Сухой пробиотический препарат и способ его получения
Владельцы патента RU 2268926:
Вирусологический центр НИИ Микробиологии Министерства обороны Российской Федерации (RU)
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению препаратов для профилактики и лечения дисбактериозов человека и сельскохозяйственных животных. Способ предусматривает получение жидкой биомассы путем смешения нативной культуры лактобактерий штамм Lactobacillus plantarum 8P-A3, выращенной в условиях глубинного культивирования, с белково-углеводным комплексом в размельчителе тканей РТ 1. Контактное обезвоживание полученной жидкой биомассы лактобактерий проводят влагоемкой ионообменной смолой КБ-4П-2 с размером частиц от 1 до 800 мкм, предварительно обработанной смесью лактозы безводной и аэросила гидрофобного. Изобретение позволяет повысить стабильность лактобактерий в составе сухого пробиотического препарата при его приготовлении, хранении, использовании и сократить затраты времени на проведение процесса обезвоживания биомассы лактобактерий. 2 н.п. ф-лы, 6 табл.
Изобретение относится к области медицины, ветеринарии, биотехнологии, в частности к получению препаратов для профилактики и лечения дисбактериозов человека и сельскохозяйственных животных, вызванных нарушением баланса кишечной флоры различной этиологии.
Известен способ получения сухого пробиотического препарата путем смешения микробной суспензии с мукой злаковых растений в соотношении 1:(1,8-2,0) с последующим обезвоживанием целевого продукта цеолитом, охлажденным до минус (10±2)°С, с остаточной влажностью менее 1% при массовом соотношении 1:(4-6) соответственно, а досушивание проводят при температуре от 0 до 4°С в течение от 18 до 24 часов (патент (19) RU (11) 2032736 (13) C1 (51) 6 С 12 №1/00).
Известен способ получения сухого пробиотического препарата, сущность которого заключается в смешении культуры бифидобактерий и стрептококка с защитной средой. Полученную смесь обезвоживают охлажденным до минус (9±1)°С сорбентом, например, окисью алюминия с остаточной влажностью менее 1% при массовом соотношении смеси и обезвоживателя от 1:10 до 1:12. Далее осуществляют досушивание в течение от 18 до 20 часов при температуре от 0 до 5°С в замкнутом объеме (патент (19) RU (11) 2067114 (13) С1, (24) 27.09.96) (прототип).
Оба способа имеют следующие недостатки:
- предварительное обезвоживание пробиотических суспензий осуществляют сорбентом, охлажденным до температуры минус (10±2)°С, что может приводить к инактивации лактобактерий, обусловленной фазовыми переходами обезвоживаемой биомассы при продолжительном контакте с сорбентом;
- использование в качестве сорбента неорганического соединения в значительных количествах (у прототипа до 90% по массе),
Техническим результатом данного изобретения является сокращение затрат времени (примерно в 40 раз по сравнению с прототипом) на проведение процесса обезвоживания биомассы лактобактерий (штамм Lb. plantarum) при получении сухого пробиотического препарата лактобактерина, а также повышение стабильности лактобактерий в составе препарата на этапах его приготовления, хранения и использования по назначению.
Указанный результат достигается за счет использования для обезвоживания биомассы лактобактерий влагоемкого органического сорбента, например ионообменной смолы КБ-4П-2 и оптимизации компонентного состава сухого препарата лактобактерина за счет использования ниже представленных компонентов в следующем соотношении (% по массе):
| - культура лактобактерий (штамм Lb. plantarum), выращенная в условиях глубинного культивирования | от 12,0 до 13,0 |
| - сахароза | от 6,0 до 5,0 |
| - пептон ферментативный | от 3,0 до 4,0 |
| - смола КБ-4П-2 (сорбент) | от 62,3 до 65,0 |
| - аэросил гидрофобный | от 0,7 до 1,0 |
| - лактоза безводная | от 16,0 до 12,0 |
Сущность изобретения заключается в том, что сухой препарат лактобактерина получают контактным обезвоживанием биомассы лактобактерий (штамм Lb. plantarum), содержащей стабилизирующие добавки (сахароза и пептон ферментативный), влагоемкой ионообменной смолой КБ-4П-2 с остаточной влажностью менее 1% и размером частиц от 1 до 800 мкм, предварительно обработанной гидрофобным аэросилом (дезагрегант-диспергатор) и безводной лактозой (посредник обезвоживания). Способ включает следующие стадии: приготовление биомассы лактобактерий (штамм Lb. plantarum); приготовление смеси ионообменной смолы КБ-4П-2 с безводной лактозой и гидрофобным аэросилом марки AM-1-300; обезвоживание биомассы смесью смолы КБ-4П-2 с лактозой безводной и гидрофобным аэросилом. Нативную биомассу микроорганизмов получают в условиях глубинного культивирования лактобактерий штамма Lb. plantarum. Получение жидкой биомассы и приготовление сухого препарата лактобактерий осуществляют в смесителях, обеспечивающих равномерность смешения компонентов с коэффициентом неоднородности не более 15%.
