примерно в 0-8.0% кислорода, около 8.8% двуокиси углерода и примерно 83.2% водорода.

Инокулированные клетки можно инкубировать в двойном газовом инкубаторе или другой газовой камере, которая содержит надлежащие концентрации кислорода и двуокиси углерода и которая позволяет клеткам находиться в суспендированном состоянии во время инкубации. Камера должна включать средства для поддержания инокулированных клеток в суспензии и газовый монитор и источник подачи газа для подведения и поддержания газа в надлежащей концентрации. Температура инкубации должна поддерживаться в интервале от 30°С до 45°С и более предпочтительно в интервале от 36°С до примерно 38°С. Самой предпочтительной является температура около 37°С. Необходимое оборудование для способов культивирования и аттенуации данного изобретения является общедоступным для обычных специалистов с учетом приведенных здесь доктрин. Одним из примеров оборудования, пригодного для осуществления на практике настоящего изобретения, является двойной газовый инкубатор, например модель 480, поставляемая фирмой Лэб-Лайн (Мельроуз Парк, Иллинойс), в сочетании с вращающимися сосудами для поддержания клеток в суспензии. Предпочтительное современное оборудование включает ферментер, биореактор или роторное встряхивающее устройство, вмещающее, по меньшей мере, 2 литра среды и способное поддерживать культуральные клетки в суспензии посредством барботирования газа в соответствующей концентрации, или другие средства механического перемешивания и постоянного мониторинга уровней кислорода, растворенного в среде. Подходящие для этой цели ферментеры и биореакторы производят Нью-Брунсвик, Браун и другие компании.

Поддержанием инокулированных клеток в суспендированном состоянии в ходе инкубации достигается максимальный рост клеток и, следовательно, L.intracellularis путем увеличения контакта каждой клетки в отдельности со средой и надлежащей смесью кислорода и двуокисью углерода. Культуральные клетки могут перемешиваться и поддерживаться в суспензии разнообразными методами, известными специалистам, включая, например, сосуды для культивирования, вращающиеся бутыли, полупроницаемые мембраны для культивирования и вращающиеся сосуды. При инкубации клетки могут поддерживаться в суспендированном состоянии посредством инкубации их во вращающемся сосуде внутри двойного газового инкубатора или подобного аппарата. Термин "вращающийся сосуд", как он использован здесь, означает сосуд или какой-либо другой контейнер, снабженный лопастью, пропеллером или другими средствами для перемешивания культуры и поддерживающий содержащиеся в нем клетки в суспендированном состоянии.

В особо предпочтительном варианте осуществления изобретения инокулированные клетки инкубируют до тех пор, пока они не достигнут слияния, а затем клетки помещают во вращающийся сосуд с ростовой средой и инкубируют в двойном газовом инкубаторе при вращении сосуда. Предпочтительно инокулированные клетки соскабливают во вращающийся сосуд. Это может быть достигнуто разнообразными способами, известными специалистам, таким, например, как использование клеточного скребка для отделения клеток. Как только клетки вводят во вращающийся сосуд, лопасть в нем вращается со скоростью в интервале от примерно 30 до примерно 60 об/мин для того, чтобы поддерживать клетки в суспензии.

Часть культивированных бактерий L.intracellularis затем пассируется в свежую культуру с целью повышения образования бактерий L.intracellularis. Термин "пассируется" или его вариации, как они здесь используются, означают процесс перенесения части культивированных бактерий L.intracellularis в свежие культуральные клетки с целью инфицирования свежих клеток бактериями. Термин "свежие", как он использован здесь, означает клетки, которые еще не инфицированы L.intracellularis. Предпочтительно возраст таких клеток, в среднем, не более примерно одних суток.

Пассаж L.intracellularis в суспензионные культуры можно выполнить удалением части исходной культуры и добавлением ее в новый сосуд, содержащий свежие культуральные клетки. Если исходная культура имеет высокое значение количества бактерий/мл, например, более примерно 10 бактерий/мл, предпочтительно добавлять в новый сосуд, содержащий свежие клетки, примерно от 1 до 10% (объемных) культуры из инфицированного сосуда. Предпочтительно осуществлять это, когда 50-100% клеток инфицированы. Если инфицировано менее 50% клеток, предпочтительно проводить пассаж разделением культуры в соотношении 1:2 в новом сосуде и доведением объема путем добавления свежей среды. В любом случае не нужен лизис клеток и другие этапы, в отличие от пассажа монослойных культур по прототипу.

После достаточного роста культуральных клеток и последующего заражения бактериями L.intracellularis до уровня клеточной инфективности более примерно 70%, что определяется иммунно-ферментным анализом (ИФА), 50%-ной инфекционной дозой тканевой культуры (ТКИД₅₀) или другим сопоставимым методом, собирают, по крайней мере, часть культивированных бактерий L.intracellularis. Этап сбора может осуществляться выделением бактерий из суспензии различными приемами, известными обычным специалистам, с учетом приведенных здесь доктрин. Предпочтительно бактерии L.intracellularis собирают центрифугированием содержимого всей или части суспензии с образованием осадка культуральных клеток, ресуспендированием образующихся клеточных осадков и лизисом инфицированных клеток. Обычно, по меньшей мере, часть содержимого центрифугируется при примерно 3000g в течение примерно 20 минут для того, чтобы осадить клетки и бактерии. Затем осадок ресуспендируют, например, в растворе сахароза-фосфат-глутамат (СФГ) и пассируют примерно четыре раза через иглу калибра 25 для того, чтобы лизировать клетки. Если желательна дальнейшая очистка, образцы могут быть центрифугированы при примерно 145g в течение примерно пяти минут для того, чтобы удалить клеточные ядра и осколки. Затем можно центрифугировать супернатант при примерно 3000g в течение примерно двадцати минут и образующийся осадок ресуспендировать в соответствующем растворителе, таком как СФГ с эмбриональной бычьей сывороткой (чтобы получить собранные бактерии, пригодные для замораживания или использования в качестве инокулята) или ростовой средой (чтобы получить собранные бактерии, более пригодные для пассирования в свежие клетки).

Как упоминалось ранее, эффективный рост L.intracellularis для крупномасштабного производства усиливается содержанием культуральных клеток в состоянии активного роста. В монослоях, когда культуры становятся сливающимися, скорость деления клеток существенно снижается. Попытки вырастить L.intracellularis на монослойных культурах тканей имели ограниченный успех, и масштабирование не было возможным. Однако использование суспензионных культур очень благоприятствует содержанию клеток в состоянии активного роста и позволяет продолжать развитие культуры и проводить масштабирование. Используя ферментер и растворенный кислород в количестве около 0-3%, мы смогли вырастить до 10⁸ бактерий/мл. Мы смогли также держать культуральные бактерии в состоянии активного роста в течение многих месяцев и ожидаем, что сможем сделать это в течение неограниченного времени.

До настоящего изобретения обычно считалось, что клетки должны прикрепляться к поверхности для того, чтобы инфицироваться L.intracellularis. Клеточные суспензии настоящего изобретения уникальны и противоречат этой теории. При использовании клеток McCoys или IEC-18, наряду со средой, предпочтительно добавить желатин, агарозу, коллаген, акриламидные или кремний-содержащие гранулы, такие как пористые микроносители Cultisphere-G, производимые фирмой ХайКлон Лэборэтрис (Логан, Юта). Однако клетки Нер-2 и другие в соответствии со способом культивирования данного изобретения не нуждаются в микроносителях. Это обеспечивает особенно благоприятный и экономичный путь для крупномасштабного культивирования.

В случае культуры клеток Нер-2 для целей ее поддержания предпочтительно 25-50% культуры удаляется с недельными интервалами и заменяется свежей средой. В случае клеточных культур с микроносителями или бусами предпочтительно 25-50% культуры удаляется 1-2 раза в неделю и заменяется свежими микроносителями или бусами и свежей средой. В целях масштабирования к культуре могут быть добавлены дополнительные 25-50% среды или среды с микроносителями.

В зависимости от скорости, с которой культуральные клетки становятся инфицированными, пассаж в свежие клетки обычно проводят в интервале между примерно каждой 2 и примерно каждой 5 неделями. Полагая, что культуральные клетки за 2-3 недели становятся инфицированными, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно проводить пассаж примерно между каждыми 3-4 неделями.

Настоящее изобретение обеспечивает также вакцины и способы получения вакцин против L.intracellularis. В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления изобретения после поддержания инфицированных клеток в суспензии в течение продолжительного времени (например, 6-8 месяцев), по меньшей мере, часть культивированных бактерий L.intracellularis собирают и проверяют на возможную аттенуацию. Такой мониторинг предпочтительно выполняется с помощью животного-хозяина или моделей животных-мишеней для того, чтобы отобрать аттенуированный штамм. Такие аттенуированные штаммы используются в вакцинах в соответствии со способами, приведенными здесь. Аттенуированные вакцины L.intracellularis в соответствии с настоящим изобретением проявили эффективность против инфекции, вызванной L.intracellularis, у разнообразных животных и, как ожидается, будут так же активны и у человека.

