Способ лечения дефектов роговицы

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается лечения дефектов роговицы различной этиологии. Для этого субконъюнктивально вводят культивированные эмбриональные нейральные стволовые клетки в дозе 300 тыс. в 0,3 мл физиологического раствора. Такое выполнение способа позволяет достичь восстановления дефекта стромы и эпителия роговицы с формированием ткани, максимально приближенной по структуре к нормальной ткани роговицы, за счет регенераторных свойств эмбриональных стволовых клеток.

 

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения дефектов роговицы.

Лечение пациентов с дефектами роговицы, в том числе послеожоговыми, остается актуальной проблемой в офтальмотравматологии. Большинство используемых на сегодняшний день методов консервативного лечения такой патологии роговицы, к сожалению, не оказывает положительного эффекта и не приводит к желаемым результатам. Неблагоприятные исходы выражаются в развитии изъязвления, перфорации, формировании грубых рубцов и помутнении роговицы.

Известно использование аллоплантов для закрытия дефектов роговицы (Мулдашев Э.Р. Аллопланты в офтальмохирургии. // Уфа, 1987 г., стр.80), собственной конъюнктивы пациента (Гундорова Р.А. с соавт. Аутоконъюнктивальная пластика роговицы - операция выбора для герметизации неинфекционных дефектов роговицы. // Тезисы научно-практической конференции "Теоретические и клинические исследования как основа медикаментозного и хирургического лечения травм органа зрения". М., 2000 г., стр.45-47), а также кадаверной роговицы (Killingsworth D.W. et al. Results of therapeutic penetrating keratoplasty. // Ophthalmology, 1993 Apr., 100(4) p.534-541). Однако нередки случаи отторжения и некроза трансплантата вследствие глубокого нарушения микроциркуляции собственной поврежденной ткани, развития механизмов иммунологического конфликта в организме реципиента с донорской тканью (Тазетдинова Н.Р. Клинико-иммунологическое обоснование патогенетически ориентированного медикаментозного и хирургического лечения ожоговой болезни глаз. // Дисс. канд. мед. наук. M., 1989 г., стр.26; Легеза Г.В. с соавт. Ошибки в тактике лечения тяжелых ожогов глаз на ранних стадиях и их причины. // Ожоги глаз и их последствия. Материалы научно-практической конференции. Москва, 1997 г., стр.23-24). Использование кадаверной роговицы осложнено труднодоступностью материала, необходимостью проведения дополнительных обследований трупа на наличие различных инфекций. Имеются сообщения о трансплантации амниотической мембраны при изъязвлениях роговицы ожогового генеза (Kim J.C., Tseng S.C. Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbit corneas. // Cornea, 1995 Sep., 14(5): p.473-84). Терапевтический эффект этого метода, по мнению авторов, связан с действием ингибиторов протеаз, а также факторов роста и цитокинов.

Ближайшим аналогом того же назначения является способ, основанный на использовании культивированных аллогенных фибробластов и эпителиальных клеток, включенных в трехмерный коллагеновый гель и нанесенных на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы (патент RU 2173122, 10.09.2001). В качестве источника первичной культуры фибробластов использована ткань кожи человека. При этом для достижения терапевтического эффекта требовалось предварительное проведение некрэктомии поврежденной роговицы с целью формирования глубокого ложа для трансплантата, что само по себе является достаточно деликатной, с хирургической точки зрения, процедурой, требующей определенных хирургических навыков. Для фиксации трансплантата использовались мягкие контактные линзы большого диаметра. После имплантации осуществлялась некровавая блефарорафия, обеспечивающая защиту трансплантата от механического повреждения век. Таким образом сама процедура представляется достаточно трудоемким процессом, а эффективность ее зависит от целой совокупности соблюдения всех вышеуказанных условий. При этом пересадка эпителиальной ткани стимулирует регенерацию собственного эпителия выделяемыми клетками во внешнюю среду биологически активными веществами. Заживление дефекта, по мнению авторов, происходит исключительно за счет миграции собственного эпителия на дефект.

В настоящее время трансплантология превратилась в одно из самых приоритетных направлений в медицине. Тесная связь с молекулярной и клеточной биологией быстро привела к развитию новых технологий выращивания соматических и стволовых клеток человека, генной модификации и имплантации генов из выращенных in vitro линий клеток в организм животных и человека. Стала развиваться новая область микрохирургии - трансплантация соматических и стволовых клеток.

Все специализированные клетки взрослого организма происходят из стволовых клеток. Все нормальные органы и ткани человека сохраняют "реликты" зародышевой ткани в виде микровкраплений стволовых клеток. Стволовые летки - это орган экстренной репарации в случае аварийных, массивных повреждений ткани (травмы, вирусы, химические, тепловые повреждения) (Репин B.C. с соавт. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина. 2002 г., стр.11). Большинство органов человека и млекопитающих используют стволовые клетки для постоянного тщательно контролируемого самообновления дифференцированных клеток, выполняющих важнейшие функции (Сухих Г.Т. Трансплантация фетальных клеток в медицине: настоящее и будущее. // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. 1998 г., стр.3-13).

