Способ получения антигена для реакции агглютинации при колибактериозе птиц

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Проводят выращивание микробной культуры возбудителя колибактериоза на питательной среде. Затем смывают бактериальную массу изотоническим раствором хлорида натрия и инактивируют. Затем к бактериальной массе добавляют средство моющее синтетическое "Ласка магия бальзама" в количестве 1% и выдерживают полученную смесь при температуре 35 - 40°С в течение одного часа. Способ позволяет повысить чувствительность и специфичность антигена с одновременным упрощением технологических операций, связанных с его изготовлением. 4 табл.

 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к приготовлению диагностических препаратов, и может быть использовано для определения наличия группового иммунитета при вакцинации птиц против колибактериоза.

Известен способ изготовления антигена для реакции агглютинации (РА) при диагностике данного заболевания (См. Радчук Н.А. "Колибактериоз птиц" - Л., Агропромиздат. Ленинградское отделение, 1990).

Недостатком его является то, что антиген, получаемый указанным способом, вследствие недостаточного содержания микробного белка и полисахарида обладает слабой чувствительностью.

В то же время в сыворотке крови птиц содержание общего белка составляет 7,3-9,0%, а сахаров - до 80 мг%.

Такое несоответствие приводит к тому, что при исследовании сыворотки крови при колибактериозе птиц путем постановки РА читка и оценка ее даже у явно больных становится затруднительной из-за нечетко выраженной реакции, поскольку при этом образуется мелкозернистый агглютинат.

Известно, что наличие белка в антигене обуславливает иммуногенность, а полисахарид является компонентом, определяющим его специфичность.

Целью данного изобретения является разработка способа приготовления антигена, при котором повышается его чувствительность и специфичность с одновременным упрощением технологии изготовления.

Для приготовления антигена выделенную нами 20-часовую культуру E.coli (в данном случае серовар О₂, один из представителей возбудителя, имеющий преимущественное распространение в регионе) смывают стерильным изотоническим раствором хлорида натрия в сухую стерильную колбу, доводят до концентрации 4 млрд/мл, пользуясь стандартом мутности, затем бакмассу кипятят в водяной бане в течение часа.

Во время прогревания взвеси в колбе не должны образовываться хлопья, что подтверждает использование для приготовления антигена молодых микробных клеток, находящихся в S-форме. После охлаждения до температуры 35-40°С к полученному объему антигена добавляют детергент "Ласка" (средство моющее синтетическое "Ласка магия бальзама" - ТУ 2381-009-04831040-96) и выдерживают в термостате при вышеуказанной температуре в течение одного часа, периодически перемешивая.

Выбор детергента "Ласка" обусловлен тем, что он отечественного производства и содержит в своем составе анион и нейтрально-поверхностно-активные вещества, мягчитель, антиресорбент, силикат натрия, соду, сульфат натрия и т.д. Данные ингредиенты придают значительную буферную емкость приготовляемому антигену, в результате чего рН при этом остается в благоприятных условиях, способствуют лучшему и более полному извлечению белка и полисахарида из микробной клетки.

Наличие в нем антиресорбента позволяет при постановке РА поддерживать антиген в равномерно взвешенном состоянии.

Полученные данные по определению содержания белка, полисахарида, рН по прописи прототипа и предлагаемого антигена из серовара О₂ E.Coli представлены в таблице 1.

Таблица 1
Результаты определения химического состава антигенов для РА, полученных разными способами
Наименование	Общий белок %	Полисахарид (мг%)	рН(ед.)
Антиген, приготовленный по прописи прототипа	3,48	51,0	6,0
Антиген, приготовленный с добавлением 0,5% детергента "Ласка"	9,03	54,0	7,0
Антиген, приготовленный с добавлением 1% детергента "Ласка"	9,89	80,0	8,0

Из приведенных результатов видно, что добавление 1% детергента к антигену приводит к лучшему извлечению белка, полисахарида и повышению рН.

