Способ экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа (варианты)

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает использование уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща. Способ также включает (по второму варианту) дополнительно фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан, для удаления осадка из указанного раствора, центрифугирование раствора, полученного указанной фильтрацией, добавление этанола, насыщенного хлоридом натрия, к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием, а затем центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен насыщенный хлоридом натрия этанол для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок. По третьему варианту способ включает дополнительно растворение указанного осадка уксусной кислотой и диализ. Способ прост, экологически безопасен, а протеогликан, полученный указанным способом, может применяться перорально. 3 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.

 

Предпосылки создания изобретения

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому способу экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа.

Описание уровня техники

Одна молекула протеогликана хрящевого типа, известного как конъюгированный углевод, характеризуется тем, что она имеет структуру, показанную на фиг.1, и представляет собой биополимер, имеющий нижеописанные структурные особенности. То есть от нескольких до десяти гликозаминогликановых цепей (далее сокращенно обозначаемых GAG), молекулярная масса каждой из которых составляет от нескольких десятков тысяч до нескольких сотен тысяч, связаны с одной каркасной молекулой белка, имеющей молекулярную массу от нескольких десятков тысяч до нескольких сотен тысяч, и которую называют коровым белком. По своей основной структуре GAG может быть отнесен к нескольким видам, таким как сульфат хондроитина или сульфат дерматана, а в основном, он представляет собой длинноцепочечный гетерокислотный полисахарид, состоящий из повторяющихся структур дисахарида с аминосахаром и уроновой кислотой. В указанной структуре GAG, за исключением гуалуроновой, кислоты связаны с коровым белком и образуют протеогликан.

Обычно протеогликан присутствует почти во всех организмах животных как один из важных компонентов внутриклеточного матрикса, который заполняет пространство между клетками (см. фиг.2) и в котором также присутствуют коллаген и гуалуроновая кислота. И он не только составляет важную часть структуры организма, но также образует физическую среду, окружающую клетки, и регулирует различные клеточные активности, такие как связывание, размножение или дифференцировка. Каждый компонент внеклеточного матрикса или GAG, взятый отдельно, имеет определенные функции, такие как удерживание и доставка воды, противоядия или анальгетика. Если эти компоненты связываются друг с другом и образуют макромолекулярную структуру, где каждый компонент действует в соответствии с другим компонентном, то наблюдается более значительный эффект.

Протеогликан хрящевого типа, который является объектом настоящего изобретения, имеет очень большую молекулярную массу по сравнению с коллагеном, гиалуроновой кислотой или GAG и имеет более сложную структуру. Поэтому даже если протеогликан взят отдельно, он обладает лучшей способностью удерживать и поставлять воду, чем другие компоненты во внеклеточном матриксе, и, кроме того, может обладать и другими функциями в зависимости от организации биологического информационного сигнала его GAG-части.

Между тем, в современном методе экстракции и очистки протеогликана в качестве исходного материала используется хрящ коров или китов, и экстракцию и очистку проводят с помощью сложной процедуры с использованием токсичных или вредных агентов, таких как хлороформ, метанол или гидрохлорид гуанидина. И этот способ не имеет промышленного применения. Протеогликаны некоторых типов продаются как реагенты в очень небольших количествах, и их цена составляет приблизительно десятки миллионов иен за один грамм.

Заявителями настоящего изобретения ранее уже был изобретен новый крупномасштабный упрощенный метод экстракции и очистки протеогликана, который может быть использован в промышленности с использованием носового хряща лосося, и была подана патентная заявка (заявка на патент Японии 11-331375, поданная 22 ноября 1999). Этот метод включает, в частности, процесс измельчения носового хряща лосося, процесс обезжиривания, процесс экстракции растворителем и процесс диализа. Благодаря этому методу, может быть осуществлен способ экстракции и очистки, отличающийся тем, что он является крупномасштабным и недорогостоящим, однако в нем используется не только хлороформ, метанол или гидрохлорид гуанидина, но также и вредный агент, такой как агент, препятствующий разложению ферментного белка, а поэтому возможность его использования в медицине в качестве материала для введения в организм человека или в качестве диетической и пищевой добавки связана с определенными трудностями, и такое применение ограничено нелекарственными химическими средствами или косметическими средствами. Кроме того, поскольку рыночная цена вышеупомянутых химических агентов является относительно высокой, то снижение затрат на экстракцию и очистку ограничено.

