Способ количественного определения альбикара в биологических объектах
Владельцы патента RU 2278384:
ГОУ ВПО "Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения РФ" (RU)
Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии - способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах. Предлагается способ количественного определения альбикара в сложном многокомпонентном биологическом материале, таком как плазма крови или моча, заключающийся в том, что анализируемую пробу плазмы крови или мочи обрабатывают органическим экстрагентом, к сухому остатку после упаривания растворителя добавляют хлороформный раствор внутреннего стандарта, в качестве которого используют 2,4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло [3.3.0]октандион-3,7 в соотношении масс. альбикар - внутренний стандарт 1:3; 2:3; 3:3; 3:2; 3:1, полученный раствор анализируют методом газожидкостной хроматографии при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С. Количественное содержание альбикара определяют по предварительно найденному относительному калибровочному коэффициенту Ki/s, по формуле
где Ws и Wi - площади пиков внутреннего стандарта и альбикара, a Qi и Qs - массовые количества альбикара и внутреннего стандарта в смеси. Технический результат: количественное определение альбикара в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата и может быть использован при выполнении клинических или фармакокинетических исследований препарата, а также при изучении его метаболизма. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии - способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах.
Альбикар (2,6-диметил-4,8-диэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандион-3,7) по своей структуре является представителем бициклических бисмочевин; биологические испытания выявили у него выраженную психофармакологическую активность [Зимакова И.Е. Экспериментальное обоснование возможности применения в медицине нового биологически активного класса химических веществ - производных бициклических бисмочевин: Автореф. дис....д-ра фарм. наук. /Казан, гос. мед. ин-т. - 1978. - 46 с.]. До настоящего времени не описано специфичного, чувствительного способа количественного определения данного вещества в субстанции, лекарственных формах, биологическом материале, известен лишь способ определения мочевины в крови (SU № 1774262 А1, 07.11.1992).
Задачей изобретения является обеспечение возможности количественного определения альбикара в сложном многокомпонентном биологическом материале.
Это достигается тем, что анализируемую пробу биожидкости обрабатывают органическим экстрагентом, к сухому остатку после упаривания растворителя добавляют раствор 2,4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандиона-3,7, анализируют методом газожидкостной хроматографии при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С, количественное содержание альбикара определяют по предварительно найденному относительному калибровочному коэффициенту Ki/s.
Анализируемую пробу биожидкости (кровь, моча) обрабатывают органическим экстрагентом с целью извлечения альбикара. 2,4,6,8-Тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандион-3,7 добавляют к остатку после упаривания экстрагента, поскольку именно это вещество используется в качестве внутреннего стандарта. Предлагаемый температурный режим газожидкостного хроматографирования аналита необходим потому, что именно в этих условиях происходит удовлетворительное разделение пиков альбикара и эндогенных соединений.
Способ осуществляют следующим образом.
Из крови или мочи исследуемых животных (крысы-самцы) альбикар экстрагируют хлороформом, к сухому остатку после упаривания растворителя добавляют хроматографически чистый внутренний стандарт, представляющий собой раствор 2,4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандиона-3,7, например, в хлороформе с концентрацией 0,1%. В испаритель детектора сразу же вводят 1-3 мкл пробы и определяют количественное содержание альбикара по предварительно найденному относительному калибровочному коэффициенту Ki/s.
Пробу анализируют при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С, концентрацию альбикара определяют по калибровочному графику, в этих условиях время удерживания внутреннего стандарта и альбикара составляет соответственно 20, 50 и 24, 25 мин.
Получение количественных данных.
В качестве параметра расчета хроматограмм используют площадь пиков. Для нахождения значений относительного калибровочного коэффициента Ki/s альбикара по внутреннему стандарту готовят калибровочные смеси альбикар - внутренний стандарт в соотношениях масс 1:3; 2:3; 3:3; 3:2; 3:1 и хроматографируют при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С.
