Анелированные карбамоилазагетероциклы, способы их получения (варианты), фармацевтическая композиция, фокусированная библиотека
Владельцы патента RU 2266906:
Общество с ограниченной ответственностью "Исследовательский Институт Химического Разнообразия" (ООО "Исследовательский Институт Химического Разнообразия") (RU)
Изобретение относится к новым анелированным карбамоилазагетероциклам общей формулы 1 или 2, обладающим ингибирующим действием в отношении активности протеин-киназы, к фокусированной библиотеке, включающей эти соединения, и фармацевтической композиции на их основе. В общей формуле 1 или 2
R1 представляет атом водорода или необязательно замещенный C1-С6алкил; R2 и R3 представляют независимо друг от друга атом водорода, инертный заместитель, необязательно замещенный C1-С6алкил, необязательно замещенный С3-C8циклоалкил, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил; R4 представляют необязательно замещенный C1-С6алкил, необязательно замещенный С3-C8циклоалкил, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил; А и В вместе с присоединенными к ним атомами углерода и азота образуют необязательно замещенный и необязательно конденсированный азагетероцикл; D и Е вместе с присоединенными к ним атомами углерода образуют необязательно замещенный и необязательно конденсированный фенил или арил, необязательно замещенный и необязательно конденсированный азагетероцикл; К и L вместе с присоединенными к ним атомами углерода и азота образуют необязательно замещенный азагетероцикл. Изобретение также относится к способам получения соединений общих формул 1 или 2. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 25 табл.
Данное изобретение относится к синтезу новых химических веществ, поиску новых физиологически активных веществ, соединений-лидеров и лекарственных кандидатов, получаемых на основании скрининга комбинаторных или фокусированных библиотек соединений, а также к фармацевтической композиции, способам их получения и применения.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым анелированным карбамоилазагетероциклам, представляющим интерес как потенциальные физиологически активные вещества (агонисты, антагонисты и модуляторы рецепторов, ингибиторы ферментов, онколитики, антибактериальные и противопаразитарные агенты и т.д.), к фокусированной библиотеке, включающей анелированные карбамоилазагетероциклы, фармацевтической композиции, содержащей в качестве активной субстанции анелированные карбамоилазагетероциклы, к способам их получения и применения.
Существует большое количество природных и синтетических физиологически активных соединений, молекулы которых представляют собой анелированные азагетероциклы. Среди природных следует отметить антинеопластические и антибактериальные алкалоиды лонгамид, лонгамид В и факеллстатины, выделенные из морских губок Agelus genus, Homaxinella sp. и Phakellia mauritiana [Cafieri, F., et. al. J.Nat.Prod. 1998, 61: 122. Umeyama A., et. al. J.Nat.Prod. 1998. 61: 1433. Poullennec К., Romo D. J.Am.Chem.Soc. 2003, 725: 6344]
Синтетические анелированные карбамоилазагетероциклы проявляют исключительно широкий спектр физиологической активности. Например, 4-метил-2-(3-трифторметилфенил)-гексагидропиридо[1,2-а]пиразин-3-он проявляет свойства анксиолитика и антидепрессанта [Silvestrini, В., Baiocchi, L. ACRAF SpA. WO 8705022, 1987], 3 - [1-оксо-2- [2-(пиперидин-1 -ил)этил] -1,2,3,4-тетрагидро-пирроло [1,2-а]пиразин-7-илкарбоксамидо]пропионовая кислота является антагонистом фибриногенового gpIIb/IIIa рецептора и вследствие этого эффективно ингибируют агрегацию тромбоцитов [Askew, B.C. et al. J.Med.Chem. 1997, 40(12): 1779], а [6S-[6a[R*(транс),8аα]]-N-[1-(4-аминоциклогексил)-2-(2-бензотиазолил)-2-оксоэтил]-1,4-диоксо-2-(3-фенилпропил)-пергидро-пирроло[1,2-a]пиразин-6-карбоксамид является ангикоагулянтом, ингибируя сериновые протеазы тромбин и фактор Ха [Веrryman, К.А.; Doherty, A.M.; Edmunds< J.J.; Siddiqui, M.A. Pfizer Inc. WO 9748706, 1997].
