Способ получения водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты (варианты)

Изобретение относится к способам получения водорастворимых солевых комплексов (ассоциатов) гиалуроновой кислоты с d-металлами IV, V и VI периодов Периодической системы элементов Д.И.Менделеева, которые могут быть использованы в фармакологии и косметологии. Описан способ получения водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты, включающий получение водного раствора соли d-металла IV, V и VI периодов Периодической системы и его смешивание с натриевой солью гиалуроновой кислоты, выдерживание смеси, ее перемешивание, разбавление водой и выделение конечного продукта, причем для смешивания используют количество водного раствора соли вышеуказанного d-металла, эквивалентное количеству карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты или лежащее в пределах от 0,95 до 1,10, после разбавления водой смесь раствора подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с одновременной промывкой вначале водным раствором соли вышеуказанного d-металла, а после деионизированной водой, затем продукт концентрируют. В другом случае для смешивания используют количество водного раствора соли d-металла, меньшее эквивалентного количества карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты, после разбавления водой смесь раствора подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с одновременной промывкой деионизированной водой, после чего продукт также концентрируют. Способ отличается небольшим временем протекания процессов и простотой. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретения относятся к области биохимии, а именно к способам получения водорастворимых солевых комплексов (ассоциатов) гиалуроновой кислоты с d-металлами IV, V и VI периодов Периодической системы элементов Д.И.Менделеева, которые могут быть использованы в фармакологии и косметологии.

Гиалуроновая кислота является природно встречающимся полианионным линейным полисахаридом, входящим в состав внеклеточного основного вещества соединительной ткани позвоночных животных в виде соли и состоит из чередующихся остатков D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина. Аминосахар в молекуле соединен с D-глюкуроновой кислотой β-(1→4)-связью, а кислота с аминосахаром β-(1→3)-связью. Гиалуроновая кислота образует соли, называемые гиалуронатами, с различными неорганическими и органическими катионами, соединяется с различными белками. Растворы гиалуронатов обладают высокой вязкостью. Молекулярная масса выделенного из животной ткани гиалуроната обычно находится в пределах от 10⁵ до 10⁷ дальтон в зависимости от вида сырья, способов получения и очистки. Кислота обладает исключительно высоким гидродинамическим объемом, например одна молекула кислоты способна удерживать 200-500 молекул воды. В организме человека и животных гиалуроновая кислота существует в виде ее натриевой соли - гиалуроната натрия. Эмпирическая формула [(C₁₄H₂₀NO₁₁)Na]_n, где n=250-25000.

В тканях организма гиалуроновая кислота принимает участие в сложных, в том числе недостаточно изученных, физиологических процессах, например в первые сутки нормального заживления неосложненных ран в последних отмечается повышенная концентрация гиалуроновой кислоты [Goa K.I., Benfield P. Hyaluronic acid. A review of its pharmacology and use as a surgical aid in ophthalmology and its therapeutic potential in joint disease and wound healing // Drugs. - 1994. - V.47, №3, - p.536-566].

Известен способ получения композиции, содержащей кобальтовый комплекс гиалуроновой кислоты, согласно которому к раствору гиалуроната натрия добавляют раствор соответствующей соли, выдерживают при перемешивании и осаждают 3 объемными частями этанола [Описание изобретения к патенту США №5472950, Н Кл. 514/54, опубл. 05.12.1995].

Данный способ не может обеспечить после первичного осаждения этанолом удовлетворительную чистоту продукта - вместе с гиалуронатом всегда соосаждается избыток солей, содержащийся в растворе. Таким образом данным способом затруднительно получить однокомпонентные (или содержащие допустимое количество примесей) солевые комплексы гиалуроната.

Известен способ лечения трофических язв и пролежней цинковым комплексом гиалуроновой кислоты. Для этого получают комплекс гиалуроната с катионом четвертичного аммония в виде осадка, очищают его, растворяют в водном растворе цинковой соли и растворителя, частично смешивающегося с водой. Затем фазы разделяют, осаждают соответствующий ассоциат алканолом, осадок отделяют и промывают [Описание изобретения к патенту США №5554598, Н Кл. 514/54, опубл. 09.10.1996].

Данный способ отличается сложностью дальнейшей очистки продукта от избытка солей четвертичного аммония, катионов цинка и соответствующих анионов. При растворении ассоциатов, которые были получены способом осаждения четвертичными аммонийными солями, образуются опалесцирующие растворы, что ухудшает качество продукта и в итоге не позволяет получить полные соли гиалуроната.

Известен способ получения биологически активной композиции, при котором ассоциаты гиалуроновой кислоты с ионами Со²⁺ или Zn²⁺ в фармацевтически эффективном количестве смешивают с целевыми добавками [Описание изобретения к патенту РФ №2021304, МПК С 08 L 5/08, А 61 К 31/728, А 61 Р 17/02, опубл. 15.10.1994, Бюл. №19]. В изобретении описаны две типовые технологические схемы получения кобальтовых или цинковых ассоциатов гиалуроновой кислоты.