Продолжительность обезвоживания биомассы лактобактерий при использовании органического сорбента влагоемкой ионообменной смолы КБ-4П-2 составляет 30 минут, что примерно в 40 раз меньше, чем у прототипа (от 18 до 36 часов). Высокая скорость обезвоживания биомассы в сочетании с использованием стабилизирующего углеводно-белкового комплекса, посредника обезвоживания (безводной лактозы) и дезагреганта (аэросила марки AM-1-300) обеспечивают повышенную стабильность лактобактерий в составе сухого пробиотического препарата не только при его приготовлении, но и при хранении и пероральном применении.
Предлагаемое техническое решение является новым, поскольку из общедоступных сведений не известен способ получения сухого пробиотического препарата, основанный на контактном обезвоживании биомассы лактобактерий (штамм Lb. plantarum) влагоемким органическим сорбентом ионообменной смолой КБ-4П-2, обработанной безводной лактозой (посредник обезвоживания) и гидрофобным аэросилом марки AM-1-300 (дезагрегант), позволяющий сократить время обезвоживания в 40 раз и повысить стабильность лактобактерий в составе сухого препарата при следующем соотношении используемых компонентов (% по массе):
| - культура лактобактерий (штамм Lb. plantarum), выращенная в условиях глубинного культивирования | от 12,0 до 13,0 |
| - сахароза | от 6,0 до 5,0 |
| - пептон ферментативный | от 3,0 до 4,0 |
| - смола КБ-4П-2 (сорбент) | от 62,3 до 65,0 |
| - аэросил гидрофобный | от 0,7 до 1,0 |
| - лактоза безводная | от 16,0 до 12,0 |
Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку предлагаемый способ получения сухого пробиотического препарата и его компонентный состав позволяют при высокой скорости обезвоживания биомассы микроорганизмов (в 40 раз выше, чем у прототипа) обеспечивать высокую стабильность лактобактерий в составе сухого препарата как при его приготовлении, так при хранении и использовании по назначению.
Предлагаемое техническое решение промышленно применимо, поскольку для его реализации могут быть использовано типовое биотехнологическое оборудование, а также широко распространенные в биотехнологической промышленности вещества и материалы.
Предлагаемый способ позволяет в короткие сроки развернуть промышленный выпуск сухого пробиотического препарата.
Пример выполнения
Перед приготовлением сухого препарата лактобактерина стабилизаторы (сахарозу, пептон ферментативный) подвергают тепловой обработке при температуре (90±2)°С в течение 4 часов. Одновременно ионообменную смолу КБ-4П-2, аэросил гидрофобный и лактозу безводную выдерживают при температуре (104±2)°С в течение 4 часов. После этого все компоненты и смесители охлаждают до температуры (6±2)°С.
Жидкую биомассу получают путем смешения-растворения углеводно-белкового комплекса, например 12 г сахарозы и 6 г пептона ферментативного, с 26 см3 нативной культуры лактобактерий (штамм Lb. plantarum), выращенных в условиях глубинного культивирования, в размельчителе тканей РТ 1 при скорости вращения ножей 8000 об·мин-1 в течение 1,5 минуты.
160,0 г ионообменной смолы КБ-4П-2 с остаточной влажностью менее 1% и размером частиц от 1 до 800 мкм смешивают с 30,0 г безводной лактозы и 1,4 г гидрофобного аэросила в течение 3 минут в смесителях типа ЛШСИ, обеспечивающих равномерность смешения компонентов готового продукта с коэффициентом неоднородности не более 15%.
В смеситель типа ЛШСИ, содержащий смесь смолы КБ-4П-2 с лактозой безводной и гидрофобным аэросилом, с помощью дозатора прибавляют 36 см3 жидкой биомассы при работающем перемешивающем устройстве. Перемешивание осуществляют в течение 10 минут.
