Биокатализатор для инверсии сахарозы, носитель для биокатализатора, способ приготовления биокатализатора и способ инверсии сахарозы

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биокатализаторам и способам приготовления биокатализаторов для инверсии сахарозы с целью получения сахаристых веществ. Биокатализатор для инверсии сахарозы включает твердый углеродсодержащий носитель, на поверхности которого иммобилизованы дрожжевые мембраны, твердым носителем является гранулированный углеродсодержащий носитель, приготовленный на основе природных илистых отложений - сапропелей и имеющий макропористую структуру. Иммобилизацию проводят путем длительной адсорбции на поверхности данного твердого углеродного носителя. Процесс ферментативной инверсии сахарозы проводят в непрерывном режиме в реакторе с неподвижным слоем биокатализатора. Изобретение позволяет получить высокоактивные и стабильные биокатализаторы. 4 н.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к биокатализаторам, способам их приготовления и процессу инверсии сахарозы с целью получения инвертных сахарных сиропов (глюкозофруктозных сиропов) и может быть использовано в пищевой промышленности для производства кондитерских изделий, мороженого и безалкогольных напитков. Как известно, глюкозофруктозные сиропы обладают ценными потребительскими свойствами, при этом существенно улучшают качество производимой продукции.

Известен способ получения инвертных сиропов из сахара с использованием кислот - лимонной, иногда соляной, предпочтительно серной, при повышенной температуре, равной 80°С [Сапронов А.Р. Технология сахарного производства. М.: Колос, 1998, 496 с]. Недостатком данного способа является протекание побочных нежелательных реакций с образованием окрашенных веществ, в результате чего качество конечного продукта (инвертного сахара) значительно снижается.

Известен способ получения инвертного сахара с помощью биокатализатора, включающий фермент инвертазу и твердый носитель [Пат. RU 2224020, C 12 N 11/14, 20.02.2004]. В качестве твердого носителя используют неорганический алюмосиликатный носитель, на поверхности которого синтезирован слой каталитического волокнистого углерода. Процесс проводят в непрерывном режиме при температуре не ниже 50°С. Недостатком этого способа является использование для приготовления биокатализатора специально изолированных из различных микроорганизмов ферментов, выделение которых является достаточно сложным и многостадийным процессом.

Наиболее близким является способ получения иммобилизованной инвертазы для гидролиза сахарозы [Пат. RU № 2158761, С 12 N 11/10, 10.11.2000]. Препарат инвертазы получают в виде изолированных стенок клеток дрожжей, которые затем иммобилизуют на поверхности или в массе твердого, или гелеобразного носителя.

Недостатком способа является относительно низкая удельная активность биокатализатора, составляющая 0,024-0,15 ЕА/ мг сухих мембран (12-98 ЕА/г биокатализатора), а также значительная потеря инвертазной активности при иммобилизаци. Так, активность иммобилизованных мембран составляет лишь 0,2-2,0% активности мембран в суспензии. Приготовленные данным способом биокатализаторы обладают относительно низкой стабильностью: время полуинактивации t_1/2 составляет 6-45 суток.

Технический результат предлагаемой группы изобретений - увеличение биокаталитической активности и стабильности биокатализатора в процессе инверсии сахарозы, а также упрощение способа приготовления биокатализатора.

Технический результат достигается тем, что предлагаемый катализатор для инверсии сахарозы включает твердый носитель и иммобилизованные дрожжевые мембраны, при этом твердым носителем является гранулированный углеродсодержащий носитель, приготовленный на основе природных илистых отложений - сапропелей и имеющий макропористую структуру со средним диаметром пор 1-2 мкм, объемом пор 1.0-1.6 см³/г и удельной поверхностью не менее 80 м²/г, а дрожжевые мембраны имеют инвертазную активность не менее 15 ЕА/мг.

Твердый носитель для приготовления биокатализатора для инверсии сахарозы является гранулированным углеродным носителем, приготовленным на основе природных илистых озерных отложений - сапропелей и имеющий макропористую структуру со средним диаметром пор 1-2 мкм, объемом пор 1.0-1.6 см³/г и удельной поверхностью не менее 80 м²/г.