По одной схеме ассоциат, образованный из гиалуроната кислоты и соли четвертичного аммония в водной суспензии растворяют в смеси растворителей, содержащих водные растворы иона Со²⁺ или Zn²⁺ с н-бутанолом, после чего ассоциат осаждают с применением алканола или алканона, выделяют осадок из раствора и высушивают конечный продукт.

Данная схема отличается сложностью и требует использования большого количества химических ингредиентов, кроме этого она не позволяет получать полные соли гиалуроновой кислоты.

Наиболее близкой по совокупности существенных признаков первому заявляемому изобретению группы является другая, описанная в патенте РФ №2021304 схема получения водорастворимых ассоциатов, которая включает приготовление водного раствора соли металла (хлорида цинка или хлорида кобальта) и его смешивание с натриевой солью гиалуроновой кислоты, выдерживание смеси, ее механическое перемешивание, разбавление водой и последующую фильтрацию для выделения конечного продукта.

Полученный при использовании данной схемы конечный продукт отличается недостаточно стабильным качеством. Например, в отфильтрованном продукте будут встречаться низкомолекулярные фрагменты гиалуроновой кислоты, не вступившие в реакцию хлорид цинка или хлорид кобальта, хлорид натрия, натриевая соль гиалуроновой кислоты. В этом случае может потребоваться дополнительная очистка. Можно предположить, что получение декларируемого в изобретении технического результата возможно при строгом соблюдении количественных соотношений ингредиентов и последовательности технологических стадий, высокой чистоте химических реактивов, а также исходного гиалуроната натрия.

Задача, решаемая первым изобретением группы, заключается в разработке очередного способа получения высокочистых водорастворимых солевых комплексов гиалуроната с катионами металлов, преимущественно d-металлов IV, V и VI периодов Периодической системы элементов Д.И.Менделеева, для медицинских и косметологических целей, который отличается относительной простотой и небольшим временем протекания процесса.

Техническим результатом будет разработка достаточно простого способа получения высокочистых однокомпонентных водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты, содержащих катионы d-металла, для медицинских и косметологических целей, включающие минимальное количество примесей добавляемых солей металлов и контролируемое количество выделившейся в процессе реакции соли натрия, которые отличаются небольшим временем протекания процессов и малыми затратами.

Для решения поставленной задачи в способе получения водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты, включающем получение водного раствора соли d-металла IV, V и VI периодов Периодической системы и его смешивание с натриевой солью гиалуроновой кислоты, выдерживание смеси, ее перемешивание, разбавление водой и выделение конечного продукта, для смешивания используют количество водного раствора соли вышеуказанного d-металла, эквивалентное количеству карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты или лежащее в пределах от 0,95% до 1,10% от эквивалентного, после разбавления водой смесь раствора подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с одновременной промывкой вначале водным раствором соли вышеуказанного d-металла, а потом деионизированной водой, после чего продукт концентрируют.

Кроме этого:

- после концентрирования продукт подвергают спиртоосаждению или лиофильной сушке;

- после концентрирования продукт подвергают стерильной фильтрации;

- после стерильной фильтрации продукт подвергают спиртоосаждению или лиофильной сушке.

Наиболее близкой по совокупности существенных признаков второму заявляемому изобретению группы также является описанная в патенте РФ №2021304 схема получения водорастворимых ассоциатов, которая включает приготовление водного раствора соли металла (хлорида цинка или хлорида кобальта) и его смешивание с натриевой солью гиалуроновой кислоты, выдерживание смеси, ее механическое перемешивание, разбавление водой и последующую фильтрацию для выделения конечного продукта.

Как упоминалось выше, полученный при использовании данной схемы конечный продукт отличается недостаточно стабильным качеством. В отфильтрованном продукте встречаются низкомолекулярные фрагменты гиалуроновой кислоты, не вступившие в реакцию хлорид цинка или хлорид кобальта, хлорид натрия, натриевая соль гиалуроновой кислоты. В качестве примесей могут оставаться соли металлов или четвертичные аммонийные соли. Наличие большого количества составляющих в конечном продукте не позволяет говорить о прогнозируемом фармакологическом и косметологическом действиях полученного многокомпонентного препарата на организм человека.

Задача, решаемая вторым изобретением группы, заключается в разработке очередного способа получения высокочистых водорастворимых солевых комплексов гиалуроната с катионами металлов, преимущественно d-металлов IV, V и VI периодов Периодической системы элементов Д.И.Менделеева, для медицинских и косметологических целей, который отличается относительной простотой и небольшим временем протекания процесса.