Настоящее изобретение дает возможность культуре быстро развиваться (100-1000-кратное увеличение выходов) и снижает затраты. В итоге обильные запасы бактерий L.intracellularis, произведенные в соответствии с методом культивирования этого изобретения, легко аттенуируются в целях производства вакцины. Аттенуация в монослойных культурах затруднена из-за низкого выхода бактерий, полученных с использованием обычных приемов культивирования монослоев. В противоположность этому способ культивирования L.intracellularis настоящего изобретения значительно легче, быстрее и увеличивает количество бактерий, необходимых для этой цели. Чем больше клеток и происходящих клеточных делений, тем выше уровень наблюдающихся мутаций, которые имеют преимущественное значение в создании вакцины. Культивирование в суспензиях в соответствии с этим изобретением повышает экспрессию важных иммуногенов, контролируемых экологически регулируемыми генами и продуктами их экспрессии.

Образующиеся аттенуированные штаммы могут культивироваться в монослойных тканевых культурах, как описано ниже в примере 1, но предпочтительно культивируются в суспензионных культурах в соответствии со способом этого изобретения. Другие способы аттенуации могут включать химическую аттенуацию с использованием, например, N-метилнитрозогуанидина и других соединений, известных специалистам. Независимо от того, используются ли множественные пассажи или химические способы, продуцируются аттенуированные бактерии L.intracellularis и отбираются для получения вакцины.

В соответствии с одним из вариантов получения вакцины по этому изобретению антиген собирают центрифугированием или микрофильтрацией, как описано выше. Затем антиген стандартизуют на определенном уровне, основанном на оптимальном иммунном ответе животного-хозяина, определяемом титрованием дозы у видов животного-хозяина. Бактерии могут быть инактивированы продолжительной экспозицией, например, в течение одной недели, с кислородом окружающей среды или применением 0.3% формалина или других инактивирующих агентов с целью получения убитой вакцины. Затем антиген включается в соответствующий адъювант, такой как гидроксид алюминия или минеральное масло, для усиления иммунного ответа. После этого антиген используют для вакцинации хозяина посредством внутримышечной или подкожной инъекции, в случае свиней в возрасте около 3-4 недель, при необходимости с усиливающей иммунизирующей дозой.

Альтернативно, в соответствии с особо предпочтительным вариантом получения вакцины по этому изобретению, бактерии с использованием ранее описанных методов культивирования пассировали по сериям с целью индукции и отбора аттенуированной, авирулентной живой культуры. Культуру тестировали на признаки аттенуации на животном-хозяине (предпочтительно после роста суспензионной культуры в течение, по крайней мере, 6 и до 8 месяцев или более). Культуру собирали, как описано ранее, и разбавляли. Например, свиней вакцинировали, вводя перорально от 1×10⁵ до 1×10⁶ бактерий. Примерно через двадцать восемь дней после вакцинации свиней инокулировали, вводя перорально по 1×10⁷ бактерий из вирулентной культуры L.intracellularis с меньшим числом пассажей (время жизни около 30-45 дней). Инфицированных животных вскрывали через 21 день после введения и исследовали тонкий кишечник на большие поражения, а также на микроскопические поражения. Должен быть проведен также анализ с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и флуоресцирующих антител (ФА). Анализом методами ПЦР и ФА примерно у 80% контрольных животных обнаружены большие или микроскопические поражения и положительная проба на присутствие L.intracellularis в клетках слизистой оболочки кишечника. У вакцинированных животных при гистологическом анализе будет нормальная слизистая оболочка и отрицательный анализ методом ПЦР.

Обычно аттенуированный иммуногенный штамм L.intracellularis получают после продолжительного культивирования в течение, по меньшей мере, примерно 150 и 250 суток, в ходе которых культуру пассируют, по меньшей мере, от примерно 7 до примерно 12 раз. Другие аттенуированные культуры могут быть продуцированы путем изменения этих параметров до таких пределов, которые используются в приведенных здесь способах мониторинга и селекции.

После этого получают вакцину, включающую иммунологически эффективное количество аттенуированных бактерий L.intracellularis в фармацевтически приемлемом носителе. Соединенные вместе иммуноген и носитель могут быть в виде водного раствора, эмульсии или суспензии. Иммунологически эффективное количество определяется способами, известными специалистам, без чрезмерного экспериментирования с учетом содержащихся здесь доктрин. В общем, при использовании очищенных бактерий количество иммуногена будет находиться в интервале 50-500 микрограмм, предпочтительно в интервале 10⁷-10⁹ ТКИД₅₀.

Вакцины в соответствии с этим изобретением обычно вводят чувствительным животным, предпочтительно свиньям, в одной дозе или более. Живую или убитую вакцину можно вводить 1 или 2 раза с двухнедельными интервалами. Для аттенуированной, живой вакцины предпочтительной является одна доза. Предпочтительными путями введения живых, аттенуированных штаммов являются пероральный или интраназальный, но используется также внутримышечная или подкожная инъекция. Внутримышечная и подкожная инъекция являются предпочтительными путями введения убитой вакцины.

Эффективный диагноз ПЭС был также затруднен из-за времени, которое требовалось для того, чтобы культивировать причинные бактерии. Итогом настоящего изобретения является то, что теперь стало возможным создать диагностические средства, способствующие быстрому и точному определению наличия L.intracellularis в биологических образцах, взятых у свиней и других животных, чувствительных к ПЭС.

Бактерии L.intracellularis, выросшие в соответствии со способом настоящего изобретения, или компоненты, полученные из таких бактерий, могут использоваться в качестве антигена в иммуноферментном анализе (ELISA-тест) или в другом иммунотесте, таком как анализ с использованием иммунофлуоресцирующего антитела (ИФА), с целью определения антител к L.intracellularis в сыворотке и других жидкостях организма животных, подозреваемых в инфицировании бактериями. В настоящее время предпочтительным иммуноанализом является ИФА, как описано в примере ниже. Альтернативно, бактерии, выросшие в соответствии с данным изобретением, могут использоваться в анализе методом Вестерн-блоттинга.

Предпочтительный протокол ELISA-теста в соответствии с этим вариантом осуществления изобретения следующий:

1. Добавить 0.1 мл/ячейку антигена, разведенного покрывающим буфером. Инкубировать в течение 18 часов при 4°С.

2. Промыть 3 раза ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором).

3. Добавить 25 мл блокирующего буфера в каждую ячейку планшета. Инкубировать от 1 часа до 2 часов при 37°С.

4. Промыть 3 раза водным буфером.

5. Развести сыворотку в блокирующем буфере и добавить 0.1 мл в первые ячейки планшета. Сделать серийные разведения 1:2 по ширине планшета. Инкубировать в течение 1 часа при 37°С.

6. Промыть 3-5 раз водным буфером.

7. Развести конъюгат в блокирующем буфере, добавить по 0.1 мл в ячейки планшета и инкубировать 1 час при 37°С.

8. Промыть 3-5 раз водным буфером.

9. Добавить субстрат.

10. Измерить поглощение света на спектрофотометре.

11. Ячейки, в которые не был добавлен антиген, использовать как слепой опыт.

12. В каждом опыте должна быть использована свиная сыворотка в качестве положительного и отрицательного контроля.

Предпочтительный протокол Вестерн-блоттинга следующий:

1. Подвергнуть антиген электрофорезу в полиакриламидном геле в 12% додецилсульфате натрия (ДСН-ПАГЭ) и перенести на нитроцеллюлозную мембрану.

2. Поместить мембрану в блокирующий буфер на 2 часа.

3. Удалить блокирующий буфер и промыть ЗФР в течение 1 минуты.

4. Развести сыворотку в блокирующем буфере и добавить к мембране. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.

5. Промыть 3 раза водным буфером (5 минут на каждую промывку).

6. Развести конъюгат в блокирующем буфере и добавить к мембране. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.

7. Промыть 3 раза водным буфером.

8. Добавлять субстрат в течение 10 минут или до тех пор, пока не появится сильная полоса.

9. Промыть ЗФР.

10. Сушить на воздухе и хранить в темноте.

Далее настоящее изобретение описывается следующими примерами, которые представлены только в иллюстративных целях и не должны интерпретироваться как ограничивающие.

Пример 1

Выделение L.intracellularis из кишечника американских свиней со свиной пролиферативной энтеропатией

Материалы и методы:

Отбор образцов инокулята:

Образец №24912 был получен от стада на ферме в Айове, где у пятнадцати из 300 пятимесячных откормленных свиней наблюдался устойчивый кровавый стул несмотря на лечение пенициллином. При вскрытии свиней кишечник (подвздошная кишка) имел(а) утолщенную слизистую оболочку. Гистопатологические исследования с серебряным окрашиванием демонстрировали наличие изогнутых внутриклеточных палочковых бактерий и криптовую энтероцитную гиперплазию, подтверждающую диагноз ПЭС. Образец №72994 был получен от полуторагодовалой второго помета свиноматки SPF с фермы из Миннесоты. Поголовье стада составило примерно 70-80 свиноматок, лечение антибиотиком не проводилось. После вскрытия слизистая оболочка подвздошной кишки была утолщенной с признаками геморрагии. Окрашивание слизистой оболочки по Гиминезу демонстрировало много изогнутых палочковых бактерий. Образец №101494 был получен от 12-недельной взрослой свиньи на ферме в Индиане с 600 свиноматок различной упитанности (от морщинистой до откормленной). Свинью лечили тиланом, вводимым при появлении признаков геморрагической диареи, но животное погибло вскоре после обработки.