Способ приготовления биокатализатора для инверсии сахарозы заключается в том, что дрожжевые мембраны с инвертазной активностью не менее 15 ЕА/мг сухих мембран иммобилизуют на поверхности твердого гранулированного углеродсодержащего носителя, приготовленного на основе природных илистых отложений - сапропелей, имеющего макропористую структуру со средним диаметром пор 1-2 мкм, объемом пор 1.0-1.6 см³/г и удельной поверхностью не менее 80 м²/г путем адсорбции.

Инверсию сахарозы осуществляют в реакторе с неподвижным слоем биокатализатора, который включает твердый носитель и иммобилизованные дрожжевые мембраны, при этом твердым носителем является гранулированный углеродсодержащий носитель, приготовленный на основе природных илистых отложений - сапропелей и имеющий макропористую структуру со средним диаметром пор 1-2 мкм, объемом пор 1.0-1.6 см³/г и удельной поверхностью не менее 80 м²/г, а дрожжевые мембраны имеют инвертазную активность не менее 15 ЕА/мг.

Сущность изобретения заключается в том, что процесс инверсии сахарозы осуществляют в непрерывном режиме при помощи биокатализатора, приготовленного на основе изолированных стенок пекарских дрожжей (дрожжевых мембран), иммобилизованных на твердом гранулированном углеродсодержащем носителе, который имеет макропористую структуру с величиной удельной поверхности не менее 80 м²/г; объемом пор не менее 1 см³/г с размером не менее 0,5 мкм. Для иммобилизации используют дрожжевые мембраны, активность которых составляет не менее 15 ЕА/мг сухих мембран. Эти высокоактивные дрожжевые мембраны получают при автолизе биомассы, полученной из прессованных или сухих пекарских дрожжей, при этом не рекомендуется использовать для автолиза замороженные пекарские дрожжи или дрожжи с просроченной датой их выпуска.

Для иммобилизации дрожжевых мембран используют твердый гранулированный углеродсодержащий носитель, приготовленный на основе природного возобновляемого сырья - илистых отложений пресных озер (сапропелей). Данный твердый носитель получают путем высокотемпературной карбонизации углеродного сырья с последующей активацией паровоздушной смесью. Удельная поверхность носителя составляет не менее 80 м²/г, причем в специально подобранных условиях формируют макропористую структуру, соответствующую по размеру иммобилизуемому компоненту. Так, дрожжевые мембраны имеют размер ˜1 мкм, поэтому для таких больших биологических объектов оптимальными являются макропористые носители. Следует заметить, что запасы сапропелей, разведанные только в Омской области (157 месторождений), оцениваются в 186 млн. тонн, причем налажена промышленная добыча этого дешевого и возобновляемого сырья, которое уже сейчас используется как в производстве строительных тепло- и звукоизоляционных материалов, так и в сельском хозяйстве (кормопроизводстве и в виде удобрений). Носители на основе сапропелей для иммобилизации ферментов и клеточных мембран не изучены.

Иммобилизация дрожжевых мембран заключается в проведении процесса продолжительной адсорбции на поверхности носителя, например, путем погружения носителя в буферный раствор фермента и выдерживания его там в течение не менее 20 ч при периодическом перемешивании или путем очень медленной циркуляции суспензии дрожжевых мембран через неподвижный слой носителя также в течение не менее 20 ч для завершения процесса адсорбции дрожжевых мембран в порах носителя. Следует отметить, что адсорбционная иммобилизация на твердом носителе - наиболее простой способ получения биокатализаторов, поэтому проблема поиска эффективного адсорбента до сих пор не теряет актуальности. При адсорбции биокаталитическая активность, как правило, сохраняется на высоком уровне, поскольку в данном способе отсутствуют токсические сшивающие реагенты, оказывающие дезактивирующее действие на ферментативную активность.