Антибактериальные свойства проявляет 3-изопропилгексагидропирроло[1,2-a]пиразин-1,4-дион [Kwon О. et.al. J.Antibiot. 2001, 54(2): 179], а N-[4-(3-оксо-3,5-дигидро-1,4,8b-триазааценафтилен-4-ил)бутил]трифтрорметансульфонамид является ингибитором рецепторной PDGF-киназы и вследствие этого потенциальным средством для лечения почечной недостаточности, гиперлипидемии и гипертензии [Ikemoto, Т. et al. Tetrahedron 2000, 56(40): 7915]. Высокую антипротозойную активность проявляет 3,4,7,8-тетрагидро-2H-пиразино[1,2-a]индол-1,6,9-трион [Tapia, R. et.al. Eur.J.Org.Chem. 2002, 23: 4005], а 2-{4-[4-(3-трифторметилфенил)пиперазин-1-ил]бутил}гексагидропиридо[1,2-a]пиразин-1,4-дион является высокоэффективным лигандом серотонинового 5-НТ1 а рецептора [Lopez-Rodriguez, М. et.al. J.Med.Chem. 2001, 44(2): 186].
Учитывая высокий потенциал и широкий спектр физиологической активности анелированных азагетероциклов, актуальной является разработка новых соединений этого типа, фокусированных библиотек и фармацевтических композиций, включающих эти соединения, а также способов их получения и применения.
В результате проведенных исследований, направленных на поиск новых физиологически активных веществ, соединений-лидеров, изобретатели получили неизвестные ранее анелированные карбамоилазагетероциклы, которым свойственна физиологическая активность, фокусированную библиотеку и фармацевтическую композицию, включающую эти соединения, разработали способы их получения и применения.
Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании изобретения.
«Комбинаторная библиотека» означает коллекцию соединений, полученных параллельным синтезом, предназначенную для поиска соединения-хита или лидера, а также для оптимизации физиологической активности хита или лидера, причем каждое соединение библиотеки соответствует общему скэффолду и библиотека является коллекцией родственных гомологов или аналогов.
«Фокусированная библиотека» означает комбинаторную библиотеку, или совокупность нескольких комбинаторных библиотек, или совокупность библиотек и веществ, специальным образом организованную с целью увеличения вероятности нахождения хитов и лидеров или с целью повышения эффективности их оптимизации. Дизайн фокусированных библиотек, как правило, связан с направленным поиском эффекторов (ингибиторов, активаторов, агонистов, антагонистов и т.п.) определенных биомишеней (ферментов, рецепторов, ионных каналов и т.п.).
«Соединение-хит» («хит») означает соединение, проявившее в процессе первичного скрининга искомую физиологическую активность.
«Соединение-лидер» («лидер») означает соединение с выдающейся (максимальной) физиологической активностью, связанной с конкретной биомишенью, относящейся к определенной (или нескольким) патологии или болезни.
«Параллельный синтез» означает метод ведения комбинаторного химического синтеза библиотеки.
«Скэффолд» означает общую структурную формулу или молекулярный каркас или инвариантную область соединений, характерную для всех соединений, входящих в комбинаторную библиотеку.
«Нуклеофильный» означает электронно-избыточный реагент.
«Электрофильный» означает электронно-дефицитный реагент.
«Заместитель» означает химический радикал, который присоединяется к скэффолду или полупродукту синтеза в процессе их синтеза, например «нуклеофильный заместитель», «электрофильный заместитель», «NH-защитный заместитель» или «инертный заместитель».
«Необязательно замещенный радикал» означает радикал без заместителей или содержащий один или несколько заместителей, в том числе «нуклеофильный заместитель», «электрофильный заместитель», «NH-защитный заместитель» и/или «инертный заместитель».
«Нуклеофильный заместитель» означает химический радикал, который присоединяется к скэффолду в результате реакции с нуклеофильным реагентом, например, выбранным из группы первичных или вторичных аминов, спиртов, фенолов. меркаптанов и тиофенолов.