В настоящее время во многих странах мира создаются специальные генно-модифицированные линии гепатоцитов, миоцитов, стромальных клеток, миофибробластов, нейронов и глии с целью пересадок и заместительной клеточной терапии. Эти клетки обладают высокой инвазивностью, пролиферативной активностью для создания аллогенных ростков здоровой ткани в организме реципиента и не опасны в плане канцерогенеза. Проводится интенсивное изучение генов, сигнальных молекул и ростовых факторов, контролирующих активное размножение и выживание донорских клеток в разных тканях реципиента. Идея трансплантации стволовых клеток основана на том, что они способны заместить утраченные клеточные клоны в организме больного либо секретировать биологически активные вещества, которые помогают скоррегировать нарушенные заболеванием функции.

Поэтому адекватным дополнением к традиционным методам стимуляции восстановительных процессов при серьезных нарушениях репаративной регенерации роговицы может стать трансплантация стволовых клеток.

Существующие в литературе данные свидетельствуют об успешном применении стволовых клеток в различных областях медицины - кардиохирургии, гастроэнтерологии, нейрохирургии, гематологии и др. (Рунович А.А. с соавт. Лечение ишемической болезни сердца методом трансплантации фетальных тканей. // Актуальные вопросы реконструктивной и восстановительной хирургии. Сборник итогов научных работ. Иркутск, 1999 г., стр.302-303; Кулаков В.И. с соавт. Возможность коррекции синдрома овариэктомии методом трансплантации фетальных тканей человека. // Бюл. экспериментальной медицины и биологии. 1995 г., 120, №10, стр.430-433).

В офтальмологии успешное применение стволовых клеток описано при лазерном повреждении сетчатки (Пак Н.В. с соавт. Трансплантация нейрональных стволовых клеток при патологии сетчатки. // Неотложная помощь, реабилитация и лечение осложнений при травмах органа зрения и чрезвычайных ситуациях. Научно-практическая конференция. Москва, апрель 2003 г., стр.144-145).

Полученные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют об уникальных свойствах стволовых клеток - высокой пролиферативной активности и способности дифференцироваться в специализированные клетки под влиянием окружающих тканей.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа лечения различных дефектов роговицы.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является восстановление дефекта стромы и эпителия роговицы с формированием ткани, наиболее приближенной к нормальной ткани роговицы по структуре.

Технический результат достигается за счет сочетанного воздействия трансплантированных нейральных стволовых клеток на процесс регенерации роговицы: 1) путем выделения различных факторов роста и ключевых метаболитов (цитокинов, антиоксидантов, тканевых гормонов, пептидов); 2) вследствие миграции стволовых клеток и встраивания их в зону поражения; 3) за счет прямой стимуляции собственных лимбальных стволовых клеток пораженного глаза, ответственных за постоянную поставку или восполнение роговичных клеток и "задавленных" вследствие массивного поражения.

Последний фактор особенно важен, т.к. последние несколько лет в зарубежной литературе все чаще появляются данные о превалирующей роли частичной и полной лимбальной клеточной недостаточности (ЛКН) в патогенезе длительно незаживающих дегенераций роговицы (Julie Т. Daniels et al. Corneal stem cells in review. // Wound Repair and Regeneration, Nov. - Des. 2001, p.483-494). Именно клетки лимбальной зоны ответственны за постоянное восполнение дефицита роговичных клеток. Клинические проявления ЛКН сводятся к аномальной конъюнктивально-корнеальной регенерации с периферической неоваскуляризацией, наличием хронического дефекта эпителия, выраженного стромального воспаления и конъюнктивизации роговицы, которая выражается в появлении бокаловидных клеток в цитологических отпечатках с роговицы. В таких случаях прогноз успешности традиционных методов лечения минимален.

В доступной нам литературе мы не нашли достаточного освещения вопроса трансплантации культивированных in vitro нейральных стволовых клеток при дефектах роговицы.

Источником донорского материала является ткань мозга эмбрионов человека 1-го триместра гестации (8-12 недель). Абортивный материал получают из лицензированных учреждений МЗ РФ, действующих в рамках законодательства РФ об охране здоровья граждан и в соответствии с утвержденным перечнем медицинских показаний (Приказ министра здравоохранения №302 от 28.12.93 "Об утверждении перечня медицинских показаний для искусственного прерывания беременности" и Приложения к этому приказу №3 от 05.04.94). Культивирование осуществляют в бессывороточной среде, состоящей из DMEM (50%), F12 (50%), основного фактора роста фибробластов (hFGF-b), эпидермального ростового фактора (hEGF) и фактора выживаемости нейральных клеток (N2-supplement) (C.N.Svendsen, M.G. ter Borg, R.J.E.Armstrong, A.E.Rosser, S.Chandran, T.Ostenfefeld, M.A.Candwell - A new method for rapid and long-term growth of human neural precursor cells. // J. Neirosci. Methods. 85 (1998) 141-152).