Техническим результатом будет разработка достаточно простого способа получения высокочистых, как правило двухкомпонентных водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты, содержащих катионы какого-либо d-металла и катионы натрия, для медицинских и косметологических целей, включающие минимальное количество примесей добавляемых солей металлов и контролируемое количество выделившейся в процессе реакции соли натрия, которые отличаются небольшим временем протекания процессов и малыми затратами.

Для решения поставленной задачи в способе получения водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты, включающем получение водного раствора соли d-металла IV, V и VI периодов Периодической системы и его смешивание с натриевой солью гиалуроновой кислоты, выдерживание смеси, ее перемешивание, разбавление водой и выделение конечного продукта, для смешивания используют количество водного раствора соли вышеуказанного d-металла, меньшее эквивалентного количества карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты, после разбавления водой смесь раствора подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с одновременной промывкой деионизированной водой, после чего продукт концентрируют.

Кроме этого:

- после концентрирования продукт подвергают спиртоосаждению или лиофильной сушке;

- после концентрирования продукт подвергают стерильной фильтрации;

- после стерильной фильтрации продукт подвергают спиртоосаждению или лиофильной сушке.

Часть информации о действии, оказываемом на организм человека некоторыми d-металлами IV, V и VI периодов Периодической системы элементов в составе различных солей и комплексов, в том числе в составе солевых комплексов гиалуроновой кислоты, можно свести в таблицу «Биологическое действие d-металлов на организм» (см. табл.)

Суть изобретений группы заключается в том, что высокочистые однокомпонентные или многокомпонентные солевые комплексы d-металлов гиалуроновой кислоты для медицинских и косметологических целей, содержащие минимальное количество примесей, получаются достаточно простыми способами в течение небольших промежутков времени и с малыми затратами. Здесь и далее под термином «высокочистые однокомпонентные солевые комплексы» следует понимать практически чистые однокомпонентные солевые комплексы гиалуроновой кислоты, где процент замещения карбоксильных групп каким-либо d-металлом находится в пределах от 95% до 98% (или выше, если это оправдано экономически). У оставшихся карбоксильных групп остаются незамещенные катионы натрия, что никоим образом не влияет на качество получаемой соли гиалуроновой кислоты и ее физико-химические, фармакологические и косметологические свойства. Под термином «высокочистые многокомпонентные солевые комплексы» следует понимать, как правило, двухкомпонентные солевые комплексы какого-либо d-металла с гиалуронатом натрия, где процент замещения натрия на карбоксильных группах может быть произвольным, например 49% соли d-металла гиалуроновой кислоты и 48% натриевой соли (с поправкой на процессы гидролиза), или 90%+8%, или 8%+90% и т.д. в зависимости от требуемого фармакологического и (или) косметологического эффекта. Теоретически двухкомпонентный, например 95%+3% солевой комплекс гиалуроновой кислоты следует рассматривать как однокомпонентный, поскольку фармакологический и косметологический эффект будут определяться тем компонентом, который составляет 95%. Не исключено, что в некоторых случаях малое количество одного из компонентов солевого комплекса, например катионов серебра в качестве антибактериального агента или катионов платины в качестве противоопухолевого агента, также будет оказывать на живой организм необходимый эффект. Однако в этих случаях все же целесообразнее использовать натриевую соль гиалуроновой кислоты в сочетании со специальными препаратами, зарекомендовавшими себя на определенном фармакологическом и косметологическом эффекте, или исходить из соображений целесообразности. Что касается трехкомпонентных (или более) солевых комплексов d-металлов с гиалуронатом натрия, то их ожидаемые фармакологический и косметологический эффекты трудно поддаются прогнозированию. Как правило, в таком солевом комплексе в большей степени проявляются свойства всего лишь одного из входящих d-металлов.

В общем случае способ получения водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты включает получение водного раствора соли металла, преимущественно одного из d-металлов IV, V и VI периодов Периодической системы элементов Д.И.Менделеева, и его смешивание с натриевой солью гиалуроновой кислоты, выдерживание смеси, ее перемешивание, разбавление водой и выделение конечного продукта. Данные способы основаны на высоких комплексообразующих способностях d-металлов и на смещении химического равновесия в результате вымывания катионов натрия в ходе ультрафильтрации на разделительных мембранах.

Для получения однокомпонентных солевых комплексов гиалуроновой кислоты для смешивания используют количество водного раствора соли металла, эквивалентное количеству карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты или лежащее в пределах от 0,95 до 1,10 от эквивалентного, после разбавления водой смесь раствора подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с одновременной промывкой вначале водным раствором соли получаемого металла, а после деионизированной водой, при этом используют мембраны с определенным диаметром (размером) пор, позволяющим освобождаться от молекул полимеров, с молекулярной массой ниже установленного предела и избытка неорганических солей и задерживать в растворе концентрата молекулы с определенной молекулярной массой, после чего прекращается добавление деионизированной воды в систему, оставшиеся молекулы воды проходят через мембрану, в результате чего уменьшается объем и повышается концентрация раствора готового продукта.