«Электрофильный заместитель» означает химический радикал, который присоединяется к скэффолду в результате реакции с электрофильным реагентом, например, выбранным из группы органических галогенидов (необязательно замещенных C1-C7алкилгалогенидов, необязательно замещенных арилС1-C7алкилгалогенидов, необязательно замещенных гетероциклилС1-C7алкилгалогенидов, необязательно замещенных арилгалогенидов, необязательно замещенных гетероциклилгалогенидов), органических кислот или их производных (ангидридов, имидазолидов, галогенангидридов), эфиров органических сульфокислот или органических сульфохлоридов, органических галогенформиатов, органических изоцианатов и органических изотиоцианатаминометилов.
«NH-Защитный заместитель» означает химический радикал, который присоединяется к скэффолду или полупродукту синтеза для временной защиты аминогруппы в мультифункциональных соединениях включая, но не ограничивая амидный заместитель, такой как формил, необязательно замещенный ацетил (например трихлорацетил, трифторацетил, 3-фенилпропионил и др.), необязательно замещенный бензоил и др.; карбаматный заместитель такой как необязательно замещенный C1-C7алкилоксикарбонил, например метилоксикарбонил, этилоксикарбонил, трет-бутилоксикарбонил, 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) и др.; необязательно замещенный C1-C7алкильный заместитель, например трет-бутил, бензил, 2,4-диметоксибензил, 9-фенилфлуоренил и др.; сульфонильный заместитель, например бензолсульфонил, п-толуолсульфонил и др. Более подробно «NH-Защитные заместители» описаны в книге: Protective groups in organic synthesis, Third Edition Greene, T.W. and Wuts, P.G.M. 1999, p. 494-653. Издательство John Wiley & Sons, Inc., New York, Chichester, Weinheim, Brisbane, Toronto, Singapore.
«Инертный заместитель» (или «не мешающий», "Non-interfering substituent") означает низко- или нереакционноспособный радикал включая, но не ограничивая C1-C7алкил, C2-C7 алкенил, C2-C7 алкинил, С1-C7 алкокси, С7-C12 аралкил, замещенный инертными заместителями аралкил, С7-C12 гетероциклилалкил, замещенный инертными заместителями гетероциклилалкил, С7-С12 алкарил, С3-С10 циклоалкил, С3-С10 циклоалкенил, фенил, замещенный фенил, толуил, ксиленил, бифенил, С2-С12 алкоксиалкил, С2- С10 алкилсульфинил, С2-С10 алкилсульфонил, (СН2)m-O-(C1-С7 алкил), -(CH2)m-N(C1-С7 алкил)n, арил, замещенный инертными заместителями арил, замещенный инертными заместителями алкокси, фторалкил, арилоксиалкил, гетероциклил, замещенный инертными заместителями гетероциклил и нитроалкил, где m и n имеют значение от 1 до 7. Предпочтительными «инертными заместителями» являются C1-С7 алкил, С2-С7 алкенил, С2-С 7 алкинил, C1-С7 алкокси, С7-С12 аралкил, С7-C12 алкарил, С3-С10 циклоалкил, С3-С10 циклоалкенил, замещенный инертными заместителями C1-С7 алкил, фенил, замещенный инертными заместителями фенил, (СН2)m-O-(C1-С7 алкил), -(CH2)m-N(C1-С7 алкил)п, арил, замещенный инертными заместителями арил, гетероциклил и замещенный инертными заместителями гетероциклил.
«Арил» означает один или более ароматических циклов, каждый из которых включает 5 или 6 атомов углерода. «Арил» может быть конденсированным полициклом, например, как нафталин или неконденсированным, например, как бифенил. «Замещенный арил» имеет один или несколько заместителей.
«Галоген» означает атом фтора, хлора, брома или иода.
«Гетероцикл» означает один или несколько насыщенных, ненасыщенных или ароматических циклов с 5, 6 или 7 атомами, по крайней мере, один из которых является гетероатомом. Преимущественными гетероатомами являются сера, кислород и азот. «Гетероцикл» может быть конденсированным полициклом, например, как бензимидазол, бензоксазол, бензтиазол, хинолин, или неконденсированным, например, как бипиридил.
«Азогетероцикл» означает гетероцикл, включающий, по крайней мере, один атом азота, например, как пиперидин, морфолин, пиррол, бензимидазол, бензоксазол. бензтиазол, хинолин.
«Замещенный гетероцикл» означает гетероцикл, имеющий один или несколько заместителей.