Приготовление полученного от свиньи бактериального инокулята:

Кишечные образцы выдерживали при -70°С. Кишечники вскрывали и промывали ЗФР. Образец слизистой оболочки в количестве 1 г соскребали в раствор натрий-калийглутамата (НКГ) и гомогенизировали в течение 30 секунд с 4.0 мл 1% трипсина (ДжРХ Биосайенсис, Ленекса, Канзас) в НКГ. Суспензии инкубировали в течение 35 минут при 37°С. Добавляли 10 мл смеси НКГ-10% эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) (ДжРХ Биосайенсис, Ленекса, Канзас) и образцы измельчали в течение 1 минуты в измельчителе тканей. Добавляли 10 мл смеси НКГ-10% ЭТС, фильтровали через бумажный фильтр (Ватман 113в, фирма Ватман Лэбсэйлс, Хиллсборо, Орегон) и последовательно через мембранные фильтры 5.0, 1.0 и 0.65 микрон. Фильтраты разделяли на аликвоты по 1.0 мл и замораживали при -70°С. Мазок из слизистой оболочки наносили на предметное стекло для окрашивания по Гименезу. Отдельные мазки фильтратов красили ИФА с использованием специфичного моноклонального антитела к L.intracellularis. S.McOrist и др., Vet. Rec. 121:421-422 (1987) (включена здесь полностью в виде ссылки).

Клеточная культура:

Клетки IEC-18 (эпителиальные клетки кишечника крысы, АКТК CRL-1589) выращивали в ДМСИ (ДжРХ Биосайенсис, Ленекса, Канзас) с L-глутамином и 10% ЭТС и пассировали еженедельно рутинным способом с использованием трипсина. Клеточные монослои выращивали при 37°С на воздухе с 5% СО₂.

Инфицирование клеточной культуры:

Клетки IEC-18 высевали по 1.25×10⁵ клеток в планшеты с поверхностью по 25 см² и при сопоставимых соотношениях на камерные стекла (Нунк, Инк., Напервилл, Иллинойс), инкубировали 24 часа, затем удаляли среду. Замороженные бактериальные изоляты, полученные от свиней, быстро оттаивали и разводили в ДМСИ-7% ЭТС с ванкомицином (100 мкг/мл) и амфотерицином В (2.0 мкг/мл) при соотношениях 1.0 мл гомогената на 15 мл среды и прибавляли к монослоям. Монослои и бактериальные суспензии центрифугировали в течение 30 минут при 2000g и переносили в анаэробные сосуды. Сосуды эвакуировали, газ заменяли водородом и двуокисью углерода, чтобы получить смесь 8.0% О₂, 10% СО₂ и 82% Н₂. Культуры инкубировали в течение 3 часов при 37°С, затем вновь вводили ДМСИ-7% ЭТС с L-глутамином, ванкомицином (100 мкг/мл), неомицином (50 мкг/л) и амфотерицином В (2.0 мкг/мл). Культуры помещали в анаэробные сосуды и инкубировали в течение 6 дней, заменяя среду каждые два дня.

Пассаж L.intracellularis:

Бактерии L.intracellularis получали лизисом клеток с использованием хлористого калия, как описано ранее в работе G. Lawson и др. J.Clin. Microbiol., 31:1136-1142 (1993) (включенной здесь полностью в виде ссылки), затем добавляли к свежим монослоям клеток IEC-18. Среду сливали с монослоев, добавляли 0.1% KCl и клетки инкубировали в течение 10 минут при 37°С. Удаляли KCl, добавляли СФГ/10% ЭТС и слои удаляли механически с помощью клеточного скребка. Клетки лизировали путем трехкратного пропускания через шприц с иглой калибра 21. Клеточные ядра удаляли центрифугированием при 100g в течение 5 минут и бактериальную суспензию в жидком супернатанте прибавляли к свежим однодневным монослоям клеток IEC-18.

Мониторинг инфицирования клеточных культур:

Инфицирование контролировали фиксированием клеток на камерных стеклах охлажденной смесью ацетон-метанол в течение 5 минут. Окрашивание проводили иммунофлуоресцентным и иммунопероксидазным методами. В обоих методах использовали мышиное моноклональное антитело (как описано у S.McOrist и др., Vet. Rec. 121:421-422 (1987)) в качестве первичного антитела и либо конъюгат антимышиного иммуноглобулина G с флуорохромом (флуоросцеинизотиоцианат; Органон Текника Корпорейшн, Дарем, Северная Каролина), либо пероксидазный конъюгат (козий антимышиный иммуноглобулин G; Киркегаард и Перри Лэборэтрис, Инк., Гейтесбург, Мерилэнд). Определение количества бактерий проводили подсчетом на каждом стекле числа специфически окрашенных бактерий в клетках.

Полимеразная цепная реакция:

Образец инокулята и пассированных бактерий вводили в качестве матричной ДНК в ПЦР с использованием метода подготовки образца, праймеров и параметров цикла, как описано в работах Jones и др., J.Clin. Microbial., 31:2611-2615 (1993) и S.McOrist и др. Vet. Microbiol. 1-8 (1994) (каждая из которых включена здесь полностью в виде ссылки). Параметры цикла составляли 93°С в течение 5 минут, 55°С в течение 45 секунд и 72°С в течение 45 секунд для первого цикла. Тридцать три цикла были проведены при ранее упомянутых температурах в течение 45 секунд на каждую температуру, а также один цикл при 93°С в течение 45 секунд, 55°С в течение 45 секунд и 72°С в течение 2 минут. Для инокуляции клеток IEC-18 использовали только позитивные инокуляты. ПЦР использовали также для мониторинга пассированного материала с целью подтверждения инфекций. ДНК, полученную методом ПЦР, передавали на установку для секвенироваиия нуклеиновых кислот в Университет Штата Айова. Результаты секвенирования сопоставляли с последовательностями, полученными Gary F.Jones, как сообщалось в его диссертации (Ph. D.), Университет Миннесоты, Миннеаполис, Миннесота (июнь, 1993).

Результаты:

Отбор образцов инокулята:

У свиней №24912 и №72994 была выраженная ПЭС с кровавым содержимым кишечника и утолщенной слизистой оболочкой. У свиньи №101494 была выраженная ПЭС и выраженная геморрагия, приводящая к образованию большого кровяного сгустка в просвете кишечника. Окрашивание мазков слизистой оболочки по Гиминезу демонстрировало большое количество изогнутых или S-образных бактерий. Окрашивание методом ИФА обнаружило в полученных от свиней бактериальных инокулятах большие количества ярко флуоресцирующих бактерий.

Мониторинг инфицирования клеточных культур:

Инокулированные монослои контролировали оптической микроскопией в течение цикла роста и фиксировали морфологическое изменение клеток. Неинфицированные монослои, выросшие при сниженном давлении кислорода (8% O₂), имели сходную морфологию.

Инфицированные культуры, окрашенные с использованием иммунофлуоресцентного и иммунопероксидазного метода, демонстрировали большие количества изогнутых S-образных специфически окрашенных бактерий внутри клеток. У монослоев не было сливной инфекции. Инфицированные клетки часто были ассоциированы с инфекционным очагом из 1-10 клеток. Сильно инфицированные клетки (т.е. клетки с 30 или более бактериями) также обнаруживались в ассоциации с клетками с менее чем 30 бактериями. Количество бактерий достигало максимального значения на шестые сутки или около того. Заражение зависело от условий специфического роста. Бактерии были успешно пассированы с использованием процедуры клеточного лизиса, описанной здесь. Центрифугирование вновь инокулированных клеток не было необходимым, но увеличивало число инфицированных клеток. Центрифугирование также снижало контаминацию, давая возможность в случае клеток, инфицированных в среде без антибиотиков, заменять ее с трехчасовым интервалом на среду, содержащую антибиотики. Снижение ЭТС в среде от 10% до 7% было необходимо для того, чтобы замедлить рост клеток IEC-18, позволяя бактериям усиленно пролиферировать до слияния слоев.

Полимеразная цепная реакция:

ПЦР хромосомной ДНК во всех изолятах генерировала фрагмент в 319 п.о. (пар оснований), включая праймеры. Фрагмент соответствующего размера визуально сопоставляли с известным позитивным образцом, генерированным McOrist и др. (1994) с использованием ПЦР. Анализ последовательности продуктов ПЦР под №24912, №72994 и №101494 подтвердил близкую гомологию (97-99%) с последовательностью р78, определенной Jones (1993).

Пример 2

Выращивание L.intracellularis в суспензионных культурах клеток Нер-2

Приготовление кишечных гомогенатов для инокулята:

Кишечный гомогенат получали соскабливанием слизистой оболочки отрезка подвздошной кишки от 6.0 до 8.0 см из образцов кишечника, описанных в Примере 1. Трипсин (1%) добавляли к соскобу слизистой оболочки и образцы гомогенизировали непродолжительное время, затем инкубировали в течение 35 минут при 37°С. Затем добавляли 10 мл СФГ/10% ЭБС (эмбриональной бычьей сыворотки) и измельчали образцы в измельчителе тканей. Прибавляли дополнительно 10 мл СФГ/10% ЭБС. Гомогенат пропускали через фильтр Ватман V113 и затем последовательно через фильтры 5.0, 1.0 и 0.65 микрон. Образцы разделяли на аликвоты по 1 мл и замораживали при -70°С.