При этом поскольку авторами настоящей заявки был предложен указанный недорогостоящий протеогликан, то возникает все большее стремление изготовить протеогликансодержащие продукты, которые могли бы быть использованы не только в косметической промышленности, но также и в пищевой промышленности, в промышленности по изготовлению диетических продуктов или пищевых добавок и в медицине. Однако для основательного применения протеогликана в промышленности по изготовлению пищевых продуктов, в промышленности по изготовлению диетических или пищевых добавок или в медицине особое внимание необходимо уделить методу очистки протеогликана. В стандартном методе экстракции и очистки протеогликана обычно используется гидрохлоридная соль гуанидина. Однако для нового применения протеогликана крайне необходимо избегать использования указанного гидрохлорида гуанидина, а также токсичных или вредных агентов, таких как хлороформ, метанол или агент, препятствующий разложению белкового фермента. Кроме того, разработка более простого и менее дорогостоящего метода экстракции и очистки протеогликана остается крайне актуальной.

Авторами настоящего изобретения было проведено интенсивное исследование по разработке способа экстракции и очистки протеогликана, осуществление которого не требует использования токсических или вредных агентов и который, кроме того, отличается тем, что он является более простым и недорогостоящим, и на основании этого исследования было разработано настоящее изобретение. Поэтому целью настоящего изобретения является разработка более простого и менее дорогостоящего способа экстракции и очистки протеогликана хрящевого типа.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу экстракции неочищенного протеогликана, отличающемуся тем, что в качестве элюирующего растворителя для хряща используется уксусная кислота. Настоящее изобретение также относится к способу очистки неочищенного протеогликана, включающему экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща; фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан для удаления осадка из указанного раствора; центрифугирование раствора, полученного такой фильтрацией; добавление насыщенного хлоридом натрия этанола к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием; а затем центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен указанный насыщенный хлоридом натрия этанол, для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок. Настоящее изобретение, кроме того, относится к улучшенному способу очистки неочищенного протеогликана, включающему экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща; фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан для удаления осадка из указанного раствора; центрифугирование раствора, полученного такой фильтрацией; добавление насыщенного хлоридом натрия этанола к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием; центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен указанный насыщенный хлоридом натрия этанол, для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок; растворение указанного осадка, содержащего неочищенный протеогликан, с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для указанного неочищенного протеогликана; а затем, диализ.

Таким образом, важным аспектом настоящего изобретения является использование уксусной кислоты, хлорида натрия и немодифицированного этанола во всех способах экстракции и очистки протеогликана вместо токсичных или вредных агентов, таких как хлороформ, метанол или агент, препятствующий разложению ферментного белка. Эти вышеупомянутые агенты, такие как уксусная кислота, хлорид натрия и немодифицированный этанол, являются агентами, используемыми в пищевых продуктах, подвергающихся обработке. Для осуществления более простого способа экстракции и очистки можно исключить стадию замещения мочевиной и стадию разделения и очистки методом с использованием DEAE-Sephacel, которые были использованы в способе, описанном в вышеупомянутой патентной заявке (JPA 11-331375).

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена структурная модель протеогликана, на фиг.2 схематически представлен внеклеточный матрикс, а на фиг.3 представлен график, иллюстрирующий изменение в процессе элюирования неочищенного протеогликана от времени.

Цифры, указанные на чертежах, обозначают: 1: коровый белок, 2: гликозаминогликановая цепь, 3: гиалуроновая кислота, 4: коллаген, 5: протеогликан.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществлениянастоящего изобретения

Настоящее изобретение далее более подробно проиллюстрировано следующим описанием.