Процесс ферментативной инверсии проводят в реакторе с неподвижным слоем описанного выше биокатализатора при температуре не выше 55°С.

Сущность изобретения иллюстрируется следующим примером.

Пример 1. Инверсия сахарозы в присутствии биокатализатора, приготовленного путем адсорбции дрожжевых мембран на твердом гранулированном углеродсодержащем носителе.

Способ получения носителя. Для получения твердого гранулированного углеродсодержащего носителя используют илистый сапропель озера. Б. Артев Омской обл. Сначала готовят гранулы носителей размером 2-3 мм экструзией через фильеру пластичной массы, содержащей сапропель. Полученные гранулы высушивают до постоянного веса при 105°С. Затем проводят карбонизацию и газификацию высушенных гранул в атмосфере инертного газа (аргона) при температуре 600°С в течение 1 ч во вращающемся реакторе объемом 0,5 л. Активацию полученных гранул осуществляют в среде водяного пара при температуре 800°С. Удельная поверхность твердого гранулированного углеродсодержащего носителя S_уд составляет 80 м²/г. Носитель имеет макропористую структуру: объем пор V_Σ=1,6 см³/г, средний диаметр пор равен 2 мкм.

Способ получения дрожжевых мембран. Используют дрожжевые мембраны, полученные аналогично описанному в прототипе [RU №2158761, C 12 N 11/10, 10.11.2000], только для получения дрожжевых мембран, обладающих высокой инвертазной активностью, используют незамороженные прессованные пекарские дрожжи, а также сухие хлебопекарные дрожжи. Замороженные прессованные дрожжи использовать не рекомендуется, поскольку при замораживании-оттаивании теряется значительная часть инвертазной активности. Не рекомендуется также использовать дрожжи, срок годности которых истек. Удельная инвертазная активность составляет 16 ЕА на 1 г сухих мембран, что в 1,6-2,4 раза выше, чем в прототипе.

Способ приготовления биокатализатора. Иммобилизацию дрожжевых мембран проводят путем адсорбции на твердом носителе в следующих условиях при температуре 20°С в течение 22 ч в среде 0,05 М ацетатного буфера, рН 4,6. Полученный биокатализатор промывают буферным раствором и используют в реакции инверсии сахарозы. При иммобилизации инвертазная активность дрожжевых мембран сохраняется полностью - 100% (для сравнения: в прототипе - 0,2-2%).

Свойства полученного биокатализатора следующие:

1) величина адсорбции составляет 7 мг сухих мембран /г носителя;

2) удельная ферментативная активность составляет 122 ЕА/г биокатализатора;

3) стабильность: время полуинактивации t_1/2 составляет более 60 суток, что в 1,5-10 раз выше чем в прототипе.

Способ инверсии сахарозы. Инверсию сахарного сиропа осуществляют при 50°С в реакторе с неподвижным слоем биокатализатора, через который со скоростью 30 мл/мин прокачивают сахарный сироп. Степень превращения 5%-ного и 20%-ного субстрата составляет 60% и 10% за 1 ч соответственно.

Пример 2. Инверсия сахарозы при помощи биокатализатора, приготовленного путем адсорбции дрожжевых мембран на твердом гранулированном углеродсодержащем носителе с макропористой структурой.

Носитель готовят аналогично примеру 1, только предварительно пластичную массу, содержащую сапропель, просушивают при 200°С, а температура карбонизации составляет 700°С. Удельная поверхность твердого гранулированного углеродного носителя составляет 121 м²/г. Носитель имеет макропористую структуру: средний диаметр пор равен 4,7 мкм и объем пор V_Σ=1,8 см³/г.

Биокатализатор для инверсии сахарозы готовят адсорбцией дрожжевых мембран с инвертазной активностью 15 ЕА/г на твердом гранулированном носителе аналогично примеру 1.

Свойства полученного биокатализатора следующие:

1) величина адсорбции составляет 9 мг сухих мембран /г носителя;

2) удельная инвертазная активность составляет 135 ЕА/г биокатализатора, что в 1,4 раз выше, чем в прототипе.