«Замещенный азогетероцикл» означает азогетероцикл, имеющий один или несколько заместителей.
Целью настоящего изобретения являются новые анелированные карбамоилазагетероциклы.
Поставленная цель достигается анелированными карбамоилазагетероциклами общей формулы 1 и 2
или их фармацевтически приемлемыми солями, N-оксидами или гидратами, в которых
R1 представляет атом водорода или необязательно замещенный C1-С6алкил;
R2 и R3 представляют независимо друг от друга атом водорода, инертный заместитель, необязательно замещенный C1-С6алкил, необязательно замещенный С3-C8 циклоалкил, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил;
R4 представляют необязательно замещенный C1-С6 алкил, необязательно замещенный С3-С8 циклоалкил, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил;
А и В вместе с присоединенными к ним атомами углерода и азота образуют необязательно замещенный и необязательно конденсированный азагетероцикл;
D и Е вместе с присоединенными к ним атомами углерода образуют необязательно замещенный и необязательно конденсированный фенил или арил, необязательно замещенный и необязательно конденсированный азагетероцикл;
К и L вместе с присоединенными к ним атомами углерода и азота образуют необязательно замещенный азагетероцикл;
Согласно изобретению наиболее предпочтительными анелированными карбамоилазагетероциклами являются:
замещенные 1-оксо-1,2,3,4,6,8а-гексагидро-пирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамиды общей формулы 1.1 или их фармацевтически приемлемые соли, N-оксиды или гидраты
в которых R1, R2, R3 и R4 имеют вышеуказанное значение, R5, R6 и R7 независимо друг от друга представляют атом водорода, инертный заместитель, ацетил, или С1-С6алкокскарбонилС1-С4-алкил, или R5 и R6 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, или R6 и R7 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены и образуют необязательно замещенный бензольный цикл, циклоалкен или гетероцикл, например азогетероцикл, тиофен, фуран, 2,3-дигидрофуран, 3,6-дигидро-2Н-пирановый или 3,6-дигидро-2Н-тиопирановый;
замещенные 8-оксо-5,6,7,6-тетрагидро-имидазо[1,2-а]пиразин-6-карбоксамиды общей формулы 1.2 или их фармацевтически приемлемые соли, N-оксиды или гидраты
в которых R1, R2, R3 и R4 имеют вышеуказанное значение, R8 и R9 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный бензольный цикл;
замещенные 2-замещенные 4-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-пиразоло[1,5-а]пиразины-6-карбоксамиды общей формулы 1.3 или их фармацевтически приемлемые соли, N-оксиды или гидраты
в которых R1, R2, R3, R4, R8 и R9 имеют вышеуказанное значение или R8 и R9 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный бензольный или азогетероцикл;
замещенные 1-оксо-1,4-диаза-бициклоалкан-3-карбоксамиды общей формулы 1.7
в которой R1, R2, R3 и R4 имеют вышеуказанное значение, a R10 и R11 вместе с атомами углерода и азота, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный и необязательно конденсированный гидрированный азогетероцикл;
анелированные 3 -оксо-2,3 -дигидро-1Н-пирроло[ 1,2-а]диазепин-1-карбоксамиды общей формулы 2.1
или их фармацевтически приемлемые соли, N-оксиды или гидраты, в которых R2, R3, R4, Е и D имеют вышеуказанное значение, а R12 и R13 независимо друг от друга представляют атом водорода, атом галогена, инертный заместитель.
Целью настоящего изобретения являются способ получения новых анелированных карбамоилазагетероциклов общей формулы 1.
Поставленная цель достигается способом получения новых конденсированных соединений, включающих 3-карбамоил-1-оксо-1,2,3,4-тетрагидро-пиразиновый фрагмент общей формулы 1, который заключается в трехкомпонентной конденсации 1-(2-оксо-этил)-1H-азогетероциклил)-2-карбоновых кислот общей формулы 2, соответствующего первичного амина общей формулы 3 и соответствующего изонитрила общей формулы 4 по приведенной схеме:
в которых R1, R2, R3, R4, А и В имеют вышеуказанное значение.
Целью настоящего изобретения является способ получения новых анелированных карбамоилазагетероциклов общей формулы 2.