Значения Ki/s рассчитывают по формуле
где Ws и Wi - площади пиков внутреннего стандарта и альбикара,
Qi и Qs - массовые количества альбикара и внутреннего стандарта в смеси.
Разработанный способ может быть использован для количественного определения альбикара в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата, а также при выполнении клинических или фармакокинетических исследований препарата, а также при изучении его метаболизма.
Пример. Количественное определение альбикара в плазме крови и моче крыс (модельные растворы). К 1 мл интактных плазмы крови или мочи с известной концентрацией альбикара добавляют 20 мл хлороформа и производят экстракцию встряхиванием на шейкере в течение 15 мин. Водную фазу отделяют от хлороформной вымораживанием в морозильной камере при температуре -15°С в течение 15 ч. Хлороформный экстракт упаривают до объема 2-3 мл на роторном испарителе, переносят в пробирку с дном, оттянутым в капилляр и упаривают досуха в токе азота. К полученному сухому остатку добавляют внутренний стандарт. В испаритель хроматографа вводят 1-3 мкл пробы и хроматографируют при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С. В таблице приведены результаты определения концентрации альбикара в биологических жидкостях. Как видно из данных, приведенных в таблице, относительная ошибка определения концентрации альбикара при его различных концентрациях в моче не превышает 3,8%, а в плазме крови - 4,2%. Низкие значения коэффициента вариации - 3,4% - указывают на хорошую воспроизводимость методики.
Результаты количественного определения альбикара в биологических жидкостях (модельные растворы). | |||||||
Добавлено альбикарамкг/мл | Найдено альбикара | Метрологическая характеристика (р=0,95) | |||||
мкг/мл | S | ε | Аотн. % | ||||
Плазма крови | |||||||
199,6 | |||||||
195,3 | |||||||
200 | 201,4 | 201,2 | 4,10 | 2,04 | 1,83 | 5,09 | 2,53 |
203,8 | |||||||
206,0 | |||||||
20,65 | |||||||
20,06 | |||||||
20 | 19,10 | 19,97 | 0,574 | 2,87 | 0,257 | 0,714 | 3,58 |
20,14 | |||||||
19,72 | |||||||
1,92 | |||||||
1,95 | |||||||
2 | 1,90 | 1,97 | 0,067 | 3,40 | 0,030 | 0,083 | 4,21 |
2,07 | |||||||
1,99 | |||||||
Моча | |||||||
196,8 | |||||||
202,6 | |||||||
200 | 196,0 | 199,0 | 2,84 | 1,43 | 1,27 | 3,53 | 1,77 |
198,5 | |||||||
201,3 | |||||||
20,42 | |||||||
19,72 | |||||||
20 | 19,59 | 20,01 | 0,352 | 1,76 | 1,157 | 0,436 | 2,18 |
20,08 | |||||||
20,26 | |||||||
1,97 | |||||||
2,04 | |||||||
2 | 1,97 | 1,99 | 0,60 | 3,02 | 0,027 | 0,075 | 3,77 |
1,91 | |||||||
2,06 |
Способ количественного определения альбикара - 2,6-диметил-4,8-диэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандиона-3,7- в биологических жидкостях, характеризующийся тем, что анализируемую пробу плазмы крови или мочи обрабатывают органическим экстрагентом, к сухому остатку после упаривания растворителя добавляют раствор 2, 4,6,8-тетраэтил-2,4,6,8-тетраазабицикло[3.3.0]октандиона-3,7 в соотношении масс. альбикар - внутренний стандарт 1:3; 2:3; 3:3; 3:2; 3:1, анализируют методом газожидкостной хроматографии при следующем температурном режиме: температура колонки 185°С, температура испарителя 250°С, температура детектора 220°С, количественное содержание альбикара определяют по предварительно найденному относительному калибровочному коэффициенту Ki/s, который рассчитывают по формуле
где Ws и Wi - площади пиков внутреннего стандарта и альбикара;
Qi и Qs - массовые количества альбикара и внутреннего стандарта в смеси.