В качестве исходного материала протеогликана настоящего изобретения может быть использован хрящ коровы или кита, однако с точки зрения доступности и цены, желательно использовать носовой хрящ лосося. Особенно желательно использовать части головы кижуча, являющиеся отходами процесса производства пищевых продуктов, например, рыбоконсервной промышленности, в которой используется кижуч, вылавливаемый рыбаками у берегов, принадлежащих префектуре Аомори в Японии.

Уксусной кислотой, используемой в настоящем изобретении, может быть уксусная кислота любого типа, например, уксусная кислота, применяемая для приготовления пищи или в промышленности, и она может быть выбрана по усмотрению специалиста в зависимости от целей использования протеогликана. В соответствии с упомянутыми ниже результатами тестов, желаемая концентрация уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя составляет примерно 4%, однако эта концентрация не ограничивается указанным значением.

Пример

В качестве исходного материала используют части головы кижуча, являющиеся отходами процесса обработки пищевых продуктов в рыбоконсервной промышленности, где используется кижуч, вылавливаемый рыбаками у берегов, принадлежащих префектуре Аомори в Японии, и указанные части головы помещают на временное хранение при температуре -30°С.

Вышеупомянутый материал размораживают при 4°С в течение 20 часов и от головной части кухонным ножом отрезают носовую часть хряща и получают исходный материал. У носового хряща лосося щипчиками удаляют твердый жир и промывают физиологическим солевым раствором. Затем этот хрящ мелко измельчают вручную на мясорубке и получают фарш из носового хряща лосося.

Порцию указанного фарша вымачивают при 4°С в уксусе, применяемом в пивоваренной промышленности и разбавленном до 10 масс./об. (используемом путем разведения до концентрации 4%, которая аналогична концентрации уксусной кислоты в уксусе, далее сокращенно называемом 4% уксусно-кислотным растворителем), в течение 0, 6, 12, 24, 48, 72, 120 и 168 часов, а затем перемешивают. Изменение состояния элюирования неочищенного протеогликана наблюдают в зависимости от времени по количеству уроновой кислоты, которое определяют методом с использованием смеси карбазола и серной кислоты. Полученные результаты показаны на фиг.3. Как ясно видно из фиг.3, количество элюированного протеогликана заметно возрастает в течение первых 24 часов, а по прошествии 24 часов увеличение элюированного количества становится незначительным. Исходя из полученных результатов очевидно, что наиболее эффективное время элюирования неочищенного протеогликана 4%-ной уксусной кислотой в качестве растворителя составляет 48 часов.

Исходя из вышеупомянутых результатов, 50 г фарша из носового хряща лосося вымачивают в 4% уксусно-кислотном растворителе при 4°С в течение 48 часов, перемешивают для элюирования носового хряща и получают неочищенный протеогликан (п.1 формулы изобретения).

Затем элюированный раствор фильтруют через сито из нержавеющей стали (150 мкм) для удаления неэлюированного вещества. После этого, раствор, содержащий неочищенный протеогликан, разделяют центрифугированием (4°С, 1000 об./мин, в течение 20 минут). К полученной надосадочной жидкости добавляют трехкратное количество этанола, насыщенного хлоридом натрия, и снова разделяют на центрифуге (4°С, 1000 об./мин, в течение 20 минут), а затем получают концентрированный осадок, содержащий неочищенный протеогликан (п.2 настоящего изобретения).

Полученный осадок, содержащий неочищенный протеогликан, снова растворяют в 4% уксусно-кислотном растворителе, а затем раствор достаточно диализуют против воды в трубке для мембранного диализа из сложного эфира целлюлозы с отсечкой молекулярной массы 1000 кДа, и получают жидкий протеогликан с высокой степенью очистки (п.3 формулы настоящего изобретения).

Полученный жидкий протеогликан желательно сушить вымораживанием и хранить в порошкообразной форме. В этом примере диализованный внутренний раствор подвергают сушке вымораживанием и получают 240 мг образца порошкообразного протеогликана.