Поставленная цель достигается способом получения новых анелированных карбамоилазагетероциклов общей формулы 2, который заключается в конденсации трех компонентов: соответствующего соединения 5, соответствующего первичного амина общей формулы 3 и соответствующего изонитрила общей формулы 4, по приведенной ниже схеме
в которых R2, R3, R4, D, Е, К и L имеют вышеуказанное значение.
Целью настоящего изобретения являются фокусированная библиотека для поиска биологически активных соединений-лидеров.
Поставленная цель достигается фокусированной библиотекой, включающей, по крайней мере, один анелированный карбамоилазагетероцикл общей формулы 1 или 2 или их фармацевтически приемлемую соль, N-оксид или гидрат.
Целью настоящего изобретения является новая фармацевтическая композиция в форме таблеток, капсул или инъекций, помещенных в фармацевтически приемлемую упаковку.
Поставленная цель достигается фармацевтической композицией, включающей, по крайней мере, один анелированный карбамоилазагетероцикл общей формулы 1 или 2 или их фармацевтически приемлемую соль, N-оксид или гидрат.
Ниже изобретение описывается с помощью примеров получения конкретных соединений и фокусированной библиотеки и испытаний ее биологической активности. Структуры полученных соединений подтверждались данными хроматографического и спектрального анализа. Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают данное изобретение.
Пример 1. Общий способ получения конденсированных соединений, включающих 3-карбамоил-1-оксо-1,2,3,4-тетрагидро-пиразиновый фрагмент общей формулы 1.
Перемешивали при комнатной температуре в течение 48-56 часов смесь 1-(2-оксо-этил)-1H-азогетероциклил)-2-карбоновых кислот общей формулы 2 (3,1 ммоль), первичного амина 3 (3 ммоль), изоцианида 4 (3 ммоль) в сухом метаноле (5 мл), образовавшийся осадок отфильтровывали. Получали соединение 1, которое в случае необходимости перекристаллизовывали из подходящего растворителя или подвергали хроматографической очистке на препаративном хроматографе. Получали, с выходом 40-95%, конденсированные соединения, включающие 3-карбамоил-1-оксо-1,2,3,4-тетрагилро-пиразиновый фрагмент общей формулы 1 (см. таблицы 01-23).
Таблица 01. 1-Оксо-1,2,3,4-тетрагидропирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 02. 1-Оксо-1,2,3,4-тетрагидропиразино[1,2-а]индол-3- карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 03. 10-Ацетиламино-1-оксо-1,2,3,4-тетрагидропиразино[1,2-а]индол-3-карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 04. 1-Оксо-10-пиррол-1-ил-1,2,3,4-тетрагидропиразино[ 1,2-а]индол-3 -карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 05. 5-Метил-7-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1-окса-3b,6-диаза-циклопента[а]инден -5-карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 06. 5-Метил-7-оксо-2-фенил-4,5,6,7-тетрагидро-1-окса-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5- карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 07. 5-Метил-7-оксо-2-(R-метил)-4,5,6,7-тетрагидро-1-окса-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5- карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 08. 5-Метил-7-оксо-2-(2-R-этил)-4,5,6,7-тетрагидро-1-окса-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5-карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 09. 5-Метил-7-оксо-2-(3-R-пропил)-4,5,6,7-тетрагидро-1 -окса-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5-карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 10. 7-Оксо-5-фенил-4,5,6,7-тетрагидро-1-окса-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5-карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 11. 5-Метил-7-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-1-тиа-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5-карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 12. 5-Метил-7-оксо-2-фенил-4,5,6,7-тетрагидро-1-тиа-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5- карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 13. 5-Метил-7-оксо-2-(R-метил)-4,5,6,7-тетрагидро-1-тиа-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5-карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 14. 5-Метил-7-оксо-4,5,6,7-тетрагидро-2-(2-R-этил)-1-тиа-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5- карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 15. 5-Метил-7-оксо-2-(3-R-пропил)4,5,6,7-тетрагидро-1-тиа-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5- карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 16. 7-Оксо-5-фенил-4,5,6,7-тетрагидро-1-тиа-3b,6-диаза-циклопента[а]инден-5-карбоксамиды общей формулы 1.1.
