Способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода klebsiella

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. Предложен способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Klebsiella. Способ включает получение латекса типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, а оболочка - латекс сополимера стирола и метакрилата цинка при массовом соотношении звеньев 1:0,8-1:0,4, сенсибилизацию латекса моноклональными антителами фракции IgG2a и IgG2b в 0,01 М глициновом буфере при рН 7,2-8,8 без предварительной выдержки и инкубацию сначала при 37°С в течение 130-150 мин, а затем при 8°С в течение 18 ч. Предложенный способ позволяет сократить время получения диагностикума, при этом полученный диагностикум обладает специфичностью 97±0,6 при чувствительности до 10 пг/мл, а время получения результата исследования составляет не более 10 мин. 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и пищевой промышленности.

Известен способ получения диагностикума для определения антигенов вируса гепатита В, согласно которому латекс сополимера стирола и метакрилат цинка сенсибилизируют антителами в 0,1 М глициновом буфере, рН которого 7,0, а затем осуществляют инкубацию при 37°С в течение 2-8 ч (Чайка Н.А., Горбачев Е.Н. Применение реакции агглютинации сенсибилизированного латекса для диагностики вирусных инфекций. Вопросы вирусологии, 1985, №5, с.516-523).

Данный способ позволяет достаточно быстро получить диагностикум, выявляющий вирус гепатита В при концентрации 1 мг/мл. К недостаткам диагностикума относятся: невысокая чувствительность, специфичность - 68,02±0.88 и длительное время получения результата - 20 мин.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерии рода Klebsiella с использованием антительного диагностикума US 5316911 A1, 31.05.1994).

Технической задачей изобретения является сокращение времени получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Klebsiella при высоких значениях чувствительности, специфичности и сокращения времени получения результата при его применении.

Техническая задача изобретения решается при получении диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Klebsiella, причем вначале получают латекс типа ядро-оболочка. Например, реактор продувают 30 мин азотом, загружают: 10% стирола, 0,1% персульфата калия, 89,9% воды, термостатируют, перемешивая при 70°С 7 ч до полной конверсии мономера. В полученный латекс вводят 0,2% стирола, 0,1% метакрилата цинка и 0,05% персульфата калия. Латекс перемешивают до растворения всех компонентов и затем термостатируют при 70°С 2 ч.

Частицы полученного латекса состоят из двух частей: внутреннее ядро - полистирол, наружная оболочка (0,2-20% от массы всей частицы) - статический сополимер стирола и метакрилата цинка в массовом соотношении 1:0,8-1:0,4. Массовое соотношение между звеньями метакрилата цинка и стирола, входящего как в ядро, так и в оболочку, составляет 1-12:100.

Далее проводят сенсибилизацию латекса моноклональными антителами фракции IgG2а и IgG2b фирм "Biogenesis" UK и "Chemicon" USA и др. в 0,01 М глициновом буфере, рН которого 7,2-8,8 до полного связывания, при отсутствии предварительной выдержки латекса в буфере, с последующей инкубацией сначала при 37°С в течение 130-150 мин, а затем при 8°С в течение 18 ч.

Сокращение времени получения диагностикума достигнуто за счет выбора параметров сенсибилизации и инкубации без предварительной выдержки латекса в буфере.

На получение диагностикума с высокой чувствительностью и специфичностью влияют: рН буферного раствора, в котором осуществляют сенсибилизацию, начальная температура инкубации, начальное время инкубации, температура завершения инкубации, время завершения инкубации, В таблице 1 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от величины рН глицинового буфера при начальной температуре инкубации 37±0,4°С в течение 140±5 мин, а затем при 8±0,4°С в течение 18±0,5 ч.

Таблица 1
№	Количество исследований	рН глицинового буфера	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	100	7,0	250000
2	100	7,2	80000
3	100	8,0	20000
4	100	8,8	60000
5	100	9,0	120000

В таблице 2 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от начального времени инкубации при рН буфера, равном 8,0, начальной температуре инкубации, равной 37±0,4°С, и температуры завершения инкубации, равной 8±0,4°С в течение 18±0,5 ч.

Таблица 2
№	Количество исследований	Начальное время инкубации (мин)	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	21	120	60000
2	21	130	30000
3	21	140	10000
4	21	150	10000
5	21	160	30000

Специфичность и чувствительность полученных диагностикумов для определения эндотоксина бактерий рода Klebsiella проверяли в реакции агглютинации латекса с сыворотками крови доноров, не содержащими эндотоксин, больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, не подтвержденными бактериологическими посевами, и больных гнойно-воспалительными заболеваниями. Учет результата реакции проводился по степени активированных частиц.

1. Максимальная степень - крупные хлопья на прозрачном фоне - 4-я степень активированных частиц (4СА) (положительный результат).

2. Средняя степень - хлопья или крупные зерна на слегка мутном фоне - 3-я степень активированных частиц (3СА) (положительный результат).

3. Минимальная степень - много зерен на мутном фоне - 2-я степень активированных частиц (2СА) (положительный результат).

4. Контроль - абсолютно мутный фон или единичные зерна - 1-я степень активированных частиц (1СА) (отрицательный результат).

В таблице 3 приведены результаты исследований.

Таблица 3
№	Исследуемые сыворотки	Количество исследований	Результат определения эндотоксина бактерий рода Klebsiella
			Kleb.spp.	Kleb. oxy	Kleb. pneu.
полож.	отр.	полож.	отр.	полож.	отр.
1	Донорские	30	-	30	-	30	-	30
2	Больных сердечно-сосудистыми заболев.	20	4	16	1	19	3	17
3	Больных гнойно-воспалительными заболев.	29	6	23	2	27	4	25

Специфичность полученного диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Klebsiella составляет 97±0,6 при чувствительности до 10 пг/мл, при этом время получения результата исследования не более 10 мин. Время получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Klebsiella сокращено с нескольких месяцев до нескольких часов.

Способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Klebsiella с использованием антительного диагностикума на латексном носителе, отличающийся тем, что в качестве носителя используют латекс типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, а оболочка - латекс сополимера стирола и метакрилата цинка при массовом соотношении звеньев 1:0,8-1:0,4, который сенсибилизируют моноклональными антителами в 0,01 М глициновом буфере при рН 7,2-8,8 до полного связывания, без предварительной выдержки латекса, а затем инкубируют сначала при 37°С в течение 130-150 мин, а затем при 8°С в течение 18 ч.