Химические свойства образца протеогликана, полученного, как указано в п.3 формулы изобретения, определяют методом, описанным ниже.

Результаты химических анализов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Химические анализы образца протеогликана, выделенного из носового хряща лосося
Молярное отношение	Белок (% масс.)
Гексозамин	Уроновая кислота	Сульфат
1,00	0,99a	0,67a	6,99
a указывает на молярное отношение, если количество гексозамина принято равным 1,00.

В таблице 1 количества уроновой кислоты и сульфата показаны в виде молярного соотношения, если количество гексозамина принято равным 1,00, и составляют соответственно 0,99 и 0,67. Понятно, что эти три компонента присутствуют почти в равных количествах. Кроме того, количество корового белка составляет 6,99% (масс./масс.), а его отношение к количеству уроновой кислоты (коровый белок/уроновая кислота) составляет 0,23 (масс./масс.). Это численное значение показывает один из показателей для определения чистоты протеогликана и близок к значению 0,2, которое является теоретическим.

Был проанализирован тип аминокислот, составляющих белок в данном образце, и результаты этого анализа показали, что количество глицина, серина и глутаминовой кислоты являются значительно более высокими. А именно, во всех 1000 аминокислотных остатках общее число остатков глицина, серина и глутаминовой кислоты составляет 386, а число гидроксипролиновых остатков равно 2. Гидроксипролин представляет собой типичную аминокислоту в коллагеновом белке, и примесь коллагена в этом протеогликане носового хряща лосося может быть обнаружена, но это количество слишком мало и не может рассматриваться как значимое. Поэтому можно утверждать, что степень чистоты полученного протеогликана носового хряща лосося является очень высокой.

Затем, для получения данных о молекулярном размере протеогликана носового хряща лосося, осуществляют высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке SB805HQ (8×300 мм), и положение элюции подтверждают с помощью УФ-поглощения при 215 нм. Этот результат сравнивают с результатом, полученным для протеогликана коровьего носового хряща, который является коммерчески доступным в качестве реагента. В случае протеогликана носового хряща лосося, положение элюции (Kav), определяемое как симметричный пик с SВ805НQ-колонки, составляет 0,28, а в случае протеогликана коровьего носового хряща, этот пик составляет 0,17. Эти результаты показывают, что молекулярный размер протеогликана носового хряща лосося меньше, чем молекулярный размер протеогликана коровьего носового хряща.

Кроме того, часть корового белка протеогликана носового хряща лосося расщепляют проназой, а остальную часть образца GAG анализируют с помощью электрофореза на пленке, изготовленной из ацетата целлюлозы вместе с сульфатом хондроитина (Ch6S), сульфатом дерматана (DS) и гиалуроновой кислотой (НА), которые представляют собой стандартные образцы. В соответствии с полученными результатами, одна полоса соответствует сульфату хондроитина (Ch6S), который является стандартным образцом, и поэтому, очевидно, что большую часть GAG протеогликана носового хряща лосося составляет сульфат хондроитина.

Также были проведены исследования изомера указанного дисахаридного звена. После расщепления протеогликана проназой, а затем хондроитиназой АВС, полученный ненасыщенный дисахарид анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографией (Полиамин-II). Полученные результаты показаны в таблице 2. Из данных таблицы 2 очевидно, что большую часть GAG составляет моносульфированное дисахаридное звено.