Таблица 17. 1-0ксо-1,2,3,4-тетрагидробензо[4,5]имидазо[1,2-а]пиразин-3-карбоксамиды общей формулы 1.2.
Таблица 18. 2-Алкил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидропиразоло[1,5-а]пиразин-6-карбоксамиды общей формулы 1.
Таблица 19. 2-Алкил-5-бензил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидропиразоло[1,5-а]пиразин-6-карбоксамиды общей формулы 1.3.
Таблица 20. 2-Арил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидропиразоло[1,5-а]пиразин-6-карбоксамиды общей формулы 1.3.
Таблица 21. 2-Гетарил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидропиразоло[1,5-а]пиразин-6-карбоксамиды общей формулы 1.3.
Таблица 22. 2-Этилоксикарбонил-4-оксо-4,5,6,7-тетрагидропиразоло[1,5-а]пиразин-6-карбоксамиды общей формулы 1.3.
Таблица 23. 1-Оксо-1,3,4,6,11,11а-гексагидро-2Н-пиразино[1,2-b]изохинолин-3-карбоксамиды общей формулы 1.7.
Пример 2. Эквимолярную смесь дикарбонильного соединения 5, амина 3 и изонитрила 4 в небольшом количестве метанола перемешивали при температуре 40-50°С 12-72 часа, контролируя ход реакции по ТСХ (Силуфол, метанол-хлороформ 1:19). Образовавшиеся осадки отфильтровывали и промывали эфиром. Гомогенные реакционные массы выливали в воду, экстрагировали продукт хлороформом и хроматографировали на короткой колонке с силикагелем. Элюат упаривали и остаток перекристаллизовывали из смеси гексан-этилацетат 10:1. Получали, с выходом 45-90%, анелированные 7-оксо-2,3,4,7-тетрагидро-1 Н-[1,4]диазепин-2-карбамиды общей формулы 2, представленные в Таблице 24.
Пример 3. Составили фокусированную библиотеку, включающую соединения общей формулы 1 и 2, представленные в Таблицах 01-24, и испытали ее на способность ингибировать активность протеин-киназы, которая определялась следующим образом. Раствор полипептида (Calbiochem, USA), состоящего из случайной последовательности глутаминовой кислоты и тирозина в количественном соотношении 4:1 соответственно выдерживался в лунках 96-луночных тарелок с оптически прозрачным дном в течение ночи. За это время полипептид прочно сорбировался на поверхности лунок. Сорбированный полипептид служил субстратом для киназы, которая фосфориллировала тирозин в этом полипептиде.
Добавляли 100 микролитров 1U киназы (Calbiochem, USA, 1U определялась как концентрация этого фермента, способная присоединить к субстрату пикомоль фосфата за 1 минуту) в лунки с адсорбированным полипептидом без тестируемых соединений (контрольная активность) или в присутствии разных концентраций этих соединений. После 30-минутной инкубации эти растворы удаляли путем вытряхивания из лунок и лунки дважды промывались физиологическим раствором. В лунки заливали 100 микролитров раствора анти-фосфотирозиновых моноклональных IGg антител с конъюгированной пероксидазой из хрена (Sigma, USA). Количество связавшихся антител определялось по соответствующей активности пероксидазы, которая в свою очередь определялась по скорости преобразования пероксидазного субстрата (OPD, о-phenolenediamine dihydrochloride, Sigma) в окрашенный продукт. Концентрация этого продукта, образовавшегося за 30 минут реакции, определялась по оптической плотности при 490 нм, измеренной с помощью параллельного 96-луночного считывателя VICTOR2V (PerkinElmer, USA).
Для расчета процента ингибирования киназной активности каждая 96-луночная тарелка содержала следующие контрольные лунки: 1) реакционный раствор, содержащий все компоненты кроме киназы и 2) реакционный раствор вместе с киназой. Оптическая плотность измеренная в контрольных лунках (1) принималась за нулевую активность (OD0), а оптическая плотность, измеренная в контрольных лунках (2), за 100% (OD100). Оптические плотности, измеренные в присутствии тестируемых соединений (ODi), выражались в процентах от максимальной активности. Процент ингибирования киназной активности рассчитывался по следующей формуле:
Величины ингибирования ABL-киназы, полученные при испытании фокусированной библиотеки, колеблются в интервале (30-100%) и подтверждают биологическую активность соединений общей формулы 1 и 2.