По вышеизложенному способу готовят два состава сухого пробиотического препарата лактобактерина с содержанием компонентов, представленным в таблице 1.
| Таблица 1 Компонентный состав сухого препарата лактобактерина штамма Lb. plantarum | ||
| Компоненты | Содержание компонентов, процент по массе | |
| Состав №1 | Состав №2 | |
| Культура лактобактерий (штамм Lb. plantarum), выращенная в условиях глубинного культивирования | 12,0 | 13,0 |
| Сахароза | 6,0 | 5,0 |
| Пептон ферментативной | 3,0 | 4,0 |
| Смола КБ-4П-2 | 62,3 | 65,0 |
| Аэросил гидрофобный | 0,7 | 1,0 |
| Лактоза безводная | 16,0 | 12,0 |
Сухой препарат лактобактерина двух составов представляет собой сыпучий порошкообразный материал серого цвета. Сухой препарат лактобактерина расфасовывают во флаконы вместимостью 100, 200, 500 см3 или в двойные полиэтиленовые пакеты. Флаконы, наполненные порошком лактобактерина, укупоривают резиновыми пробками и обкатывают металлическими колпачками.
Перечень веществ и материалов, используемых для приготовления и изучения сухого пробиотического препарата лактобактерина, представлен в таблице 2.
| Таблица 2 Перечень веществ и материалов, используемых для приготовления и изучения сухого пробиотического препарата лактобактерина | |||
| Наименование вещества (материала) | Предназначение | НТД на вещество (материал) | Дополнительные требования |
| Суспензии, содержащие лактобактерии штамма «Lb. plantarum 8P-A3» | Получение жидкой биомассы лактобактерий с углеводно-белковым комплексом | - | - |
| Смола ионообменная КБ-4П-2 (Na - форма) | Сорбент (обезвоживатель) | ГОСТ 20298-74 | Остаточная влажность менее 1%, размер частиц от 1 до 800 мкм |
| Лактоза | Посредник обезвоживания | ТУ 6-09-2293-79 | Безводная |
| Аэросил | Дезагрегант-диспергатор | ГОСТ 14922-77 | Гидрофобный, марка AM-1-3 00 |
| Пептон сухой ферментативный | Стабилизатор (компонент углеводно-белкового комплекса) | ГОСТ 13805-76 | - |
| Сахароза | Стабилизатор (компонент углеводно-белкового комплекса) | ГОСТ 5833-75 | - |
| Агаризованная среда МСР-4 | Среда для определения концентрации живых лактобактерий в сухом препарате (биологической активности) | - | Стерильная |
| Натрий хлористый, раствор водный 0,9% изотонический | Раствор для приготовления разведений сухого препарата лактобактерий | ГОСТ 4233-75 | Стерильный |
Изучение устойчивости лактобактерий (штамм Lb. plantarum) в составе сухих пробиотических препаратов проводили путем определения величины биологической активности, выраженной в содержании живых микробных тел на один грамм сухого препарата, который вызывает 50%-й антагонистический эффект при его использовании (ЖМТ50·г-1).
Результаты изучения устойчивости лактобактерий (штамм Lb. plantarum) в составе сухих пробиотических препаратов различного состава, приготовленных по вышеизложенному способу, при их хранении в различных условиях представлены в таблице 3.
| Таблица 3 Изучение устойчивости лактобактерий (штамм Lb. plantarum) при приготовлении и хранении сухого препарата лактобактерина в зависимости от состава препарата, температуры и продолжительности его хранения | ||||||
| Состав лактобактерина, № | Биологическая активность составов, ЖМТ50*г-1 | |||||
| Исходная суспензия | Готовый препарат лактобактерина | Продолжительность хранения (мес.) при температуре, °С | ||||
| 3 | 8 | |||||
| Минус (10±2) | От 2 до 6 | Минус (10+2) | От 2 до 6 | |||
| 1 | 30,0·109 | 4,0·109 | 3,0·109 | 2,0·109 | 3,2·109 | 1,0·109 |
| 2 | 20,0·109 | 3,0·109 | 2,5·109 | 1,8·109 | 2,0·109 | 8,5·109 |
Анализ данных, представленных в таблице 3, свидетельствует о высокой устойчивости лактобактерий (штамм Lb. plantarum) как при приготовлении, так и хранении сухого препарата, и не зависит от его состава. Снижение биологической активности в готовом препарате по сравнению с биологической активностью исходных суспензий связано с разбавлением этих суспензий сорбентом, посредником обезвоживания, стабилизаторами и дезагрегантом примерно в 9 раз.
