Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей

Авторы патента:

Ишутин Василий Александрович (RU)

Аксенов Алексей Вадимович (RU)

Кармишин Александр Юрьевич (RU)

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

C12Q1/04 - установление присутствия и(или) вида микроорганизма; использование селективных сред для испытания антибиотиков или бактерицидов; составы, содержащие химический индикатор для этих целей

Владельцы патента RU 2276190:

Военный университет радиационной, химической и биологической защиты (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, касается определения микроскопических грибов, бактерий или дрожжей в анализируемой пробе и может быть использовано в медицине, фармацее, пищевой и легкой промышленностях. Изобретение предусматривает использование хемилюминесцентного состава, включающего в себя щелочной раствор люминола, к которому добавляют перекись водорода. Определения присутствия микроскопических грибов, бактерий и дрожжей осуществляют на сертифицированном анализаторе жидкостей хемилюминесцентном ЛИК путем смешения пробы с хемилюминесцентным составом в его реакционной камере с последующей регистрацией кривой кинетики хемилюминесценции, по расчетным параметрам которой определяют принадлежность микроорганизма к бактериям, грибам или дрожжам. Преимуществом предложенного способа являются: отсутствие термостатирования, быстрота (100 с) получения результата, достоверность и точность результатов, а также возможность идентифицировать бактерии, дрожжи, микроскопические грибы. 4 ил., 4 табл.

Изобретение относится к способу экспрессного определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в пробах разной консистенции и может быть использовано в медицине, формации, пищевой и легкой промышленности, в сельском хозяйстве, нефтедобывающей промышленности и при защите сырья, материалов и изделий из них от микроорганизмов.

Известен способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей путем высева анализируемых проб на селективные питательные среды в чашки Петри, термостатирования в течение 24-72 часов при температуре (25-37)±1°C. О принадлежности микроорганизмов к данной группе судят по характеру роста на конкретной среде и по виду колоний. Способ весьма трудоемок и продолжителен во времени. (Покровский В.И., Поздеев O.K. Медицинская микробиология, "ГЭОТАР медицина", М., 1999. - 1183 с.)

Известен быстрый (15-30 мин) способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей, основанный на методах окраски с последующим микроскопированием (Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований, "Медицина", М., 1978. - 391 с.). Способ включает следующие операции: приготовление фиксированного мазка исследуемого образца, окрашивание препарата, промывание водопроводной водой, подсушивание и микроскопирование с иммерсионной системой. О принадлежности микроорганизмов к бактериям, грибам или дрожжам судят по морфологическим особенностям окрашенного препарата.

Недостатком этого способа является большая трудоемкость, обязательное использование спецлаборатории, дорогостоящих приборов, посуды, оборудования и недостаточная чувствительность.

Техническая задача, на решение которой направлен заявленный экспрессный способ, являлось определение микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в пробах разной консистенции, при контроле повреждений микроорганизмами сырья, материалов и изделий из них, снижение трудоемкости, исключение использования спецлаборатории, спецоборудования и приборов, снижение числа используемой посуды, реактивов, повышение чувствительности.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе, включающем:

1. Растворение исследуемой пробы в стерильном физрастворе.

2. Помещение реактива (0,1-0,8%-ного раствора люминола в щелочи (рН 10,0-13,8), к 100 см³ которого добавляют 0,3-1,0 см³ 30%-ной перекиси водорода) в кювету для анализа.

3. Смешение реактива с растворенной пробой в реакционной камере прибора.

4. Контроль параметров кинетики протекающей люминольной реакции.

Вышеперечисленные действия анализа проводят с помощью анализатора жидких проб (Патент №2009466 от 15.03.1994 г., G 01 N 15/02), сертифицированного как анализатор жидкостей хемилюминесцентных ЛИК (сертификат РФ №14433 от 27.03.03, Госреестр РФ №24512-03 от 12.03.03.)

Известно (Диксон М., Уэбб Э. Ферменты, М.: Ин. лит-ра, 1966. - 728 с.), что абсолютное большинство микробов содержат в своих биохимических системах ферменты группы оксидаз. Эти ферменты ответственны за окислительно-восстановительные процессы, в составе которых имеется железопорфирины.