Инфицирование клеточной культуры:

Метод А:

Культуральные клетки высевали по 1×10⁷ клеток в 50 мл ДМСИ/10% ЭБС во вращающийся сосуд на 100 мл. Культуры инкубировали 24 часа, затем прибавляли ванкомицин и фунгизон. Один сосуд с замороженным гомогенатом кишечника быстро оттаивали и содержимое разводили в 3.0 мл ДМСИ/5% ЭБС с ванкомицином (100 мкг/мл) и амфотерицином В (2.0 мкг/мл). Образец пропускали через фильтр 0.65 микрон и добавляли в сосуд. Культуру помещали в газовую камеру, камеру эвакуировали и регазировали водородом и двуокисью углерода для получения смеси 8.0% O₂, 8.8% СО₂ и 83.2% H₂. Культуру инкубировали в течение 3 часов при 37°С, затем прибавляли неомицин и гентамицин. Через 24 часа культуру вновь заливали ДМСИ/5% ЭБС с L-глутамином, ванкомицином (100 мкг/мл), неомицином (50 мкг/л), гентамицином (50 мкг/л) и амфотерицином (2.0 мкг/мл).

Метод Б:

Два обычных сосуда на 25 см² засевали 1.25×10⁵ клеток Нер-2 в ДМСИ/10% ЭБС и давали клеткам расти в течение 18-24 часов. Во время инокуляции слияние клеток составило 30%. Инокулят разводили в ДМСИ/5% ЭБС. В случае инокулята из гомогената кишечника среда содержала также ванкомицин (100 мкг/мл) и амфотерицин (2 мкг/мл). Культуры помещали в газовую камеру, камеру эвакуировали и регазировали водородом и двуокисью углерода для того, чтобы получить смесь, состоящую из 8.0% O₂, 8.8% CO₂ и 83.2% Н₂. Культуры инкубировали в течение 3 часов при 37°С, затем прибавляли неомицин и гентамицин. Через 24 часа культуру вновь заливали ДМСИ/5% ЭБС с L-глутамином, ванкомицином (100 мкг/мл), неомицином (50 мкг/л), гентамицином (50 мкг/л) и амфотерицином (2.0 мкг/мл). Антибиотики не требовались, когда инокулят представлял собой чистую культуру. Культуры инкубировали в течение 6 дней или до слияния. Клетки выскабливали из сосудов и прибавляли во вращающийся сосуд на 100 мл, содержащий 50 мл ДМСИ/5% ЭБС. Культуру разводили в соотношении 1:2 с недельными интервалами путем выращивания половины культуры и добавления свежей среды или путем перенесения в больший вращающийся сосуд и добавления среды.

Пассаж культуры:

Культуру пассировали в свежие клетки Нер-2 путем высевания 1×10⁷ новых клеток Нер-2 в ДМСИ/5% ЭБС. Новую культуру инкубировали в течение ночи при 8.0% O₂, 8.8% CO₂ и 83.2% H₂. Затем новую культуру инокулировали инфицированной культурой и инкубировали при пониженной концентрации O₂, как описано ранее. Количества инокулята зависели от степени инфицирования исходной культуры.

Сбор и хранение культур:

Культуры собирали путем накопления желаемого количества с помощью центрифугирования при 3000g в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали в растворе СФГ и четырежды пассировали через иглу калибра 25. Культуры разделяли на аликвоты и замораживали при -70°С. Для дальнейшей очистки образец центрифугировали при 145g в течение 5 минут с целью удаления клеточных ядер и осколков. Затем центрифугировали супернатант при 3000 g в течение 20 минут. После этого осадок ресуспендировали в разбавителе.

Определение жизнеспособных бактерий L.intracellularis в тканевой культуре:

Количественную оценку жизнеспособных бактерий L.intracellularis осуществляли определением ТКИД₅₀. Это было выполнено путем удаления 2.0 мл культуры, подлежащей тестированию, и лизиса клеток четырехкратным пропусканием их через иглу калибра 25. Образец по сериям разбавляли в соотношении 1:10 с ДМСИ/5% ЭБС, содержащей ванкомицин (100 мкг/мл) и амфотерицин (2.0 мкг/мл). Разведения в количестве 0.1 мл на ячейку вносили в 96-ячеечный планшет для микротитрования. Планшеты засевали клетками Нер-2 в количестве 1250 клеток/ячейку и выдерживали для роста клеток в течение 18-24 часов до начала инфицирования. Использовали число ячеек в интервале между 3 ячейками/разведение и 6 ячейками/разведение. Планшеты инкубировали в течение 6 дней при концентрации газов: 8.0% О₂, 8.8% СО₂ и 83.2% H₂. Клетки фиксировали охлажденным 50% ацетоном и 50% метанолом в течение 2 минут. В ячейки добавляли моноклональное антитело против IS.intracellularis (McOrist, 1994), разбавленное ЗФР в соотношении 1:2000. Планшеты инкубировали 30 минут при 37°С и затем трижды промывали с ЗФР. Антимышиный ФИТЦ, разбавленный в соотношении 1:30, добавляли в количестве 0.03 мл/ячейку и инкубировали 30 минут при 37°С. Затем планшет трижды промывали бидистиллятом и сушили. Образцы наблюдали под флуоресцентным микроскопом и определяли ТКИД₅₀/мл.

Результаты:

Результаты определения ТКИД₅₀ указывали на то, что культуры содержали до 1×10⁶ бактерий/мл. На это потребовалось 45 дней. За то же время культуральный объем увеличился до 3.0 л.

Пример 3

Рост L.intracellularis в суспензионных культурах клеток McCoys

Приготовление кишечных гомогенатов для инокулята:

Кишечные гомогенаты получали, как описано в Примере 2. Образец бактерий L.intracellularis, культивированных в соответствии со способом следующего примера, по Будапештскому Соглашению от 19 мая 1995 года был помещен на хранение в АКТК (12301 Парклоун Драйв, Роквилл, Мерилэнд США) и обозначен вступительным номером 55672.

Инфицирование клеточной культуры:

Два обычных сосуда на 25 см² каждый засевали 1.25×10⁵ клеток McCoys в ДМСИ/10% ЭБС, давали клеткам расти в течение 18-24 часов. Во время инокуляции слияние клеток составляло 30%. Инокулят разводили в ДМСИ/5% ЭБС. В случае инокулята из гомогената кишечника среда содержала также ванкомицин (100 мкг/мл) и амфотерицин В (2.0 мкг/мл). Культуры помещали в газовые камеры, камеры эвакуировали и регазировали водородом и двуокисью углерода для того, чтобы получить смесь, состоящую из 8.0% O₂, 10% СО₂ и 82% Н₂. Культуру инкубировали в течение 3 часов при 37°С, затем добавляли неомицин и гентамицин. Через 24 часа культуру вновь заливали ДМСИ/5% ЭБС с L-глутамином, ванкомицином (100 мкг/мл), неомицином (50 мкг/л), гентамицином (50 мкг/л) и амфотерицином (2.0 мкг/мл). Антибиотики не требовались, когда инокулят представлял собой чистую культуру. Культуру инкубировали в течение 6 дней или до слияния. Клетки выскабливали из сосудов и прибавляли во вращающийся сосуд на 100 мл, содержащий 50 мл ДМСИ/5% ЭБС и 0.05 г микроносителя Cultisphere-G. Содержимое сосудов перемешивали при вращении со скоростью 40-50 об/мин. Культуру разводили в соотношении 1:2 каждые 2-3 дня либо путем выращивания половины культуры и добавления свежей среды и гранул Cultisphere-G, либо путем перенесения культуры в больший вращающийся сосуд и добавления среды и гранул Cultisphere-G. Окончательная концентрация гранул в культуре составила примерно 0.001 г гранул/мл.

Пассаж культуры:

Культуру пассировали в свежие клетки McCoys путем высевания 1×10 новых клеток McCoys в ДМСИ/2% ЭБС и 0.05 г гранул Cultisphere-G. Новую культуру инкубировали в течение ночи при 8.0% О₂, 8.8% СО₂ и 83.2% Н₂. Затем новую культуру инокулировали 25 мл инфицированной культуры и инкубировали при пониженной концентрации O₂, как описано ранее.

Сбор и хранение культур:

Культуры собирали накоплением желаемого количества с помощью центрифугирования при 3000g в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали в растворе СФГ и четырежды пассировали через иглу калибра 25. Культуры разделяли на аликвоты и замораживали при -70°С. Для дальнейшей очистки образец центрифугировали при 145g в течение 5 минут с целью удаления клеточных ядер и осколков. Затем центрифугировали супернатант при 3000g в течение 20 минут. После этого осадок ресуспендировали в разбавителе.

Определение жизнеспособных бактерий L.intracellularis в тканевой культуре:

Количественную оценку жизнеспособных бактерий L.intracellularis проводили, как описано в Примере 2, с помощью иглы калибра 22 для того, чтобы лизировать клетки, и с использованием клеток McCoys в количестве 1250 клеток/ячейку для того, чтобы засеять планшеты для микротитрования.

Результаты:

Результаты определения ТКИД₅₀ указывали на то, что культуры содержали до 1×10⁶ бактерий/мл. На это потребовалось менее одного месяца. За то же время культуральный объем увеличился до 3.0 л.

Пример 4

Определение инфекционной дозы чистых культур L.intracellularis у животного-хозяина

Краткое описание:

Исследование, включающее 31 свинью, завершали инфицированием обычных 6-месячных свиней чистой культурой L.intracellularis из образца №72994. Свиней произвольно разделяли на 4 группы, которые содержались в отдельных загонах. Группа 1 включала 7 свиней и считалась группой отрицательного контроля, получавшей неинфицированную тканевую культуру либо не получавшей ничего. Группа 2 включала 8 свиней, получавших дозы 10⁷ бактерий/свинью. Группа 3 включала 8 свиней, получавших дозы 10⁶ бактерий/свинью. Группа 4 содержала 8 свиней, получавших 10⁵ бактерий/свинью.