Количество живых микробных клеток в суспензиях и сухих препаратах определяют методом высева лактобактерина, взвешенного в изотоническом растворе натрия хлористого, на агаризованную среду МСР-4 и последующего подсчета колоний.
Результаты изучения устойчивости лактобактерий штаммов медицинского и ветеринарного предназначения в составе сухих препаратов лактобактерина в процессе их приготовления по вышеизложенному способу и хранения при различных условиях представлены в таблице 4.
| Таблица 4 Биологическая устойчивость лактобактерий медицинского и ветеринарного предназначения при приготовлении и хранении сухого препарата лактобактерина | ||||||
| Биологический субстрат, суспензия | Биологическая активность составов, ЖМТ50*г-1 | |||||
| Исходная суспензия | Готовый препарат лактобактерина | Продолжительность хранения (мес.) при температуре, °С | ||||
| 3 | 8 | |||||
| Минус (10±2) | От 2 до 6 | Минус (10±2) | От 2 до 6 | |||
| Нативная ветеринарная | 20,0·109 | 4,0·109 | 3,5·109 | 2,0·109 | 2,0·109 | 8,0·108 |
| Концентрат ветеринарной суспензии | 20,0·109 | 20,6·109 | 12,0·109 | 6,0·109 | 10,0·109 | 5,0·109 |
| Нативная медицинская | 30,0·109 | 5,0·109 | 3,8·109 | 2,5·109 | 2,0·109 | 5,0·108 |
| Концентрат медицинской суспензии | 18,0·109 | 15,0·109 | 10,0·109 | 5,4·109 | 3,0·109 | 6,0·108 |
Представленные в таблице 4 данные свидетельствуют о достаточно высокой стабильности лактобактерий при хранении сухих препаратов лактобактерий при температуре минус (10±2)°С независимо от используемого биологического субстрата.
При хранении сухих препаратов в условиях положительной температуры наблюдается значительное различие в устойчивости лактобактерий в зависимости от биологического субстрата, используемого для приготовления готовой формы. Так, биологическая активность сухого препарата лактобактерина, приготовленного из ветеринарной нативной суспензии, за 8 месяцев хранения снизилась в 5 раз, в то время как биологическая активность сухого препарата лактобактерина, приготовленного на концентрате этой суспензии, снизилась в 40 раз. Примерно такая же зависимость наблюдается при хранении препарата лактобактерина, полученного на медицинских суспензиях. Биологическая активность сухого препарата, полученного на нативной суспензии, снизилась в 10 раз, а на основе концентрата в 25 раз. Это свидетельствует о том, что технологические операции концентрирования приводят к конформационным изменениям структуры лактобактерий, которые проявляются при хранении препаратов лактобактерина в условиях положительных температур. В связи с этим при приготовлении сухого препарата лактобактерина контактным обезвоживанием в качестве биологического субстрата целесообразно использовать нативные суспензии лактобактерий.
Для испытаний на животных использовали сухой препарат лактобактерина на основе нативных ветеринарных суспензий лактобактерий (серии №№10, 11), приготовленный по вышеизложенному способу. Биологические и физико-химические характеристики сухого препарата представлены в таблице 5.
| Таблица 5 Исходные характеристики сухих препаратов лактобактерина, используемых в исследованиях на животных | ||||
| № партии | Биологическая активность, ЖМТ50*г-1 | Остаточная влажность, процент по массе | Насыпная плотность, г* см-3 | Утрясочная плотность, г* см-3 |
| 10 | 5,0·109 | 8,3 | 0,78 | 0,85 |
| 11 | 5,3·109 | 9,0 | 0,79 | 0,88 |
Биологическая активность полученных партий сухого препарата лактобактерина примерно такая же, как и у сухих препаратов лактобактерина, получаемых способом сублимационного высушивания.
Лечение больных животных, страдающих желудочно-кишечными заболеваниями, а также профилактику здоровых животных проводили сухим препаратом лактобактерина ветеринарного штамма (партий №№10, 11) на базе питомника Вирусологического центра НИИ микробиологии МО РФ. Результаты лечения и профилактики животных приведены в таблице 6.
