Способ получения лимонной кислоты, альфа-амилазы и глюкоамилазы

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов α-амилазы и глюкоамилазы. Способ включает гидролиз крахмала и кукурузной муки в соотношении от 1:7 до 1:40 ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода не более 30, добавление органического источника азота и минеральных солей в виде сульфатов меди (II), цинка, кобальта (II) в количестве соответственно ((0,5-1,0)·10^-3, (1,5-3,5)·10^-3, (1,5-4,5)·10^-3), железа (II) в количестве (0,5-1)·10^-3 г на 1 дм³ к гидролизату крахмала и кукурузной муки и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger. Затем этот гидролизат разбавляют стерильной водой до содержания ферментируемых сахаров (120-140) г/дм³ и органический источник углерода и азота в соотношении (50-60):1 соответственно. Преимуществом изобретения является конверсия сахаров в лимонную кислоту на уровне (79,3-83,1)% и получение кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы с активностями соответственно 2.50-3.50 единиц А.С/см³ и 80.2-147.4 единиц Гл.С/см³. 1 табл.

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы, которые используются в хлебопечении, пивоварении, крахмалопаточной промышленности, медицине, т.е. во всех процессах, требующих гидролиза поли- и олигосахаридов.

Известен способ получения амилолитических ферментов культивированием гриба Aspergillus niger на различных крахмалосодержащих средах с выходом 0,64 ед/см³ α-амилазы и 15,7 ед/см³ глюкоамилазы /1/.

Таким способом можно получить только кислотоустойчивые ферменты α-амилазу и глюкоамилазу.

Известен способ получения лимонной кислоты на основе питательной среды, содержащей гидролизат крахмала и минеральные соли, включающий гидролиз крахмальной суспензии, содержащей 26-36 мас.% сухих веществ, ферментным препаратом бактериальной α-амилазы, взятом в количестве 0,5-1,5 единиц амилолитической способности на 1 г сухого вещества крахмала, при выдерживании под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 30 минут, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала со значением декстрозного эквивалента не более 30 и последующую ферментацию питательной среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger в течение 6 суток при температуре 32°С. После ферментации культуру гриба инактивируют кипячением и определяют конверсию сахаров в лимонную кислоту /2/.

Вышеуказанным способом можно получить лимонную кислоту и в небольшом количестве α-амилазу и глюкоамилазу.

Известен способ получения лимонной кислоты, включающий гидролиз крахмала препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении до достижения значения декстрозного эквивалента гидролизата крахмала не более 30, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger. В качестве минеральных солей используют соли в виде сульфатов меди (II), цинка, кобальта (II). К гидролизату крахмала дополнительно добавляют органический источник азота в количестве, обеспечивающем содержание в среде углерода и азота в соотношении (65-75):1 соответственно /3/.

Недостатком вышеуказанного способа является невысокий выход α-амилазы и глюкоамилазы.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение выхода лимонной кислоты и α-амилазы и глюкоамилазы.

Технический результат достигается за счет того, что в способе получения лимонной кислоты, включающем гидролиз крахмала ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении для достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода не более 30, добавление органического источника азота и минеральных солей в виде сульфатов меди (II), цинка, кобальта (II) в количестве соответственно (0,5-1)×10^-3, (1,5-3,5)×10^-3, (1,5-4,5)×10^-3 г/дм³ к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger, в качестве источника углерода дополнительно используют кукурузную муку в соотношении к крахмалу 1:7 до 1:40, в качестве минеральных солей дополнительно используют сульфат железа (II) в количестве (0,5-1)×10^-3 г/дм³ гидрализата крахмала и кукурузной муки, а затем этот гидролизат разбавляют стерильной водой до содержания ферментируемых сахаров (120-140) г/дм³ и органический источник азота в количестве, обеспечивающем содержание в среде углерода и азота в соотношении (50-60):1 соответственно.

В качестве исходного дополнительного сырья использовали кукурузную муку.

Совместный гидролиз кукурузной муки и крахмала сокращает стадию получения гидролизата. Кроме того, кукурузная мука является дополнительным источником азота.

Дополнительное использование в качестве минеральных солей сульфата железа (II) в количестве (0,5-1)×10^-3 г/дм³ повышает выход α-амилазы и глюкоамилазы.