Фекальные мазки для тестирования методом ПЦР брали в 0, 7, 14, 21 и 24 день. На 24 день свиней вскрывали и собирали подвздошную кишку, тощую кишку и ободочную кишку для тестирования методом ПЦР, гистопатологического исследования и ФА.

Тестирование подвздошной кишки методом ПЦР обнаружило присутствие бактерий L.intracellularis у 100% свиней, получавших высокую дозу, у 75% свиней, получавших среднюю дозу, и у 50% свиней, получавших низкую дозу. Результаты гистопатологического исследования указывали на увеличение мононуклеарных клеток в тонком слое собственно слизистой и в подслизистой основе у 88% свиней, получавших высокую дозу, у 75% свиней, получавших среднюю дозу, и у 88% свиней, получавших низкую дозу. Криптовая гиперплазия наблюдалась у 50% свиней, получавших высокую дозу, у 63% свиней, получавших среднюю дозу, и у 50% свиней, получавших низкую дозу. Окрашивание методом ФА обнаружило бактерии L.intracellularis в срезах подвздошной кишки, тощей кишки и ободочной кишки у 88% свиней, получавших высокую дозу, у 63% свиней, получавших среднюю дозу, и у 63% свиней, получавших низкую дозу. Контрольные животные давали отрицательную пробу на присутствие бактерий L.intracellularis, определяемых с помощью ПЦР, ФА и серебряного окрашивания.

В заключение, чистая культура была успешно использована для того, чтобы инфицировать и вызвать повреждения от ПЭС. Постулаты Коха были выполнены с помощью идентификации и выделения бактерий L.intracellularis от инфицированных животных.

Среди животных-мишеней у 100% животных, получивших высокую дозу, выздоровление и идентификация подтверждены с помощью серебряного окрашивания, ФА и ПЦР.

Материалы и методы:

Выращивание инокулята:

Обычный сосуд на 75 см² засевали 3.75×10⁵ клеток Нер-2 в ДМСИ/10% ЭБС и давали клеткам расти в течение 18-24 часов при 37°С и 5% СО₂. (Во время инокуляции слияние клеток составило 30%). Один сосуд под №72994 разводили в 15 мл ДМСИ/5% ЭБС. Культуры помещали в газовую камеру, камеру эвакуировали и регазировали водородом и двуокисью углерода для того, чтобы получить смесь, состоящую из 8.0% O₂, 8.8% CO₂ и 83.2% H₂. Через 24 часа культуру вновь заливали ДМСИ/5% ЭБС.

Культуры инкубировали в течение 6 дней, затем клетки выскабливали из сосудов и прибавляли во вращающийся сосуд на 100 мл, содержащий 50 мл ДМСИ/5% ЭБС. Объем содержимого сосуда увеличивался путем удвоения объема среды с недельными интервалами. Культура росла во вращающемся сосуде в течение 3 недель.

Сбор культур:

Культуру собирали центрифугированием при 3000g в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали в растворе СФГ с 10% ЭБС и четырежды пассировали через иглу калибра 25. Инокулят разбавляли до конечного объема в СФГ/10% ЭБС и делали разведения 1:10.

Инокулят для контролей состоял из неинфицированных клеток Нер-2, разбавленных до той же самой концентрации жизнеспособных клеток, что и инфицированная культура. Клетки собирали таким же образом, как и инфицированную культуру. Контрольные свиньи получали дозу клеток, подобную той, которую получали животные в группе с высокой дозой клеток.

Количественная оценка бактерий L.intracellularis:

Количественную оценку жизнеспособных бактерий L.intracellularis осуществляли определением ТКИД₅₀. Это было выполнено путем удаления 2.0 мл культуры, подлежащей тестированию, и лизиса клеток четырехкратным пропусканием их через иглу калибра 22. Образец по сериям разбавляли в соотношении 1:10 с ДМСИ/5% ЭБС, содержащей ванкомицин (100 мкг/мл) и амфотерицин (2.0 мкг/мл). Разведения в количестве 0.1 мл на ячейку вносили в 96-ячеечный планшет для микротитрования. Планшеты засевали клетками Нер-2 в количестве 1250 клеток/ячейку и выдерживали для роста клеток 18-24 часа до начала инфицирования. Использовали 12 ячеек/разведение. Планшет инкубировали в течение 6 дней при концентрации газов: 8.0% O₂, 8.8% CO₂ и 83.2% N₂. Клетки фиксировали охлажденным 50% ацетоном и 50% метанолом в течение 2 минут. В ячейки добавляли 0.03 мл/ячейку моноклонального антитела против L.intracellularis (McOrist, 1997), разбавленного ЗФР в соотношении 1:2000. Планшет инкубировали 30 минут при 37°С и затем трижды промывали с ЗФР. Антимышиный ФИТЦ, разбавленный в соотношении 1:30, добавляли в количестве 0.03 мл/ячейку и инкубировали 30 минут при 37°С. Затем планшет трижды промывали бидистиллятом и сушили. Образцы наблюдали под флуоресцентным микроскопом и определяли ТКИД₅₀/мл.

Животные:

Тридцать одна разнополая свинья шестинедельного возраста от самок породы PICxLieske и большие белые хряки были предоставлены доктором Кентом Шварцем. По весу в нулевой день свиньи были произвольно распределены по четырем загонам.

Оборудование:

Для размещения свиней использовали небольшой питомник с 4 загонами, каждый загон был разделен, по меньшей мере 3 стойками. Загоны имели проволочный настил и твердые перегородки. Тепло подавалось от тепловой камеры с дополнительным зональным нагревом с помощью нагревательных ламп. В ходе исследования поддерживалась температура между 78 и 85°F.

Корм и вода:

Корм злако-соевый с 18% белка без антибиотиков подавался без ограничений через кормушки из нержавеющей стали. Вода подавалась без ограничений через поилки с сосками.

Заражение свиней:

В нулевой день свиней взвешивали и собирали образцы крови через капиллярную трубку, помещенную в ретроорбитальный синус. Сыворотку собирали и хранили замороженной при -20°С. Собирали также фекальные мазки для ПЦР. Свиньи получали по 10 мл инокулята, веденного интрагастрально через желудочный зонд.

Лечение	Число свиней
Контроль - неинфицированные клетки	5
Контроль - без лечения	2
Высокая доза	8
Средняя доза	8
Низкая доза	8

Взвешивание свиней и сбор образцов крови проводили в 0, 7, 17 и 24 день.

Полимеразная цепная реакция:

Заражение свиней контролировали методом ПЦР с использованием праймеров и параметров цикла, как описано Jones (1993). Фекальные образцы собранные в 0, 7, 14, 21 и 24 день так же, как и образцы слизистой оболочки, контролировали методом ПЦР.

Гистопатологическое исследование:

Срезы подвздошной кишки, тощей кишки и ободочной кишки фиксировали формалином, обрабатывали общепринятым способом, окрашивали гематоксилином и эозином, а также ипрегнированием серебром и оценивали. Срезы окрашивали также с использованием моноклонального антитела, специфичного к L.intracellularis.

Результаты:

Клинические симптомы:

Клинические симптомы, включающие жидкий стул, были обнаружены первыми в группе, получавшей высокую дозу, на 3 день. Симптомы были наиболее сильно выражены на 14 день, после чего начали исчезать.

Увеличение веса:

Данные, полученные при вычислении среднего ежедневного увеличение веса свиней, свидетельствовали о том, что в группах, получавших среднюю дозу, увеличение веса было ниже, чем в контрольной группе. При сопоставлении групп отмечено, что увеличение веса имеет дозо-зависимый эффект.

ПЦР:

Фекальный сброс не наблюдался до 14 дня. На 21 день пробы фекалий у 37.5% свиней, получавших высокую дозу, были положительными по методу ПЦР. После вскрытия положительный анализ методом ПЦР слизистой оболочки подвздошной кишки составил 100% у получавших высокую дозу, 75% у получавших среднюю дозу животных и 0% в контрольной группе.

Сильные поражения:

Сильные поражения были отмечены у 2 свиней в группе, получавшей высокую дозу (#2 и #202). У этих свиней подвздошная кишка была утолщена примерно на 3 фута, с некрозом у #202.

Гистопатологическое исследование:

Окрашивание с помощью ФА срезов подвздошной кишки, тощей кишки и ободочной кишки выявило присутствие бактерий L.intracellularis у 87.5% животных, получавших высокую дозу, у 62.5% животных, получавших как среднюю, так и низкую дозу, и у 0% в контроле.

Микроскопические поражения:

Повреждения наблюдали у 100% получавших высокую дозу, у 75% получавших среднюю дозу животных, у 87.5% получавших низкую дозу животных и у 14% животных в контроле. Это определялось при наблюдении увеличенных мононуклеарных клеток в собственно слизистой и в подслизистой основе, что часто связано с гиперплазией Пейера-Патчерс. Наблюдалась также криптовая гиперплазия.

