Способ получения обогащенной цинком биомассы спирулины (spirulina platensis)
Владельцы патента RU 2277124:
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской Академии Наук (RU)
Изобретение относится к фитобиотехнологии, микробиологии, медицине, пищевой промышленности. Согласно способу обогащенную цинком биомассу спирулины (Spirulina platensis) получают при одновременном введении в культуральную среду нитрата или сульфата цинка 10-30 мг/л и посевного инокулята 0,1-0,3 мг сух. массы/л. Это позволило получить биомассу спирулины в концентрациях 3,30-4,30 мг/г сухой массы. За короткие сроки (4-5 дней культивирования) достигается выход биомассы 2,5-3,6 г/л. 2 ил., 4 табл.
Изобретение относится к способам получения биологически активных соединений (БАС), обогащенных цинком, на основе биомассы цианобактерии Spirulina platensis и может быть использовано в фитобиотехнологии, микробиологии, медицине, альгологии, пищевой промышленности и в сельском хозяйстве.
Недостаток цинка вызывает функциональные и морфологические изменения в деятельности органов и систем (Hambidge K.M., Casey C.E., Krebs N.F. Trace elements in human and animal nutrition. Ed. Mertz W. Orlando; San Diego; New York: Acad. Press, 1, 1986).
Известен способ получения обогащенной биомассы спирулины, обогащенной амфотерным элементом селеном (Патент РФ 2096037, МКИ А 61 К 33/04, опубликованный 20.11.97, БИ №32). Этот способ заключается в том, что неорганические соли селена вводятся в питательную среду в начале и в первой половине логарифмической фазы роста культуры спирулины на 5-10 сутки после начала инкубации.
Известен другой способ получения обогащенной селеном биомассы спирулины, заключающийся в предварительной подготовке инокулята путем культивирования цианобактерии в течение 7-10 пассажей на агаризованных средах с содержанием серы 15-30 мг/л (5-10% от нормы) в присутствии 15-30 мг/л селенита натрия и использовании полученного таким образом инокулята для ведения производства в питательной среде с таким же содержанием селена и серы как и при подготовке инокулята (Патент РФ 2199582, МКИ А 61 К 33/04, опубликованный 27.02.2003, БИ №6).
Однако известно, что внутриклеточные транспортные системы жизненно необходимых (эссенциальных) элементов цинка и селена различаются (Blencowe D.K., Morby А.Р. Zn (II) metabolism in prokaryotes. FEMS Microbiology Reviews, 27, 2003, 291-311). Значит, процесс накопления цинка клетками спирулины отличается от процесса внутриклеточной аккумуляции селена.
Задачей настоящего изобретения является разработка нового способа получения обогащенной цинком биомассы спирулины при отсутствии ингибирования роста этой цианобактерии.
Задача решена тем, что разработан новый способ получения биомассы спирулины с высоким содержанием цинка, причем биомассу получают при одновременном введении в культуральную среду нитрата или сульфата цинка 10-30 мг/л и посевного инокулята 0,1-0,3 мг сух. массы/л.
Из научно-технической и патентной литературы авторам не известны технические решения, которые могли бы в предлагаемой совокупности существенных признаков позволить получить биомассу микроводорослей с высоким содержанием цинка в биологически активных соединениях и без ингибирования скорости роста при внесении соли цинка в среду культивирования.
Сущность изобретения заключается в том, что при внесении цинка в среду вместе с инокулятом максимальное его накопление в клетках достигается в середине линейной стадии (4-6 сутки), после чего наблюдается достаточно быстрый вынос металла обратно в среду культивирования и к 8 суткам, при выходе ростовой кривой на стационарную фазу, внутриклеточное содержание цинка практически равно его содержанию в клетке в начале эксперимента до внесения цинка в питательную среду.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Инокулят засевают до конечной плотности 0,2±0,1 мг/л в питательную среду Заррука (табл.1) с содержанием цинка 2,2 мг/л (10 мг/л нитрата цинка). Выращивание культуры проводят при температуре 33±2°С, освещенности 90±10 Вт/м2 и непрерывном барботировании газовоздушной смесью, содержащей 1,7-2,0% CO2.
При приготовлении среды ее компоненты последовательно растворяют в воде, затем вносят микроэлементы, раствор железа с натриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (Fe + EDTA) и нитрат цинка, предварительно растворенный в воде. Время культивирования составляет 4-6 суток, что определяется максимальным накоплением цинка в клетках спирулины, и соответствует середине линейной стадии роста культуры. Плотность суспензии на данном этапе культивирования составляет 3,6 г сухой массы в л суспензии. Биомассу спирулины сливают и полученную суспензию отделяют от среды фильтрованием, промывают от способного сорбироваться клеточными мембранами внеклеточного цинка физиологическим раствором объемом, равным объему суспензии, и высушивают. Получают биомассу, внутриклеточный цинк которой полностью включается в состав БАС и содержание которого по примерам 1-6 представлено в табл.4, гр. 5.