Непосредственно перед трансплантацией суспензию клеток тщательно отмывают от культуральной среды, подсчитывают количество жизнеспособных клеток с помощью йодида пропидия и трипанового синего и суспензируют в физиологическом растворе.

Способ осуществляют следующим образом. Стволовые клетки трансплантируют путем субконъюнктивальной инъекции суспензии нейральных стволовых клеток с концентрацией 300 тыс. клеток в 0,3 мл физиологического раствора. Доза вводимых стволовых клеток отработана экспериментально. В качестве местной анестезии использовался 0,25% раствор дикаина.

Конкретные примеры выполнения способа:

Пример №1. Кролик №1. Модель тяжелого щелочного ожога роговицы обоих глаз создана по стандартной методике (10% NaOH, d=7,0 мм, 40 с). На 2-е сутки после ожога в правый опытный глаз производилась субконъюнктивальная инъекция суспензии нейральных стволовых клеток, в левый контрольный - 0,3 мл физиологического раствора. С целью профилактики развития вторичной инфекции на обоих глазах проводилась местная противоинфекционная терапия в виде инсталляций антибиотиков (0,25% раствор левомицетина 3 раза в день). Клиническую оценку состояния глаз проводили на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е, 22-е и 30-е сутки после трансплантации по следующим признакам: степени выраженности воспалительной реакции, диаметру дефекта эпителия, площади и глубине стромального дефекта роговицы, степени неоваскуляризации роговицы, интенсивности помутнения роговицы.

Анализ течения ожогового процесса показал, что на 7-е сутки после проведения трансплантации в опытном глазу наблюдалась тенденция к уменьшению диаметра эпителиального дефекта, площади и глубины стромального дефекта роговицы. Контрольная группа к началу 2-ой недели характеризовалась глубоким дефектом роговицы в виде десцеметоцеле с тенденцией к перфорации, гипопионом, более интенсивной неоваскуляризацией роговицы и ее помутнением, с последующим образованием неоваскуляризованного бельма. В опытной группе к 30-му дню отмечена полная эпителизация роговичного дефекта с восстановлением стромальной структуры, тогда как в контроле сохранялся дефект стромы.

Пример №2. Больная М. 5 дней назад перенесла химический щелочной ожог роговицы левого глаза 3 степени. Проведенное по месту жительства консервативное лечение оказалось неэффективным. При поступлении роговица матовая, отечная, с глубоким дефектом в центральной зоне диаметром до 4 мм. Отмечалась выраженная гиперемия и отек конъюнктивы. Была произведена трансплантация нейральных стволовых клеток по предложенной методике. На 4-е сутки после трансплантации отмечалось уменьшение диаметра роговичного дефекта до 2 мм. К 10-м суткам лечения наблюдалось полное закрытие дефекта стромы и полная эпителизация роговицы.

Всего предлагаемым способом оперировано 20 кроликов и 3 больных с тяжелыми ожогами роговицы. Во всех случаях отмечено достижение полноценного восстановления дефекта стромы и эпителия роговицы с формированием ткани, наиболее приближенной к нормальной роговице по структуре, что подтверждается проведенными гистологическими исследованиями.

Основным преимуществом предлагаемого способа является высокая эффективность, техническая простота исполнения, атравматичность, возможность постоянно располагать запасом донорского материала, отсутствие риска развития отторжения трансплантата, формирование помутнения роговицы меньшей интенсивности, чем при использовании других способов лечения, сочетанное воздействие трансплантированных клеток на процесс регенерации роговицы: 1) путем выделения различных факторов роста и ключевых метаболитов (цитокинов, антиоксидантов, тканевых гормонов, пептидов); 2) вследствие миграции стволовых клеток и встраивания их в зону поражения; 3) за счет прямой стимуляции собственных лимбальных стволовых клеток.

Таким образом, предложенный способ лечения дефектов роговицы культивированными нейральными стволовыми клетками позволяет получить восстановление дефекта стромы и эпителия роговицы с формированием ткани, наиболее приближенной к нормальной ткани роговицы по структуре.

Способ лечения дефектов роговицы, включающий использование суспензии аллогенных изолированных клеток, отличающийся тем, что в качестве аллогенных изолированных клеток используют культивированных эмбриональные нейральные стволовые клетки в дозе 300 тыс. в 0,3 мл физиологического раствора, которые вводят субконъюнктивально однократно.