Серебряное окрашивание:

Было проведено также серебряное окрашивание срезов на присутствие внутриклеточных изогнутых бактерий. Оно продемонстрировало присутствие бактерий у 87.5% получавших высокую дозу животных, у 62.5% получавших среднюю дозу животных, у 87.5% получавших низкую дозу животных и у 0% в контроле.

Обсуждение:

Свиньи были успешно инфицированы чистыми культурами L.intracellularis. При дозе 10⁷ бактерий у 100% свиней наблюдали инфекцию по данным ПЦР и микроскопические поражения. Тяжесть поражений и количество бактерий в срезах тканей были сравнительно низкими. Это исследование является хорошей моделью мишени для бактерий L.intracellularis благодаря наличию их и микроскопических поражений у свиней. Поражения могут быть усилены второй дозой через 7 дней после первой.

Пример 5

Эксперимент по изучению эффективности вакцины хомяков

Цель:

Оценить лабораторную животную модель для определения безопасности и эффективности авирулентной, живой вакцины L.intracellularis у хомяков.

Краткое изложение:

Исследование на 40 хомяках выполнялось путем вакцинации трехнедельных хомяков чистыми культурами высокопассированного штамма L.intracellularis и контрольным заражением через 22 дня после вакцинации чистыми культурами низкопассированного вирулентного материала. Хомяков разделяли на 3 группы. Группу А вакцинировали одной дозой штамма L.intracellularis №72994 в нулевой день. Группа В была обозначена как контрольная группа и не получала культуру вакцины. Обе группы заражали двумя дозами чистой культуры штамма L.intracellularis №343 на 22 и 25 день после вакцинации. Группа С получала контрольный (проверочный) штамм №101494 для того, чтобы сравнить относительную вирулентность к штамму №343. Группы А и В содержали по 15 хомяков каждая, а группа С содержала 10 хомяков. Результаты определения ТКИД₅₀ указывали на то, что хомяки были вакцинированы 10⁵ ТКИД₅₀/дозу. Штамм контрольного заражения №343 содержал 10^5,5 ТКИД₅₀/дозу. Доза контрольного заражения для группы С составила 10^2,75 ТКИД₅₀/дозу. Для тестирования методом ПЦР фекальные мазки собирали на 0, 7, 14, 21, 29, 36 и 43 день. На 21 день вскрывали по пять животных из групп А и В для исследования слизистой методом ПЦР, а также для окрашивания с помощью ФА, гематоксилина, эозина и серебряного окрашивания срезов подвздошной кишки с целью определения персистенции колоний бактерий у вакцинированных хомяков. Остающихся животных вскрывали на 21 день после контрольного заражения и проводили тестирование подобным образом.

Данные ПЦР указывали на присутствие бактерий L.intracellularis в слизистой кишечника у 100% хомяков в группе А на 21 день после вакцинации. У хомяков группы В на 21 день после вакцинации тесты были отрицательными. На 21 день после контрольного заражения анализ методом ПЦР был положительный у 50% хомяков из группы А и у 100% хомяков из группы В. Гистопатологическое исследование срезов указывало на изменяющиеся от слабых до сильных поражения у 50% животных из группы А и слабые поражения у 50% животных в группе В на 21 день после контрольного заражения. Ни у одного животного не было поражений на 21 день после вакцинации. В группе В у животных не было поражений на 21 день после контрольного заражения. Окрашиванием с помощью ФА и серебра не удалось обнаружить присутствие бактерий L.intracellularis ни в одном из срезов.

В заключение, у хомяков, вакцинированных высокопассированным штаммом L.intracellularis, наблюдалось снижение инфекции на 50%, что было продемонстрировано методом ПЦР. В кишечнике образовывались колонии бактерий с небольшим количеством внутриклеточных организмов, что было продемонстрировано отсутствием наблюдаемых организмов при окрашивании срезов с помощью ФА и серебряного окрашивания. У хомяков в группе С в ходе всего исследования не удалось обнаружить признаков инфекции, что, наиболее вероятно, объясняется низкими дозами бактерий.

Материалы и методы:

Описание хомяков:

Использовали 40 хомяков-самок трехнедельного возраста от фирмы Хэрлан Спрэк Доулей.

Выращивание инокулята:

Культура вакцины:

Использовали продолжающуюся культуру бактерий L.intracellularis, выросших в клетках Нер-2 в течение 29 недель. Культуру выращивали подобно тому, как описано в разделе о культуре повторного заражения, за исключением того, что культуру пассировали в новые клетки Нер-2 каждые 2-3 недели.

Культуры для повторного заражения:

В один обычный сосуд для тканевых культур на 75 см² высевали 3.75×10⁵ клеток McCoys в ДМСИ с 10% ЭБС и давали возможность клеткам расти 18-24 часа при 37°С в атмосфере с 5% CO₂. Среду сливали с клеток и в сосуд добавляли содержимое одного флакона со штаммом №143 MSC X, разведенное 14 мл ДМСИ/2% ЭБС. Культуру помещали в газовую камеру, камеру эвакуировали и регазировали водородом и двуокисью углерода для того, чтобы получить смесь 8.0% O₂, 8.8% CO₂ и 83.2% H₂. Культуру выращивали в течение 6 дней, затем клетки соскребали во вращающийся сосуд на 100 мл с 90 мл ДМСИ/2% ЭБС и 1.0 г гранул Cultisphere-G. Культуру выращивали при концентрации газа, указанной выше. Объем содержимого сосуда увеличивали удвоением объема среды с недельными интервалами. Культуру выращивали во вращающемся сосуде в течение 25 дней до конечного объема 250 мл.

Штамм №101494 выращивали таким же образом, как и штамм №343.

Сбор культур:

Культуру собирали центрифугированием при 3000g в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали в растворе СФГ с 10% ЭБС и четырежды пропускали через иглу калибра 25. Инокулят разбавляли до конечного объема (15 мл) в СФГ/10% ЭБС.

Культуры для контрольного заражения:

Культуры собирали центрифугированием при 3000g в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали в растворе СФГ с 10% ЭБС и четырежды пропускали через иглу калибра 25. Инокулят разбавляли до конечного объема в СФГ/10% ЭБС (20 мл для штамма №343 и 10 мл для штамма №101494).

Дозы, вводимые хомякам:

Вакцина:

В нулевой день всех хомяков группы А вакцинировали, вводя перорально 1 мл приготовленной вакцины.

Контрольное заражение:

На 22 день после вакцинации 10 хомякам из группы А и 10 хомякам из группы В вводили перорально по 0.5 мл контрольного культурального штамма №343. Группу С заражали дозой 0.5 мл контрольного культурального штамма №101494.

Количественная оценка IS Intracellularis:

Количественную оценку IS Intracellularis проводили определением ТКИД₅₀. Это было выполнено путем удаления 2.0 мл культуры, подлежащей тестированию, и лизиса клеток четырехкратным пропусканием их через иглу калибра 22. Образец по сериям разбавляли в соотношении 1:10 с ДМСИ/5% ЭБС, содержащей ванкомицин (100 мкг/мл) и амфотерицин (2.0 мкг/мл). Разведения в количестве 0.1 мл/ячейку вносили в 96-ячеечный планшет для микротитрования. Планшеты засевали клетками McCoys в количестве 1250 клеток/ячейку и инкубировали в течение 18-24 часов до начала инфицирования. Использовали 12 ячеек/разведение. Планшет инкубировали в течение 6 дней при концентрации газов: 8.0% O₂, 8.8% CO₂ и 83.2% N₂. На 6 день клетки фиксировали охлажденным 50% ацетоном и 50% метанолом в течение 2 минут. В ячейки добавляли 0.03 мл/ячейку моноклонального антитела против IS intracellularis, разбавленного ЗФР в соотношении 1:2000. Планшет инкубировали 30 минут при 37°С и затем трижды промывали с ЗФР. Антимышиный ФИТЦ, разбавленный в соотношении 1:30, добавляли в количестве 0.03 мл/ячейку и инкубировали 30 минут при 37°С. Затем планшет трижды промывали бидистиллятом и сушили. Образцы наблюдали под флуоресцентным микроскопом и определяли ТКИД₅₀/мл.

Мониторинг заражения хомяков:

Заражение хомяков контролировали методом ПЦР с использованием праймеров и параметров цикла, как описано Gary Jones. Фекальные образцы собирали в 0, 7, 14, 21, 29, 36 и 43 день после вакцинации. После гибели хомяков слизистую оболочку кишечника также контролировали с помощью ПЦР.

Гистопатологическое исследование:

Срезы подвздошной кишки и ободочной кишки фиксировали формалином, обрабатывали общеизвестными методами, окрашивали гематоксилином, эозином и импрегнированием серебра и оценивали. Срезы окрашивали также с помощью моноклонального антитела, специфичного к L.intracellularis.

Среднее ежедневное увеличение веса:

Вес хомяков измеряли на 21, 28, 35 и 42 день после вакцинации с целью определения среднего ежедневного увеличения веса.

Результаты:

Смотри Таблицу ниже.

Определение ТКИД₅₀:

Результаты определения ТКИД₅₀ свидетельствовали о том, что вакцинированная группа (группа А) получила 10^4,86 ТКИД₅₀/хомяка. Хомяки в группах А и В при контрольном вакцинировании штаммом №343 получили 10^5,5 ТКИД₅₀. Группа С хомяков, вакцинированная штаммом №101494, получила 10^2,75 ТКИД₅₀/хомяка.