Для выяснения реакции взаимодействия между предлагаемым антигеном и агглютинирующими E.coli коли сыворотками, приготовленными в биофабричных условиях, поставили пробирочную РА в соответствии с наставлением по их применению, утвержденным Департаментом ветеринарии от 19.05.1998 г.

Серологические реакции ставились с использованием О₁, О₂ и О₇₈ агглютинирующих сывороток, из которых О₂ являлся гомологичным к данному антигену, а О₁ и О₇₈ - гетерологичными.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты проверки активности нового (предлагаемого нами) антигена для РА
Наименование сероваров E.coli	Разведения агглют. сывороток	Предельный титр, указ. на биофабр. флак.
1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:12800
О1	+++	+++	+++	+++	+++	++	++	++	+	1:6400
О2	++++	++++	++++	+++	+++	+++	+++	+++	-	1:3200
О78	++++	++++	++++	++++	+++	+++	+++	+++	+	1:6400

Интенсивность реакции учитывалась в крестах. Из вышеприведенных данных видно, что чувствительность приготовленного нами антигена на порядок выше. При взаимодействии с гомологичной агглютинирующей сывороткой он дает положительную реакцию во всех разведениях с оценкой "четыре" и "три" креста в титре вплоть до 1:6400, хотя предельный титр сыворотки, указанный на флаконе, составляет 1:3200. С гетерологичными сыворотками он также дает положительные реакции различной интенсивности - от "четырех" до "одного" креста. Последние отмечались в разведении 1:12800 при предельном титре 1:6400.

Приготовленный антиген из серовара О₂ Е.coli по прописи прототипа давал положительную РА с гомологичной сывороткой в титре 1:1600 с оценкой "один" крест и гетерологичными сыворотками - в разведении 1:400-1:800 при интенсивности в "два" и "один" креста (табл.3).

Таблица 3
Результаты проверки антигена для РА по прописи прототипа
Наименование сероваров Е.coli	Разведения агглютинирующих сывороток	Предельн. титр, указ. на био-фабр. флак.
1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400	1:12800
О1	+++	++	++	++	+	-	-	-	-	1:6400
О2	+++	+++	+++	+++	++	+	-	-	-	1:3200
О78	+++	+++	+++	++	-	-	-	-	-	1:6400

Специфичность предлагаемого нами антигена (№1), приготовленного из серовара О₂ Е.coli, проверена путем исследования сывороток крови, взятых от здорового поголовья цыплят-бройлеров и от больных колибактериозом, в сравнении с антигеном (№2),описанным в прототипе (табл.4).

Таблица 4
Результаты проверки специфичности антигенов
Возраст птицепоголовья в днях	Кол-во проб	Антиген	Реагировало в РА	Всего положит.
1:50	1:100	1:200	1:400
37 (больные)	10	№1	++++	++++	++++	+++	10
№2	++	++	-	-	2
37 (здоровые)	5	№1	-	-	-	-	-
№2	-	-	-	-	-

Кроме того, для уточнения специфичности предлагаемого и описанного в прототипе антигенов в РА на стекле использовалась и О-комплексная агглютинирующая сальмонеллезная сыворотка с рецепторами 4, 7, 8, 9, 10, 15, 19, выпускаемая Краснодарской биофабрикой.

В данном случае оба антигена с указанной сывороткой при смешивании на стекле образовывали гомогенную взвесь, т.е. давали отрицательные реакции.

Способ получения антигена для реакции агглютинации при колибактериозе птиц, включающий выращивание микробной культуры возбудителя колибактериоза, смыв бактериальной массы изотоническим раствором хлорида натрия и инактивацию, отличающийся тем, что после инактивации к бактериальной массе добавляют средство моющее синтетическое "Ласка магия бальзама" в количестве 1% и выдерживают полученную смесь при температуре +35 - +40°С в течение одного часа.