| Таблица 6 Результаты лечения и профилактики животных сухим препаратом лактобактерина | |||||||
| Животные | Количество животных, шт. | Разовая доза препарата, г/ кратность, сутки | Продолжительность, сутки | Эффективность лечения больных, % выздоровевших | Эффективность профилактики здоровых, % заболевших | ||
| Больные (диагноз) | Здоровые | лечения | до полного выздоровления | ||||
| Песцы (щенки) 6-ти мес. возраста | 5 (энтерит) | 0 | 3,0/1 | 30 | 30 | 100 | 0 |
| Собаки (2-3) лет. возраста | 10 (энтерит) | 20 | 5,0/2 | 10 | От 5 до 10 | 100 | 0 |
| Обезьяны (зеленые мартышки) | 12 (энтероколит) | 38 | 3,0/2 | 14 | 14 | 100 | 0 |
| Обезьяны (павианы, гамадрилы) | 5 (энтерит) | 46 | 3,0/2 | 14 | 14 | 100 | 0 |
| Мыши белые (маточное поголовье) | 400 (диарея) | 1600 | 0,025/1 | 10 | 10 | 95 | 0 |
Представленные в таблице 6 данные свидетельствуют о том, что скармливание вместе с кормом лактобактерина в дозах, указанных в таблице 6, щенкам песцов, служебным собакам, обезьянам "зеленым мартышкам", обезьянам "гамадрилам", беспородным белым мышам, страдающим кишечными заболеваниями, приводит к выздоровлению больных животных. Скармливание вместе с кормом лактобактерина (этих же партий) с профилактической целью здоровым животным не приводит к отклонениям в состоянии здоровья этих животных за весь период наблюдения. При этом не зарегистрированы случаи заболевания здоровых животных при совместном содержании их с больными.
Сухой препарат лактобактерина, приготовленный контактным обезвоживанием, обеспечивает высокую устойчивость лактобактерий как при получении сухого препарата, так и в процессе его хранения в течение 12 месяцев при температуре минус (20±2)°С и в течение 8 месяцев при температуре (4±2)°С.
Технико-экономическая эффективность предложенного способа заключается в упрощении технологии приготовления сухого пробиотического препарата, в частности в сокращении временных затрат (примерно в 40 раз) на проведение процесса обезвоживания биомассы, а также в повышении стабильности лактобактерий в его составе на этапах приготовления, хранения и использования за счет использования для контактного обезвоживания биомассы лактобактерий влагоемкого органического сорбента ионообменной смолы КБ-4П-2, предварительно обработанной гидрофобным аэросилом и безводной лактозой, и оптимизации компонентного состава сухого препарата лактобактерина.
1. Сухой пробиотический препарат, содержащий обезвоженную культуру лактобактерий штамм Lactobacillus plantarum 8P-A3, углеводно-белковый комплекс, ионообменную смолу КБ-4П-2, аэросил гидрофобный, отличающийся тем, что он дополнительно содержит лактозу безводную, в качестве углеводно-белкового комплекса - сахарозу и пептон ферментативный, ионообменную смолу КБ-4П-2 с размером частиц от 1 до 800 мкм, обезвоженную культуру лактобактерий штамм Lactobacillus plantarum 8P-A3, выращенную в условиях глубинного культивирования с биологической активностью (3,5±1,5)·109 ЖМТ50·г-1, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Обезвоженная культура лактобактерий | |
| штамм Lactobacillus plantarum 8P-A3, | |
| выращенная в условиях глубинного | |
| культивирования с биологической активностью | |
| (3,5±1,5)·109 ЖМТ50·г-1 | 12,0 - 13,0 |
| Сахароза | 0,5 - 6,0 |
| Пептон ферментативный | 3,0 - 4,0 |
| Смола КБ-4П-2 с размером | |
| частиц от 1 до 800 мкм | 62,3 - 65,0 |
| Аэросил гидрофобный | 0,7 - 1,0 |
| Лактоза безводная | 12,0 - 16,0 |
2. Способ получения сухого пробиотического препарата, включающий получение жидкой биомассы путем смешения нативной культуры лактобактерий штамм Lactobacillus plantarum 8P-A3, выращенной в условиях глубинного культивирования с биологической активностью (3,5±1,5)·109 ЖМТ50·г-1, с углеводно-белковым комплексом, содержащим сахарозу и пептон ферментативный, в размельчителе тканей РТ 1 при скорости вращения ножей 8000 об/мин-1 в течение 1,5 мин, контактное обезвоживание полученной жидкой биомассы лактобактерий влагоемкой ионообменной смолой КБ-4П-2 с размером частиц от 1 до 800 мкм и остаточной влажностью менее 1%, предварительно обработанной смесью лактозы безводной и аэросила гидрофобного, в шаровых смесителях типа ЛСШИ, обеспечивающих равномерность смешения компонентов с коэффициентом неоднородности не более 15%.