Разбавление гидролизата стерильной водой до содержания ферментируемых сахаров (120-140) г/дм³ сокращает длительность ферментации, причем конверсия сахаров не снижается. При содержании ферментируемых сахаров менее 120 г/дм³ конверсия снизится, выход лимонной кислоты уменьшится, а при значении более 140 г/дм³ - увеличиваются затраты на исходное сырье.

Снижение соотношения углерода к азоту / (50-60):1 / по сравнению с прототипом способствует выходу ферментов.

Сведения, подтверждающие возможность достижения технического результата предлагаемого изобретения, представлены в примерах осуществления данного способа получения лимонной кислоты и ферментов.

Пример 1.

а). Подготовка конидий продуцента.

Конидии гриба продуцента Aspergillus niger штамм ВКПМ F-719 взвешивают в стерильную пробирку в расчете 200 мг на 100 см³, помещают в среду следующего состава, г/дм³: сахар-песок - 50,0; дигидроортофосфат калия - 0,16; нитрат аммония - 2,5; сульфат магния гептагидрат - 0,25.

Суспензию конидий гриба в колбе ставят на качалку с числом оборотов 160 мин ^-1 и выдерживают 5-6 часов при температуре 32°С.

б). Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия.

12,0 г крахмала растворяют в нагретой до 40°С водопроводной воде, доводят объем до 200 см³, получая 5,17 мас.% крахмальную суспензию (в пересчете на сухое вещество).

При интенсивном перемешивании нагревают крахмальную суспензию до 50-55°С и вводят 2 мас.%-ный раствор ферментного препарата бактериальной α-амилазы в количестве, обеспечивающем разжижение крахмала соответственно декстрозному эквиваленту (ДЕ), равному 26,0. При постоянном перемешивании доводят температуру до 80-90°С и выдерживают в течение 75 минут.

Для прекращения действия ферментного препарата гидролизат нагревают до кипения, охлаждают до 20-25°С и доводят объем до 200 см³. Затем гидролизат крахмала с ДЕ, равным 26,0, выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 минут, охлаждают до 40-50°С и стерильно вносят 0,50 см³ раствора сульфата магния гептагидрата, концентрации 10 мас.%; 5,00 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.% и 0,30 см³ раствора гидрофосфата калия концентрации 10 мас.%.

в). Приготовление питательной среды для ферментации. 140,0 г крахмала и 20 г кукурузной муки растворяют в водопроводной воде, нагретой до 40°С, доводят объем до 500 см³, получая суспензию, которую нагревают при интенсивном перемешивании до 40-50°С и вводят ферментный препарат бактериальной α-амилазы в количестве, обеспечивающем ДЕ, равный 26,0. При постоянном перемешивании доводят температуру до 80-90°С и выдерживают при этой температуре 75 минут. Для прекращения действия ферментного препарата гидролизат нагревают до кипения, охлаждают до 20-25°С и доводят объем до 500 см³. Затем гидролизат выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 минут, охлаждают до 40-50°С и стерильно вносят 25,5 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, обеспечивающем в среде соотношение углерода и азота 50:1. Затем в среду стерильно вносят 1,25 см³ раствора сульфата магния гептагидрата концентрации 10 мас.%; 0,80 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас.%; 0,50 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, что соответствует 0,0025 г соли; 0,30 см³ раствора сульфата железа (II) гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, что соответствует 0,0015 г соли железа (II); 0,20 см³ раствора сульфата меди гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, что соответствует 0,0010 г соли меди, и стерильно разбавляют водой до 1,00 дм³. Концентрация ферментируемых сахаров 135,4 г/дм³ среды.

г). Выращивание посевного мицелия.

В колбу емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и заливают 10 см³ суспензии конидий. Колбу ставят на качалку с числом оборотов 160 мин ^-1 и выдерживают в течение 36 часов при температуре 32°С.

д). Ферментация питательной среды.