При смешивании анализируемой пробы, содержащей микробные клетки, с раствором люминола они денатурируют и оксидазные ферменты катализируют распад перекиси водорода по цепному свободно радикальному процессу. Возникает перенос электрона (гомолиз)

Fe²⁺+Н₂O₂→Fe³⁺+ОН^-+ОН^*

И последующие реакции

В процессе последних реакций рекомбинации свободных радикалов образуются короткоживущие соединения типа ассоциированного и неассоциированного Ван-дер-Ваальсовского комплексов кислорода, обладающие избыточной энергией, которая трансформируется люминолом в световую по реакции:

Таким образом, люминол выступает в роли трансформатора избыточной энергии комплексов кислорода в световую, а перекись водорода выступает в качестве их источника при ее катализе ферментами группы оксидаз.

Для регистрации квантов света используют анализатор жидкостей ЛИК, технические характеристики которого позволяют регистрировать кинетику хемилюминесценции, производить расчет ее параметров, по совокупности которых проводят определение либо микроскопических грибов, бактерий или дрожжей.

На фиг.1 представлена кинетическая кривая хемилюминесценции и ее регистрируемые параметры, где по оси абсцисс отложено t - время, сек; по оси ординат I_хл - интенсивность хемилюминесценции, отн.ед. (1 отн.ед=1,6375×10^-11 Лм, люмен); A_m - максимальное значение интенсивности хемилюминесценции, отн.ед.; t_m - время достижения интенсивности хемилюминесценции своего максимального значения, сек; S - площадь под кривой кинетики хемилюминесценции, отн.ед.×с.

На фиг 2-4 представлены кинетические кривые хемилюминесценции, получаемые от грибов, бактерий и дрожжей:

фиг.2 - форма кривой кинетики, инициируемая микроскопическими грибами;

фиг.3 - форма кривой кинетики, инициируемая дрожжами;

фиг.4 - форма кривой кинетики, инициируемая бактериями.

В таблице 1 приведены конкретные значения контролируемых параметров кинетики хемилюминесценции при анализе проб, содержащих вышеуказанные микроорганизмы.

Пример: проводили анализ смывов с поверхностей оборудования, которое эксплуатировалось на колбасном заводе, хлебозаводе, продовольственном магазине (поверхности корпуса и лопастей смесителей, поверхности холодильных установок, столов расфасовки и обеденных столов). Смыв осуществляли стерильным физиологическим раствором с соблюдением мер стерильности и проводили анализ смывной жидкости на приборе ЛИК.

Перед проведением анализа отобранных проб готовили разведения чистых культур микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в стерильном физрастворе концентрацией 10⁵-10⁶ клеток/см³. Концентрацию клеток в разведении контролировали с помощью прибора мутности. В качестве чистых культур использовали Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Penicillium glaucum. Готовили прибор ЛИК к работе согласно инструкции.

Полученные разведения чистых культур поочередно анализировали на приборе ЛИК, регистрируя при этом значения максимальной интенсивности хемилюминесценции, время достижения хемилюминесценции своего максимального значения и площадь под кривой хемилюминесценции. Каждый анализ культуры проводили десять раз, вычисляли среднее значение контролируемых параметров и запоминали в памяти компьютера. Полученные значения контролируемых параметров кинетики хемилюминесценции чистых культур в последующем использовали как контрольные при анализе проб, отобранных с поверхностей различных объектов.

Для этого в кювету прибора наливали 0,5 см³ анализируемой пробы и помещали ее в реакционную камеру. Камеру закрывали крышкой-дозатором, в полость которого наливали 0,5 см³ хемилюминесцентного состава. Закрывали крышку прибора, нажимали на кнопку, "Пуск", а затем на крышку прибора. При этом хемилюминесцентный состав из полости крышки-дозатора через калиброванное отверстие вводился в кювету с пробой. При наличии в ней микробных клеток реакционная смесь начинает светиться. Свет преобразуется в электрический сигнал, который обрабатывается по специальному алгоритму и отображается на экране компьютера в виде кривой кинетики, и автоматически компьютер рассчитывает контролируемые ее параметры. Рассчитанные параметры анализируемой пробы сравниваются с представленными в таблице 1 и таким образом определяют наличие в анализируемой пробе микроскопических грибов, бактерий или дрожжей.

Хемилюминесцентный состав готовят путем смешения 100 см³ 0,1-0,8%-ного раствора люминола в щелочи (рН 10,0-13,8) с 0,3-1,0 см³30%-ной перекиси водорода.

Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что предлагаемый способ позволяет проводить экспрессное определение в пробах разной консистенции микроскопических грибов, бактерий и дрожжей, о чем свидетельствуют данные, приведенные в таблицах 2-4.