3) стабильность: время полуинактивации t_1/2 составляет более 60 суток, что в 1,5-10 раз выше, чем в прототипе.

Инверсию сахарного сиропа осуществляют при 50°С в реакторе с неподвижным слоем биокатализатора, через который со скоростью 30 мл/мин прокачивают сахарный сироп. Степень превращения 20%-ного раствора сахарозы составляет 40% за 3 ч.

Пример 3. Инверсия сахарозы при помощи биокатализатора, приготовленного путем адсорбции дрожжевых мембран на твердом гранулированном углеродсодержащем носителе с макропористой структурой.

Носитель готовят аналогично примеру 1, только предварительно сапропель промораживают в течение 1-2 суток, затем готовят пластичную массу, при этом температура карбонизации составляет 800°С. Удельная поверхность твердого гранулированного углеродного носителя составляет 276 м²/г. Носитель имеет макропористую структуру: средний диаметр пор - 1 мкм и объем пор V_Σ=0,7 см³/г.

Биокатализатор для инверсии сахарозы готовят адсорбцией дрожжевых мембран с инвертазной активностью 17 ЕА/г носителе аналогично примеру 1.

Свойства полученного биокатализатора следующие:

1) величина адсорбции составляет 6 мг сухих мембран /г носителя;

2) удельная инвертазная активность составляет 102 ЕА/г биокатализатора;

3) стабильность: время полуинактивации t_1/2 составляет более 60 суток, что в 1,5-10 раз выше, чем в прототипе.

Инверсию сахарного сиропа осуществляют при 50°С в реакторе с неподвижным слоем биокатализатора, через который со скоростью 30 мл/мин прокачивают сахарный сироп. Степень превращения 20%-ного раствора сахарозы составляет 40% за 4,5 ч.

Как видно из приведенных примеров, предлагаемое изобретение позволяет существенно (в несколько раз) увеличить активность и стабильность полученных биокатализаторов инверсии сахарозы, а также упростить способ приготовления этих биокатализаторов. Предлагаемые биокатализаторы и технология, разработанная на их основе, являются несомненно конкурентоспособными по сравнению с существующими способами кислотного гидролиза сахарозы.

1. Биокатализатор для инверсии сахарозы, включающий твердый носитель и иммобилизованные дрожжевые мембраны, отличающийся тем, что твердым носителем является гранулированный углеродсодержащий носитель, приготовленный на основе природных илистых озерных отложений - сапропелей - и имеющий макропористую структуру со средним диаметром пор 1-2 мкм, объемом пор 1,0-1,6 см³/г и удельной поверхностью не менее 80 м²/г, а дрожжевые мембраны имеют инвертазную активность не менее 15 ЕА/мг.

2. Твердый носитель для приготовления биокатализатора для инверсии сахарозы, отличающийся тем, что он является гранулированным углеродным носителем, приготовленным на основе природных илистых озерных отложений - сапропелей - и имеющим макропористую структуру со средним диаметром пор 1-2 мкм, объемом пор 1,0-1,6 см³/г и удельной поверхностью не менее 80 м²/г.

3. Способ приготовления биокатализатора для инверсии сахарозы иммобилизацией дрожжевых мембран на поверхности твердого углеродсодержащего носителя, отличающийся тем, что дрожжевые мембраны с инвертазной активностью не менее 15 ЕА/мг сухих мембран иммобилизуют на поверхности твердого гранулированного углеродсодержащего носителя, приготовленного на основе природных илистых озерных отложений - сапропелей - и имеющего макропористую структуру со средним диаметром пор 1-2 мкм, объемом пор 1,0-1,6 см³/г и удельной поверхностью не менее 80 м²/г, путем адсорбции.

4. Способ инверсии сахарозы в реакторе с неподвижным слоем биокатализатора, включающего твердый углеродсодержащий носитель, на поверхности которого иммобилизованы дрожжевые мембраны, отличающийся тем, что используют биокатализатор по п.1.