Пример 4. Испытание биологической активности соединений общей формулы 1. Составили фокусированную библиотеку, включающую соединения общей формулы 1.1 и испытали ее на антиканцерную активность. Антиканцерная активность соединений определялась по их способности убивать канцерные клетки в культуре ткани. Для этой цели были выбраны три клеточные линии, представляющие три типа раковых опухолей: DLD-1 (аденокарцинома прямой кишки), DU-145 (карцинома мозга) и T-47D (опухоль молочной железы). Все клеточные культуры были получены из Американской коллекции тканевых культур (АТСС).
Оценка эффективности соединений производилась путем измерения количества мертвых клеток после их обработки изучаемыми веществами в течение 48 часов. Клетки засевались при концентрации 5*103 клеток/лунку стандартной 96-луночной платы и оставлялись на ночь для прикрепления клеток ко дну лунок. После этого к клеткам добавляли изучаемые вещества в конечной концентрации 30 μМ и платы оставляли на 48 часов в инкубаторе при 37°С, поддерживающем 5%CO2/95% воздушную среду при 100% влажности. В конце эксперимента среду с соединениями отсасывали из всех лунок и лунки дважды промывались физиологическим раствором. В каждую лунку добавляли 50 μМ раствор Alamar Blue и измеряли флуоресценцию (λех=531 нм, λem=589 нм) сразу после его добавления и спустя 2 часа. Скорость прироста флуоресценции пропорциональна числу клеток, оставшихся живыми после их инкубации с изучаемыми веществами [John O'Brien, lan Wilson, Terry Orton and Francois Pognan, Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur. J. Biochem. 2000,6 267, 5421-5426]. Процент подавления роста клеток определялся по следующему уравнению:
% Ингибирования роста=((ΔФk-ΔФi)/ΔФk)*100%,
где ΔФ означает прирост флуоресценции за два часа после добавления раствора Alamar Blue; подстрочные индексы к и i означают соответственно контрольные (выращенные без каких-либо веществ) и опытные (выращенные в присутствии испытуемых веществ) клетки. Данные для некоторых из испытанных веществ приведены в таблице 25. Из данных, приведенных в таблице 25, можно видеть, что испытанные вещества показывают хорошую активность в подавлении роста опухолевых клеток. При этом такие вещества как 1.3 (20-143), 1.3 (20-49), 1.1 (2-147) и 1.1 (12-28), одинаково хорошо подавляют рост клеток всех трех раковых опухолей, тогда как другие обладают той или иной степенью селективности по отношению к разным опухолям.
Пример 5. Способ получения фармацевтической композиции в форме таблеток. Смешивают 800 мг крахмала, 800 мг измельченной лактозы, 200 мг талька и 500 мг циклогексиламида 6-метил-4-оксо-5-(2-пирролидин-1 -ил-этил)-2-(4-этилфенил)-4,5,6,7-тетрагидропиразоло[1,5-а]пиразин-6-карбоновой кислоты 1.1 (20-143) и спресовывают в брусок. Полученный брусок измельчают в гранулы и просеивают через сита, собирая гранулы размером 14-16 меш. Полученные гранулы таблетируют в подходящую форму таблетки весом 280 мг каждая. Аналогичным образом получают фармацевтические композиции в виде таблеток, содержащие в качестве активного инградиента другие 1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-пирроло[3,4-с]хинолины общей формулы 1.
Пример 6. Способ получения фармацевтической композиции в форме капсул. Тщательно смешивают соединения 1.1 (20-49) с порошком лактозы в соотношении 2:1. Полученную порошкоообразную смесь упаковывают по 300 мг в желатиновые капсулы подходящего размера.
Пример 7. Способ получения фармацевтической композиции в форме инъекций для внутримышечных, внутрибрюшинных или подкожных инъекций. Смешивают 500 мг гидрохлорида соединения 1.1 (20-49), с 300 мг хлорбутанола, 2 мл пропиленгликоля и 100 мл инъекционной воды. Полученный раствор фильтруют и помещают по 1 мл в ампулы, которые запаивают и стерилизуют в автоклаве.