Использование предлагаемого экспрессного способа имеет следующие преимущества:

- нет надобности в сложной подготовке проб к анализу;

- для определения в анализируемых пробах микроскопических грибов, бактерий и дрожжей используется хемилюминесцентный состав и прибор отечественного производства с чувствительностью 30-70 КОЕ/см³, а сама кривая кинетики хемилюминесценции отображается в процессе анализа на мониторе компьютера, что позволяет оператору исключить ошибки при проведении анализа;

- определение в пробах микроскопических грибов, бактерий и дрожжей по параметрам кривой кинетики хемилюминесценции проводится впервые в микробиологической практике, которые прямо связаны с морфологией и особенностями биохимических систем их клеток, содержащих ферменты группы оксидаз;

- быстрота (100 с) получения аналитического эффекта и отсутствие последствия;

- впервые обеспечена возможность быстро проводить определение указанных микроорганизмов непосредственно на объектах контроля, в том числе и на открытой местности;

- исключены посев проб на селективные питательные среды, их термостатирование и микроскопирование.

Таблица 1 Контролируемые параметры кинетики хемилюминесценции при анализе проб
Микроорганизмы	А_m, отн.ед.	t_m, сек.	S, отн.ед
Микроскопические грибы	5,5±4,5·10⁶	0,2±0,1	10,3±9,7·10⁸
Бактерии	4,3±4,2·10⁷	4,5±2,5	7,8±7,47·10⁹
Дрожжи	2,1±2,0·10⁷	1,15±1,12	3,28±3,22·10⁸
Таблица 2 Результаты контроля присутствия бактерий, дрожжей и микроскопических грибов на объектах колбасного завода
Контролируемый объект	A_m, отн.ед.	t_m, сек	S, отн.ед	Вывод о присутствии бактерий, грибов или дрожжей
Контрольные пробы
Физиологический раствор	4,6·10⁵	0,04	2,7·10⁶	нет
Escherichia coli	1,3·10⁶	6,39	1,6·10⁷	бактерии
Saccharomyces cerevisiae	1,6·10⁶	2,22	4,6·10⁷	дрожжи
Penicillium glaucum	1,2·10⁶	0,21	1,4·10⁷	грибы
Пробы с объектов
Разделочный стол	6,6·10⁵	0,05	2,3·10⁶	нет
Пол	4,4·10⁶	0,24	4,3·10⁷	грибы
Бак с отходами	2,6·10⁶	6,50	7,8·10⁷	бактерии
Обеденный стол	1,2·10⁶	6,39	1,6·10⁷	бактерии

Таблица 3 Результаты контроля присутствия бактерий, дрожжей и микроскопических грибов на объектах хлебозавода
Контролируемый объект	A_m, отн.ед.	t_m, сек	S, отн.ед	Вывод о присутствии бактерий, грибов или дрожжей
Контрольные пробы
Физиологический раствор	4,6·10⁵	0,04	2,7·10⁶	нет
Escherichia coli	1,3·10⁶	6,39	1,6·10⁷	бактерии
Saccharomyces cerevisiae	1,6·10⁶	2,22	4,6·10⁷	дрожжи
Penicillium glaucum	1,2·10⁶	0,21	1,4·10⁷	грибы
Пробы с объектов
Лопасти смесителя	4,2·10⁶	0,60	5,4·10⁷	дрожжи
Поверхность корпуса	1,0·10⁷	2,12	2,2·10⁸	дрожжи
Пол в раздевалке	2,4·10⁶	0,12	2,3·10⁷	грибы
Таблица 4 Результаты контроля присутствия бактерий, дрожжей и микроскопических грибов на объектах продовольственного магазина
Контролируемый объект	Am, отн.ед	tm, сек	S, отн.ед	Вывод о присутствии бактерий, грибов или дрожжей
Контрольные пробы
Физиологический раствор	5,3·10⁵	0,04	3,1·10⁶	нет
Escherichia coli	1,1·10⁶	6,82	3,2·10⁷	бактерии
Saccharomyces cerevisiae	2,4·10⁶	1,90	3,8·10⁷	дрожжи
Penicillium glaucum	6,9·10⁶	0,15	5,7·10⁷	грибы
Пробы с объектов
Стены	2,1·10⁶	7,02	7,9·10⁷	бактерии
Пол	1,4·10⁷	0,12	1,5·10⁸	грибы
Стол для резки	3,6·10⁵	0,04	1,8·10⁶	нет

Экспрессный способ определения микроскопических грибов, бактерий и дрожжей в анализируемой пробе, отличающийся тем, что пробу смешивают с реактивом, включающим в себя 0,1-0,8%-ный раствор люминола в щелочи с рН 9,0-13,0 в 100 см³ которого добавляют 0,3-1,0 см³ 30%-ной перекиси водорода в кювете анализатора жидкостей хемилюминесцентного ЛИК, регистрируют параметры хемилюминесценции: максимальную ее интенсивность (А_m), время достижения максимума хемилюминесценции (t_m) и площадь по кривой хемилюминесценции (S), по совокупности значений которых устанавливают наличие в пробе микроскопических грибов, бактерий и дрожжей.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в хирургии, терапии, лучевой диагностике. .