| Таблица 1 Состав среды Заррука: | |
| Наименование компонентов | Концентрация, г/л |
| NaHCO3 | 16,8 |
| NaNO3 | 2,5 |
| NaCl | 1,0 |
| K2HPO4 | 1,0 |
| K2SO4 | 1,0 |
| MgSO4*7H2O | 0,2 |
| FeSO4+EDTA* | 1 мл |
| Раствор микроэлементов №1 | 1 мл |
| Раствор микроэлементов №2 | 1 мл |
| *Приготовление раствора натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (Fe + EDTA) проводят следующим образом: в 134 мл 1N КОН растворяли 32,2 г EDTA. Раствор разбавляют водой, после чего вносят 24,9 г FeSO4×7H2O и доводят объем раствора до 1 л. После разведения раствор продувают воздушной смесью, не содержащей CO2 в темноте в течение 12 часов. |
| Таблица 2 Состав раствора микроэлементов №1 для среды Заррука: | |
| Наименование компонентов | Концентрация, г/л |
| Н3ВО3 | 2,86 |
| MnCl2*4H2O | 1,81 |
| ZnSO4*7H2O | 0,22 |
| CuSO4*5H2O | 0,08 |
| МоО3 | 0,015 |
| Таблица 3 Состав раствора микроэлементов №2 для среды Заррука | |
| Компонент | Концентрация, г/л |
| NH4VO3 | 0,023 |
| К2Cr2(SO4)4*24Н2O | 0,096 |
| NiSO4*7H2O | 0,048 |
| Na2WO4*2H2O | 0,018 |
| Ti2(SO4)3 | 0,04 |
| Со(NO3)2*6Н2O | 0,044 |
Пример 2
Для засева фотореактора используют суспензию как описано в примере 1. Инокулят засевают в питательную среду, содержащую 4,4 мг/л цинка (20 мг/л нитрата цинка). Водоросли выращивают в тех же условиях, как в примере 1, в течение 4-6 суток, т.е. до середины линейной стадии роста. Сбор, отмывку и высушивание биомассы проводят согласно примеру 1.
Пример 3
Используют суспензию как описано в примере 1. Инокулят засевают в питательную среду, содержащую 6,6 мг/л цинка (30 мг/л нитрата цинка). Водоросли выращивают в условиях как описано в примере 1. Сбор, отмывку и высушивание биомассы проводят согласно примеру 1.
Пример 4
Используют суспензию как описано в примере 1. Инокулят засевают в питательную среду, содержащую 2,3 мг/л цинка (10 мг/л сульфата цинка). Водоросли выращивают в условиях как описано в примере 1. Сбор, отмывку и высушивание биомассы проводят согласно примеру 1.
Пример 5
Для засева реактора используют суспензию как описано в примере 1. Инокулят засевают в питательную среду, содержащую 4,6 мг/л цинка (20 мг/л сульфата цинка). Водоросли выращивают в тех же условиях, как в примере 1. Сбор, отмывку и высушивание биомассы проводят согласно примеру 1.
Пример 6
Для засева реактора используют суспензию как описано в примере 1. Инокулят засевают в питательную среду, содержащую 6,8 мг/л цинка (30 мг/л сульфата цинка). Водоросли выращивают в тех же условиях, как в примере 1. Сбор, отмывку и высушивание биомассы проводят согласно примеру 1.
| Таблица 4 Зависимость содержания цинка в биологически активных соединениях и скорости роста Spirulina platensis от модификации среды при получении обогащенной цинком биомассы | ||||
| Примеры | Накопление биомассы на момент сбора культуры, г/л | Прирост, г сух. массы/на литр суспензии в сутки | Содержание цинка в среде, мг/л | Содержание цинка в биомассе, мг/г сух. массы |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 1 | 3,6 | 0,75 | 2,2 | 3,50 |
| 2 | 3,2 | 0,75 | 4,4 | 4,30 |
| 3 | 2,8 | 0,75 | 6,6 | 4,20 |
| 4 | 3,6 | 0,75 | 2,3 | 3,30 |
| 5 | 3,2 | 0,75 | 4,6 | 4,10 |
| 6 | 2,5 | 0,75 | 6,8 | 4,20 |
Как следует из результатов табл.4, настоящее изобретение, а именно внесение в среду культивирования нитрата или сульфата цинка в количестве 10-30 мг/л (2,2-6,8 мг/л цинка) и введение посевного инокулята 0,1-0,3 мг сух. массы/л, позволило получить биомассу спирулины с разным обогащением цинком в концентрациях 3,30-4,30 мг/г сухой массы, который полностью включался в БАС. При этом за короткие сроки (4-5 дней культивирования) был достигнут средний выход биомассы 2,5-3,6 г/л без ингибирования скорости роста культуры солями цинка.
Для понимания технической сущности изобретения представлены графические характеристики роста Spirulina platensis в присутствии различных концентраций и солей цинка (Фиг.1). Учет роста культуры осуществляли спектрофотометрически по оптической плотности (D750) при длине волны λ=750 нм, и, так как показатель D750 достоверно коррелирует со значением сухого веса культуры, пересчитывали на значение сухой биомассы (к=0.876) (Фиг.1, Табл.1, графа 2). Представлена динамика накопления цинка клетками Spirulina platensis (Фиг.2). Из представленных данных видно, что максимальное накопление цинка в клетках культуры достигается к середине линейной стадии (4-6 сутки), после чего наблюдается достаточно быстрый вынос металла обратно в среду культивирования, и к 8 суткам, при выходе ростовой кривой на стационарную фазу, внутриклеточное содержание цинка практически равно его содержанию в клетке в начале эксперимента, до внесения цинка в питательную среду. В связи с этим выбор биомассы осуществляют на середине линейной стадии роста культуры Spirulina platensis.
Способ получения обогащенной цинком биомассы спирулины (Spirulina platensis), характеризующийся тем, что культуру спирулины выращивают в присутствии нитрата или сульфата цинка при одновременном введении его в культуральную среду в количестве 10-30 мг/л вместе с посевным инокулятом в количестве 0,1-0,3 мг сух. массы/л.