1. Анелированные карбамоилазагетероциклы общей формулы 1 или 2
или их фармацевтически приемлемые соли или гидраты, в которых
R1 представляет атом водорода или необязательно замещенный C1-С6 алкил;
R2 и R3 представляют независимо друг от друга атом водорода, инертный заместитель, необязательно замещенный C1-С6алкил, необязательно замещенный С3-C8циклоалкил, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил;
R4 представляют необязательно замещенный C1-С6алкил, необязательно замещенный С3-C8 циклоалкил, необязательно замещенный фенил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный гетероциклил;
А и В вместе с присоединенными к ним атомами углерода и азота образуют необязательно замещенный и необязательно конденсированный азагетероцикл;
D и Е вместе с присоединенными к ним атомами углерода образуют необязательно замещенный и необязательно конденсированный фенил или арил, необязательно замещенный и необязательно конденсированный азагетероцикл;
К и L вместе с присоединенными к ним атомами углерода и азота образуют необязательно замещенный азагетероцикл.
2. Соединения по п.1, представляющие собой замещенные 1-оксо-1,2,3,4,6,8а-гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-3-карбоксамиды общей формулы 1.1
или их фармацевтически приемлемые соли или гидраты, в которых
R1, R2, R3 и R4 имеют вышеуказанное значение, a R5, R6 и R7 независимо друг от друга представляют атом водорода, инертный заместитель, ацетил, или C1-С6алкоксикарбонил-С1-С4-алкил, или R5 и R6 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, или R6 и R7 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный бензольный цикл, циклоалкен или гетероцикл.
3. Соединения по п.1, представляющие собой замещенные 8-оксо-5,6,7,6-тетрагидроимидазо[1,2-а]пиразин-6-карбоксамиды общей формулы 1.2
или их фармацевтически приемлемые соли или гидраты, в которых
R1, R2, R3 и R4 имеют вышеуказанное значение, R8 и R9 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный бензольный цикл.
4. Соединения по п.1, представляющие собой замещенные 2-замещенные 4-оксо-4,5,6,7-тетрагидропиразоло[1,5-а]пиразин-6-карбоксамиды общей формулы 1.3
или их фармацевтически приемлемые соли или гидраты, в которых
R1, R2, R3, R4, R8 и R9 имеют вышеуказанное значение, или R8 и R9 вместе с атомами углерода, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный бензольный или азагетероцикл.
5. Соединения по п.1, представляющие собой замещенные 1-оксо-1,4-диазабициклоалкан-3-карбоксамиды общей формулы 1.7
или их фармацевтически приемлемые соли или гидраты, в которой
R1, R2, R3 и R4 имеют вышеуказанное значение, а R10 и R11 вместе с атомами углерода и азота, к которым они присоединены, образуют необязательно замещенный и необязательно конденсированный гидрированный азагетероцикл.
6. Соединения по п.1, представляющие собой анелированные 3-оксо-2,3-дигидро-1Н-пирроло[1,2-а]диазепин-1-карбоксамиды общей формулы 2.1
или их фармацевтически приемлемые соли или гидраты, в которых
R2, R3, R4, Е и D имеют вышеуказанное значение, а R12 и R13 независимо друг от друга представляют атом водорода, атом галогена, инертный заместитель.
7. Способ получения соединений общей формулы 1 по п.1, конденсацией трех компонентов: соответствующей 1-(2-оксоэтил)-1H-азагетероциклил)-2-карбоновой кислоты общей формулы 2, соответствующего первичного амина общей формулы 3 и соответствующего изонитрила общей формулы 4
в которых R1, R2, R3, R4, А и В имеют вышеуказанное значение.
8. Способ получения соединений общей формулы 2 по п.1, конденсацией трех компонентов: соответствующего соединения общей формулы 5, соответствующего первичного амина общей формулы 3 и соответствующего изонитрила общей формулы 4
9. Фокусированная библиотека для определения соединений-лидеров, включающая, по крайней мере, одно соединение общей формулы 1 или 2 по п.1.
10. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующим действием в отношении активности протеин-киназы, включающая, по крайней мере, одно соединение общей формулы 1 или 2 по п.1.