Таблица 2. Анализ на ненасыщенные дисахариды
Δ Di-0S	Δ Di-6S	Δ Di-4S	Δ Di-diSD	Δ Di-triS
15,1	59,4	25,1	0,3	0,1

Как было упомянуто выше, тот факт, что протеогликан, исходным материалом которого является носовой хрящ лосося, получают лишь с использованием перечисленных агентов, используемых в качестве добавок для пищевых продуктов [см.например, "Explanation of Analytical Method of Additives in Foods, part III, Food Additives Except Chemically Synthetic Compound" edited by Akio Tanimura et al (1992, Kodansha)] или агентов, используемых в качестве материала для агента консервирования пищи или для приправ ["Encyclopedia of Safety Supply of Food" edited by Kageaki Kuriihara et al (1995, Publishing Center of Sangyo Chosakai)], может рассматриваться как изобретение, имеющее мировое значение. Кроме того, установление того факта, что, благодаря настоящему изобретению, можно избежать проведения стадий, осуществление которых требует много времени и является трудоемким, таких как замещение мочевиной или разделение и очистка методом с использованием DEAE-Sephacel, может рассматриваться как важнейшее изобретение. Таким образом, благодаря настоящему изобретению, может быть осуществлена поставленная цель, а именно разработка более простого и недорогостоящего способа экстракции и очистки протеогликана.

В соответствии с вышеупомянутыми результатами, протеогликан носового хряща лосося, полученный способом настоящего изобретения, может быть введен перорально, и его чистота является почти такой же, как и чистота протеогликана, полученного стандартным методом.

Эффект настоящего изобретения

В настоящее время, гиалуроновая кислота может быть продуцирована бактериями безопасным способом и в больших количествах и используется в медицине. При этом известно, что протеогликан обладает превосходной способностью удерживать и доставлять воду, действует как противоядие и как анальгетик и, кроме того, предполагается, что он обладает другими функциями, обусловленными GAG-частью. Однако протеогликан, полученный стандартным методом экстракции и очистки, не может быть введен человеку, и его ценность для организма человека не может быть проверена. Более того, попытка выделения конъюгированного углевода, т.е., протеогликана, происходящего из носового хряща лосося, не была предпринята до тех пор, пока не был разработан и применен указанный метод. Однако, благодаря настоящему изобретению, появилась возможность экстракции и очистки протеогликана, который обладает превосходными безопасными свойствами и может быть получен в больших количествах. Следовательно, необходимость в получении протеогликана становится все более актуальной и ожидается, что он будет иметь более широкое применение.

Кроме того, поскольку органический растворитель, такой как хлороформ, метанол или ацетон, применяемый для удаления твердого жира из головной части лосося, не используется, то переработки жидких отходов больше не требуется, а следовательно, и решаются проблемы, связанные с загрязнением окружающей среды. Способ настоящего изобретения является простым и эффективным, а протеогликан, полученный указанным способом, является безопасным и может быть введен перорально. Благодаря разработке настоящего изобретения становится возможным получение новых продуктов, которые могут применяться в косметике, немедицинской химии и медицине, а также для изготовления лекарственных препаратов, пищевых продуктов, подвергаемых обработке, диетических пищевых добавок и искусственных внутренних органов. Следовательно, настоящее изобретение вносит огромный вклад в область здравоохранения и медицины.

1. Способ экстракции неочищенного протеогликана, отличающийся тем, что он включает использование уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща.

2. Способ экстракции неочищенного протеогликана, включающий экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща, фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан, для удаления осадка из указанного раствора, центрифугирование раствора, полученного указанной фильтрацией, добавление этанола, насыщенного хлоридом натрия, к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием, а затем центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен насыщенный хлоридом натрия этанол для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок.

3. Способ дополнительного улучшения очистки неочищенного протеогликана, включающий экстракцию неочищенного протеогликана с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя для хряща, фильтрацию раствора, содержащего неочищенный протеогликан, для удаления осадка из указанного раствора, центрифугирование раствора, полученного указанной фильтрацией, добавление этанола, насыщенного хлоридом натрия, к надосадочной жидкости, полученной указанным центрифугированием, центрифугирование указанной надосадочной жидкости, к которой был добавлен насыщенный хлоридом натрия этанол для концентрирования указанного неочищенного протеогликана в осадок, растворение указанного осадка, содержащего неочищенный протеогликан, с использованием уксусной кислоты в качестве элюирующего растворителя указанного неочищенного протеогликана, а затем диализ.