Данные ПЦР:

Исследование методом ПЦР показало присутствие бактерий L.intracellularis у 100% вакцинированных хомяков, которых вскрыли на 21 день после вакцинации. Тестирование на 43 день после вакцинации продемонстрировало, что 100% контрольных хомяков и 50% вакцинированных хомяков были инфицированы бактериями L.intracellularis. Ни у одного из хомяков, получивших контрольное заражение штаммом №101494, не было положительной пробы. В ходе исследования ни у одного хомяка не был отмечен фекальный сброс.

Гистопатологическое исследование:

Окрашивания с помощью гематоксилина и эозина всех срезов, полученных при вскрытии хомяков на 21 день после вакцинации, не показали гистологических повреждений. Срезы, полученные на 43 день после вакцинации, свидетельствовали о том, что у 50% животных, получавших вакцину, был изменяющийся от слабого до сильного лимфоцитарный энтерит, и 50% животных в контрольной группе имели слабый лимфоцитарный энтерит. В группе, получившей контрольную вакцинацию штаммом №101494, не было никаких повреждений.

Окрашивание с помощью ФА не показало наличие бактерий L.intracellularis ни у одного из хомяков на 43 день после вакцинации.

Обсуждение:

У хомяков, вакцинированных высокопассированным штаммом бактерий L.intracellularis, наблюдалось снижение инфекции на 50%, как продемонстрировано методом ПЦР.

Пример 6

Эксперимент по определению эффективности свиной вакцины

Цель:

Объектом этого исследования явилась оценка безопасности, персистенции колоний и эффективности авирулентной живой культуры и авирулентной убитой культуры бактерий L.intracellularis у свиней 2-3 недельного возраста. Проведено исследование с животным-хозяином, в ходе которого свиней трехмесячного возраста вакцинировали, затем подвергали вирулентной вакцинации штаммом №343 бактерий L.intracellularis для того, чтобы сравнить различия в защитном действии вакцин.

Методы:

11 декабря 1995 года от фирмы Х и К Фармс было получено всего 45 свиней трехнедельного возраста. Они были перевезены в Ветеринери Рисорсис, Инк., в исследовательский объект, расположенный рядом с Кембриджем, Айова, где они были снабжены бирками, удостоверяющими каждую свинью. Свиней выдерживали на этом объекте в течение двух дней до начала исследования с целью адаптации и на протяжении всего исследования давали корм, не содержащий антибиотиков.

13 декабря всех свиней взвесили, собрали образцы крови для приготовления сыворотки, оцененной клинически, и ректальные мазки. Затем свиней произвольно разделили на группы по пять животных и поместили в ванны. Двадцать свиней поместили в отдельное помещение и обозначили как контрольную и строго контрольную группу. Пятнадцать свиней поместили во второе помещение для введения вакцины ISi-1. В третьем помещении было десять свиней для введения вакцины ISi-2.

Живую вакцину получали в НОБЛ Лаборейториз Рисеч и Девелопмент Фэсилити и идентифицировали как экспериментальную серийную вакцину ISi-1. Вакцину ISi-1 (штамм №343) выделяли от свиньи и непрерывно выращивали в чистой культуре в течение 29 недель. Вакцину выращивали в клетках McCoys во вращающихся сосудах при пониженном содержании кислорода до тех пор, пока не наблюдалось примерно 100% заражение. Образец высокопассированного штамма №343, использованный для получения ISi-1, пассировали дополнительные 11 недель ("N343NP40wk") и в соответствии с Будапештским Соглашением от 22 мая 1996 года сдали на хранение в АКТК (12301 Парклоун Драйв, Роквилл, Мерилэнд, США, 20852) под вступительным номером 55783. Культуры собирали центрифугирования при 3000g в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали в растворе СФГ с 10% ФБС и четырежды пассировали через иглу калибра 25. Лизаты центрифугировали при 500g в течение 5 минут с целью осаждения клеточных осколков и гранул микроносителя. Супернатант отделяли и хранили при -70°С, примерно за час до вакцинации его помещали на лед и хранили до введения.

Убитую вакцину (ISi-2) выращивали, пассировали в течение 12.5 недель, собирали таким же образом, как описано выше, и очищали путем перколяционного градиента. Очищенные бактерии затем хранили при -70°С, примерно за неделю до вакцинации хранили при 4°С и при нормальной атмосферной концентрации кислорода, которая является токсичной для бактерий L.intracellularis. К бактериям добавляли AlOH до конечной концентрации 10%. Концентрацию белка определяли по методу Биуретта.

Количественная оценка живой культуры IS intracellularis:

Количественную оценку жизнеспособных бактерий L. Intracellularis проводили определением ТКИД₅₀. Образец по сериям разбавляли в соотношении 1:10 с ДМСИ/5% ЭБС с ванкомицином (100 мкг/мл) и амфотерицином (2.0 мкг/мл). Планшеты для микротитрования с 96-ячейками засевали клетками McCoys в количестве 1250 клеток/ячейку и инкубировали в течение 18-24 часов до начала инфицирования. Образцы по сериям разбавляли в соотношении 1:10 с ДМСИ/5% ЭБС, содержащей ванкомицин (100 мкг/мл) и амфотерицин В (2 мкг/мл). Разведения добавляли в 96-ячеечный планшет для микротитрования в количестве 0.1 мл/ячейку. Использовали 12 ячеек/разведение. Планшет инкубировали в течение 6 дней при 37°С и при концентрации газов: 8.0% O₂, 8.8% СО₂ и 83.2% N₂. Клетки фиксировали охлажденным 50% ацетоном и 50% метанолом в течение 2 минут. В ячейки добавляли 0.03 мл/ячейку моноклонального антитела против L.intracellularis (полученного д-ром Steven McOrist), разбавленное ЗФР в соотношении 1:2000. Планшет инкубировали 30 минут при 37°С и затем трижды промывали с ЗФР. Конъюгат антимышиного иммуноглобулина G с флуорохромом ФИТЦ, разбавленный в соотношении 1:30, добавляли в количестве 0.03 мл/ячейку и инкубировали 30 минут при 37°С. Затем планшет трижды промывали бидистиллятом и сушили. Образцы наблюдали под флуоресцентным микроскопом и определяли ТКИД₅₀/мл, используя для расчета методику Рееда-Менша.

Результаты, полученные определением ТКИД₅₀, указывали на то, что культура ISi-1 содержала 1.8×10³ бактерий/мл. Четвертым инокулятом было плацебо, полученное из клеток культуры, обработанных так же, как и при получении вакцины.

Убитая вакцина была исследована на содержание тотального белка с использованием метода Биуретта и содержала 0.311 мг/мл.

Свиней вакцинировали 13 декабря 1995 года. Живую вакцину вводили всем интраназально в дозе 2 мл по 1 мл/ноздрю. Убитую вакцину (ISi-2) вводили внутримышечно по 1.5 мл/свинью и снова через 14 дней. Всем контрольным животным вводили неинфицированные клетки таким же образом, как и живые вакцины.

Условия наблюдения и образцы:

Фекальные мазки и сыворотки собирали с семидневными интервалами на протяжении всего исследования. Фекальные мазки готовили для исследования методом ПЦР с использованием набора праймеров, включающего 5'-TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' и 5'-TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3', использующихся для амплификации ДНК. Для первого цикла параметры составляли 93°С в течение 5 минут, 55°С в течение 45 секунд и 72°С в течение 45 секунд. Проводили 33 цикла при ранее упомянутых температурах в течение 45 секунд на каждую температуру. Заключительный цикл проводили при 93°С в течение 45 секунд, при 55°С в течение 45 секунд и при 72°С в течение 2 минут, праймеры определяли по Jones и др.

Контрольное заражение:

Всем животным, за исключением группы строгого контроля, на 26 и 27 день после вакцинации давали контрольную культуру, включающую низкопассированные культуральные штаммы бактерий L.intracellularis №343 и №72994, которые выращивали непрерывно между 8 и 12 неделями. Культуру собирали центрифугированием при 3000g в течение 20 минут. Осадки ресуспендировали в растворе СФГ, содержащем 10% ЭБС, и четырежды пассировали через иглу калибра 25. Часть собранной культуры хранили при -70°С, оставшуюся часть выращивали до начала контрольного заражения и собирали. Инокуляты контрольного заражения объединяли и определяли ТКИД₅₀ культуры. До начала введения образцы хранили на льду.

Контрольная культура, введенная 8 января 1996 года, включала 10 бактерий/мл, контрольная культура, введенная 9 января 1996 года, включала 3×10⁴ бактерий/мл. Свиньям вводили по 15 мл контрольной культуры через желудочный зонд в каждый из двух дней. Таким образом, 08.01.96 и 09.01.96 животные получали по 6×10⁵ бактерий/свинью и 4.7×10⁵ бактерий/свинью соответственно.

Результаты:

Безвредность вакцины:

Результаты, полученные при исследовании фекальных мазков с помощью ПЦР: определение бактерий L.intracellularis с использованием ПЦР показало, что ни одна свинья не была бактерионосителем в начале исследования. На седьмой день после вакцинации пробы у всех свиней были отрицательными. На четырнадцатый день после вакцинации у 3 свиней в группе, получавшей штамм ISi-1, пробы были положительными. На двадцать первый день после вакцинации у двух животных в этой группе пробы были положительными, у остальных животных - отрицательными. На двадцать шестой день после вакцинации по данным ПЦР не было ни одного животного-бактерионосителя. На двадцать шестой день после вакцинации 5 свиней из группы, получавшей ISi-1, и контрольных групп, а также 4 свиньи из группы, получавшей ISi-2, были вскрыты. Собранные образцы включали подвздошную кишку, ободочную кишку, лимфатический узел брыжейки, миндалину, а также образцы легкого у свиней с поражениями от предполагаемой пневмонии.