Способ определения количественного содержания калия и натрия в слюне // 2275638

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и предназначено для определения количественного содержания калия и натрия в слюне. .

Способ прогнозирования исхода комплексного лечения больных распространенным гнойным перитонитом при интраабдоминальном введении имозимазы // 2275632

Изобретение относится к медицине, а именно к методам исследования системы гомеостаза. .

Способ диагностики дерматомикозов и питательная среда для дерматофитов // 2275631

Изобретение относится к медицинской микологии и клинической микробиологии. .

Способ определения среднего значения насыщения кислородом смешанной венозной крови человека (варианты) // 2275630

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической физиологии, к способам неинвазивного определения газовых параметров крови для последующего использования их в функциональной диагностике для оценки текущего состояния кровообращения и газообмена человека в покое и при физической нагрузке, без использования процедуры зондирования полостей сердца и крупных сосудов.

Способ количественного определения карбоксимиоглобина в гомогенате последа // 2275629

Изобретение относится к медицине и, в частности, к лабораторным способам исследования и может быть использовано для количественного определения карбоксимиоглобина в гомогенате последа, рожденного женщиной, подвергшейся во время беременности длительному воздействию окиси углерода в атмосферном воздухе в концентрации, превышающей среднесуточную предельно допустимую концентрацию (ПДК), в период экологического неблагополучия - массивных лесных пожаров.

Способ посмертного определения продолжительности летальной гипоксической гипоксии // 2274861

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины, в частности к судебной медицине. .

Способ повышения чувствительности метода пцр диагностики микоплазменной урогенитальной инфекции у больных с выраженным экссудативным воспалением // 2274449

Изобретение относится к области медицины, в частности к урологии, нефрологии, венерологии, гинекологии, неонатологии, офтальмологии и может быть использовано в ветеринарии.

Способ индивидуального выбора эффективного химиотерапевтического средства для лечения воспалительных заболеваний микробной этиологии // 2273854

Изобретение относится к области медицины. .

Способ бактериоскопической экспрессной идентификации микрофлоры содержимого толстой и прямой кишки // 2273853

Изобретение относится к области медицины, а именно к колопроктологии, гастроэнтерологии, клинической микробиологии. .

Питательная среда для культивирования гетеротрофных бактерий // 2276188

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к производству питательных сред. .

Способ диагностики дерматомикозов и питательная среда для дерматофитов // 2275631

Изобретение относится к медицинской микологии и клинической микробиологии. .

Питательная смесь и способ идентификации и раннего определения количества грамотрицательных микроорганизмов // 2275429

Изобретение относится к микробиологии. .

Способ приготовления питательной среды для выявления кишечной палочки серотипа 0157 // 2273661

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для клинических и эпидемиологических исследований. .

Способ внутривидовой дифференциации vibrio cholerae о139 // 2268942

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике холеры. .

Питательная среда для первичной дифференциации условно-патогенных энтеробактерий // 2268932

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской микробиологии. .

Способ накопления листериозного микроба (listeria monocytogenes) // 2268307

Изобретение относится к микробиологии, а именно к санитарно-гигиеническому контролю за инфицированностью морской среды. .

Тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза // 2268298

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микробиологии и может быть использовано при индивидуальном подборе лекарственных препаратов для лечения туберкулеза.

Питательная среда для выделения бруцелл // 2266956

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к клинической микробиологии, и может быть использовано для бактериологической диагностики бруцеллеза. .

Способ индукции гемолитической активности bacillus anthracis // 2265666

Изобретение относится к микробиологии и может найти применение в биотехнологии. .

Способ диагностики туберкулезной инфекции, рекомбинантная плазмидная днк, кодирующая синтез гибридного белка cfp10-esat6 из mycobacterium tuberculosis, способ его получения, гибридный белок cfp10-esat6 и его применение // 2277540

Изобретение относится к области биотехнологии и может также найти применение в медицине