В колбу емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают ее 10 см³ подрощенного мицелия. Колбу ставят на качалку с числом оборотов 160 мин ^-1 и выдерживают 5 суток при температуре 32°С. После ферментации биомассу гриба отделяют на воронке Бюхнера и в культуральном растворе определяют конверсию сахаров в лимонную кислоту и активность кислотоустойчивых амилолитических ферментов: α-амилазы - амилолитическую способность (А.С), глюкоамилазы - глюкоамилазную способность (Гл.С).

Пример 2.

а). Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1.

б). Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но используют гидролизат крахмала и кукурузной муки, приготовленный из 130,0 г крахмала и 3,25 г кукурузной муки (весовое соотношение 40:1), и с ДЕ, равным 28,5. В гидролизат крахмала и кукурузной муки вводят раствор нитрата аммония в количестве 26,4 см³ концентрации 10 мас.%, обеспечивающем соотношение углерода и азота как 55:1 и вместо раствора сульфата железа вносят 0,75 см³ раствора сульфата кобальта гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, соответствующее 0,0045 г соли кобальта; 0,10 см³ раствора сульфата меди гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, соответствующее 0,0050 г соли меди, и 0,30 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, соответствующее 0,0015 г соли цинка.

Концентрация ферментируемых сахаров - 124,8 г/дм³.

Пример 3.

а). Подготовку конидий продуцента-гриба Aspergillus niger штамма ВКПМ F-171, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1.

б). Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но используют гидролизат крахмала, приготовленный из 125,0 г крахмала без кукурузной муки, и с ДЕ, равным 27,2. В гидролизат крахмала вводят стерильную суспензию автолизата мицелия культуры Aspergillus niger концентрации 80,0 г/дм³ в количестве 65,0 см³ и раствор нитрата аммония концентрации 10 мас.% в количестве 10,0 см³, обеспечивающих в среде соотношение углерода и азота как 60:1.

Концентрация ферментируемых сахаров - 120,0 г/дм³.

Пример 4 (по прототипу).

Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171, выращивание посевного мицелия, приготовление питательной среды для ферментации и ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1, но используют крахмал в количестве 160,0 и добавляют вместо раствора сульфата железа 0,75 см³ раствор сульфата кобальта гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, соответствующее 0,0045 г соли кобальта, а гидролизат кукурузной муки готовят отдельно и вносят как органический источник азота в виде стерильного гидролизата концентрации 500,0 г/дм³ в количестве 30,1 см³, обеспечивающий в сочетании с нитратом аммония, внесенным стерильно в количестве 17,6 см³ в виде раствора концентрации 10 мас.%, соотношение углерода и азота 70:1. Концентрация ферментируемых сахаров составляет 153,6 г/дм³ среды.

Технический результат в опытах, представленных в примерах 1-3 таблицы, по сравнению с прототипом заключается в сохранении конверсии сахаров в лимонную кислоту на достаточно высоком уровне (79,3-83,1)% и в получении кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы с активностями, повышенными соответственно до 2,0-3,5 единиц А.С/см³ и 80,2-147,4 Гл.С/см³.

Источники информации

1. Тохадзе З.В., Квачадзе Л.П., Квеситадзе Г.И. Влияние состава питательной среды на биосинтез кислотоустойчивой α-амилазы различными видами Aspergillus. Прикладная биохимия и микробиология. 1974, №4, с.515-518.

2. Патент РФ №2132384, публ. 1999 г.

3. Патент РФ №2215036, публ. 2003 г.

Способ получения лимонной кислоты, α-амилазы и глюкоамилазы, включающий гидролиз крахмала ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода не более 30, добавление органического источника азота и минеральных солей в виде сульфата меди (II), цинка, кобальта (II) в количестве соответственно (0,5-1,0)·10^-3, (1,5-3,5)·10^-3, (1,5-4,5)·10^-3 г/дм³ к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger, отличающийся тем, что в качестве источника углерода дополнительно используют кукурузную муку в соотношении к крахмалу от 1:7 до 1:40, в качестве минеральных солей дополнительно используют сульфат железа (II) в количестве (0,5-1)·10^-3 г на 1 дм³ гидролизата крахмала и кукурузной муки, а затем этот гидролизат разбавляют стерильной водой до содержания ферментируемых сахаров (120-140) г/дм³ и органический источник азота в количестве, обеспечивающем содержание в среде углерода и азота в соотношении (50-60):1, соответственно.