Тестирование методом ПЦР проводили с индивидуальными образцами подвздошной кишки и легкого. Миндалины, ободочную кишку и лимфатические узлы объединяли по группам и проводили ПЦР. Результаты тестирования, полученные с помощью ПЦР, приведены ниже.

Группа	ПЦР образцов подвздошной кишки на 26 день после вакцинации	Ободочная кишка объединен.	Миндалина объединен.	Лимфатич. узел брыжейки объединен.	Легкое объединен.
ISi-1	1 из 5	+	-	-	1 из 1
ISi-2	0 из 4	-	-	-	0 из 1
Контроли	0 из 5	-	-		не опред.
Строгие контроли	не опред.	не опред.	не опред.	не опред.	не опред.

Гистологические срезы подвздошной кишки окрашивали с использованием моноклонального антитела, специфичного к бактериям L.intracellularis, в качестве первичного антитела и конъюгата антимышиного иммуноглобулина G с флуорохромом в качестве вторичного антитела. Бактерии L.intracellularis наблюдали у 3 из 5 свиней из группы, получавшей ISi-1. У остальных животных пробы при окрашивании с помощью флуоресцирующего антитела были отрицательными.

Оставшихся свиней вскрывали на 21 день после контрольного заражения и собирали для оценки такие же образцы. Данные ПЦР приведены ниже.

Группа	ПЦР образцов подвздошной кишки на 21 день после контрольной вакцинации	Ободочная кишка объединен.	Миндалина объединен.	Лимфатич. узел брыжейки объединен.	Легкое объединен.
ISi-1	0 из 10	+	-	-	-
ISi-2	0 из 6	-	-	-	-
Контроли	4 из 10	-	-		-
Строгие контроля	0 из 5	-	-	-	-

В контрольной группе у 7 из 10 животных окрашивание срезов подвздошной кишки с помощью ФА, как отмечено выше, было положительным.

Сыворотки исследовали на образование антител к IgG у свиней после воздействия бактерий L.intracellularis. Опыт проводили путем высевания в планшеты Терасаки для обработанных тканевых культур клеток McCoys в количестве 125 клеток/ячейку и инкубации в течение 18-24 часов перед заражением. Чистую культуру L.intracellularis разбавляли в ДМСИ, содержащей 5% ЭБС, до содержания 1000-3000 бактерий/мл, затем добавляли в ячейки по 0.01 мл/ячейку. Планшеты инкубировали в течение 6 дней при концентрациях газов 8.0% O₂, 8.8% CO₂ и 83.2% N₂. Клетки фиксировали охлажденным 50% ацетоном и 50% метанолом в течение 2 минут. Сыворотки свиней разбавляли в соотношении 1:75 стерильным ЗФР. Разбавленную сыворотку добавляли в ячейки по 0.01 мл/ячейку. Планшеты инкубировали в течение 30-60 минут при 37°С. Планшеты пятикратно промывали стерильным ЗФР. В ячейки добавляли по 0.01 мл/ячейку конъюгата антисвиного иммуноглобулина G с флуорохромом. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Планшеты пятикратно промывали бидистиллятом и высушивали. Образцы просматривали под флуоресцентным микроскопом и ячейки с наблюдаемыми бактериями считали меченными положительно, а ячейки без бактерий - меченными отрицательно.

Результаты:

Группа	Нулевой день	26 дней после вакцинации	47 дней после вакцинации и 21 день после контрольного заражения
ISi-1	0 из 15	6 из 15	8 из 10
ISi-2	0 из 10	3 из 10	5 из 6
Контроля	1 из 15	0 из 15	9 из 10
Строгие контроли	0 из 5	0 из 5	0 из 5

Животные, давшие положительную пробу в нулевой день, тестировались снова с недельными интервалами. Результаты продемонстрировали, что все животные дали серологически отрицательные пробы на 14 день после вакцинации. Это явилось неожиданностью, поскольку в нулевой день возраст свиней составлял три недели, и положительные пробы в этом возрасте могут быть связаны с присутствием материнских антител.

Сыворотки сравнивали с положительной контрольной сывороткой, полученной путем гипериммунизации свиньи введением выросших в чистой культуре бактерий L.intracellularis. Использованная отрицательная контрольная сыворотка была получена от гнотобиотической свиньи из Государственного Университета Южной Дакоты.

Приведенные выше описание и примеры являются всего лишь иллюстрацией предпочтительных вариантов осуществления изобретения, которые успешно выполняются с помощью объектов, характерных признаков и преимуществ настоящего изобретения, и это не означает, что настоящее изобретение ограничено ими. Любые модификации настоящего изобретения, которые соответствуют сущности и сфере действия нижеследующей формулы изобретения, считаются его частью.

1. Способ культивирования бактерий Lawsonia intracellularis, отличающийся тем, что включает этапы инкубации упомянутых бактерий при концентрации кислорода в интервале от более 0 до примерно 18%, в условиях поддержания упомянутых бактерий, находящихся в культивируемых клетках, в суспензии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что включает дальнейший этап пассирования части упомянутых клеток в свежие клетки с целью увеличения выработки бактерий L.intracellularis.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что включает дальнейший этап сбора, по меньшей мере, части упомянутых клеток.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутые бактерии L.intracellularis получают от животных, инфицированных этими бактериями.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что упомянутым животным является свинья.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая инкубация проходит при концентрации кислорода в интервале от более 0 до примерно 8%.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутая инкубация проходит при концентрации кислорода в интервале от более 0 до примерно 3%.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что упомянутые культивируемые клетки выбирают из группы, состоящей из клеток Нер-2, McCoys и IEC-18.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что упомянутые клетки McCoys и IEC-18 инкубируют на микроносителях.

10. Штамм L.intracellularis ATCC 55672, предназначенный для получения вакцины для индукции иммунного ответа к бактериям L.intracellularis.

11. Штамм L.intracellularis ATCC 55783, предназначенный для получения вакцины для индукции иммунного ответа к бактериям L.intracellularis.

12. Способ культивирования бактерий L.intracellularis, отличающийся тем, что включает этапы

(1) заражения культивируемых клеток инокулятом, включающим бактерии L.intracellularis и

(2) инкубации инфицированных клеток при температуре от примерно 36 до примерно 38°С, концентрации кислорода от более 0 до примерно 8% и при перемешивании инфицированных клеток таким образом, чтобы культивировать бактерии L.intracellularis при поддержании инфицированных клеток в суспензии.

13. Способ получения аттенуированного штамма L.intracellularis, отличающийся тем, что включает получение культивируемых клеток, инфицированных бактериями L.intracellularis, инкубацию инфицированных клеток при концентрации кислорода от более 0 до примерно 18%, перемешивание инфицированных клеток таким образом, чтобы культивировать бактерии в суспензии инфицированных клеток, пассирование, по меньшей мере, части культивированных бактерий, сбор, по меньшей мере, части культивированных бактерий и селекцию аттенуированного штамма.

14. Способ определения наличия антител, которые специфически реагируют с бактериями L.intracellularis в биологическом образце, отличающийся тем, что включает этапы получения культивируемых клеток, инфицированных бактериями L.intracellularis, инкубации инфицированных клеток при концентрации кислорода от более 0 до примерно 18%, перемешивания инфицированных клеток таким образом, чтобы культивировать бактерии L.intracellularis в суспензии инфицированных клеток, сбора, по меньшей мере, части культивированных бактерий L.intracellularis, получения биологического образца от животного, контакта образца с собранными бактериями L.intracellularis или компонентом, полученным из них, в условиях, при которых антитело, присутствующее в биологическом образце, реагирует с бактериями L.intracellularis или с компонентом, и установления факта взаимодействия антитела с антигеном, если оно произошло, и, таким образом, определения наличия в упомянутом образце антитела к бактериям L.intracellularis.

15. Вакцина для индукции у животного иммунного ответа к бактериям L.intracellularis, отличающаяся тем, что в фармацевтически приемлемом носителе включает аттенуированный штамм L.intracellularis или убитые бактерии L.intracellularis, при этом указанные убитые бактерии или штамм содержатся в упомянутом носителе в количестве, способном вызвать иммунный ответ.

16. Вакцина по п.15, отличающаяся тем, что включает аттенуированный штамм, полученный в соответствии со способом по п.13.

17. Вакцина по п.15, отличающаяся тем, что включает бактерии L.intracellularis, полученные в соответствии со способом по п.1, причем бактерии являются убитыми.

18. Вакцина по п.15, отличающаяся тем, что включает бактерии L.intracellularis, выделенные из культивируемых клеток, полученных из кишечного гомогената животного, инфицированного L.intracellularis.

19. Вакцина по п.15, отличающаяся тем, что упомянутый аттенуированный штамм представляет собой штамм N343NP40wk.

20. Способ индукции иммунного ответа у животных на бактерии L.intracellularis, отличающийся тем, что включает введение упомянутому животному иммунологически эффективного количества вакцины по п.15.

21. Аттенуированный штамм L.intracellularis N343NP40wk для индукции у животного иммунного ответа к бактериям L.intracellularis, полученный в соответствии со способом по п.13.