Количество карбоксильных групп гиалуроната натрия может быть вычислено по известной формуле исходя из массы навески гиалуроната натрия. Количество дисахаридных единиц n рассчитывается по формуле

n=m/М,

где m - масса навески гиалуроната натрия;

М - молярная масса дисахаридной единицы гиалуроната натрия (равна 401,22 г/моль).

Количество дисахаридных единиц гиалуроната натрия в навеске и будет равно количеству карбоксильных групп, что дает возможность рассчитать необходимое количество и массу соли d-металла для замещения натрия на карбоксильных группах. Например, в 1,00 грамме гиалуроната натрия будет следующее количество карбоксильных групп:

n=1,00/401,22=0,00249 моль.

В зависимости от валентности d-металла он может присоединить различное количество карбоксильных групп. Например, на две карбоксильные группы в гиалуронате приходится один катион двухвалентного металла, следовательно, необходимо взять 1/2 от 0,00249 моль карбоксильных групп соли двухвалентного d-металла для теоретического 100% замещения натрия на карбоксильных группах. Для одновалентного d-металла необходимо взять 0,00249 моль его соли и т.д. На практике замещение получится в пределах от 95% до 98% карбоксильных групп.

При использовании количества водного раствора соли металла выше эквивалентного количества карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты, например 150% от эквивалентного получается полная соль гиалуроновой кислоты, в которой, например, 97,5% карбоксильных групп заняты катионом d-металла. Избыток солей будет вымыт в процессе ультрафильтрации, однако добавление такого количества соли нецелесообразно, т.к. приводит к перерасходу химических реагентов.

Для получения, например, двухкомпонентных солевых комплексов гиалуроновой кислоты для смешивания используют водный раствор с количеством соли металла меньше эквивалентного количества карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты, после разбавления водой смесь подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с одновременной промывкой деионизированной водой, при этом, как и в предыдущем случае, используют мембраны с определенным диаметром (размером) пор, позволяющим освобождаться от молекул полимеров, с молекулярной массой ниже установленного предела и избытка неорганических солей, и задерживать в растворе концентрата молекулы с определенной молекулярной массой, после чего прекращается добавление деионизированной воды в систему, оставшиеся молекулы воды проходят через мембрану, в результате чего уменьшается объем и повышается концентрация раствора готового продукта.

При использовании количества соли d-металла в водном растворе ниже эквивалентного количества карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты, например 50% от эквивалентного, получается двухкомпонентный солевой комплекс гиалуроновой кислоты, в которой теоретически 50% карбоксильных групп заняты катионом d-металла, а 50% катионом натрия.

В обоих перечисленных случаях концентрированный продукт может быть подвержен стерилизационной фильтрации для удаления возможной патогенной микрофлоры, что требуется для случаев использования полученного раствора в виде готовой к употреблению инъекционной формы. В общем случае получаемые в процессе реализации вышеупомянутых технических решений концентрированные одно- или многокомпонентные солевые комплексы гиалуроновой кислоты приобретают товарный вид после спиртоосаждения или лиофильной сушки. В этом виде продукт герметично упаковывается, стерилизуется (при необходимости) и поступает на реализацию.

Существует особая зависимость между соотношением натриевых катионов и катионов d-металлов IV, V и VI периодов Периодической системы элементов в молекуле гиалуроната. Очевидно, что чем большее количество катионов натрия на карбоксильных группах молекулы гиалуроната замещены на биологически активный металл из d-группы, тем больше биологическая активность молекулы гиалуроната. Получая молекулы гиалуроната с различным содержанием биологически активного металла из d-группы, можно получать различные по биологической активности препараты гиалуроната. Например, однокомпонентные солевые комплексы гиалуроната цинка, а также меди, кобальта, серебра и т.д. обладают более выраженными, востребованными, как в фармакологии, так и в косметологии, бактерицидными свойствами по сравнению с двухкомпонентными комплексами, например, теоретическими 50%+50% (или 80%+20% и др.) от количества карбоксильных групп гиалуроната.

Двухкомпонентные солевые комплексы гиалуроновой кислоты имеют преимущества по сравнению с однокомпонентными солевыми комплексами в случаях, например, когда используемый неорганический катион, например кобальт, проявляет острое токсическое действие на организм. Получая двухкомпонентный солевой комплекс гиалуроновой кислоты, содержащий катионы натрия и минимальное количество, например 5% или 10% от количества карбоксильных групп, катионов токсичного d-металла, например хрома, снижают или нейтрализуют это токсическое воздействие. Например, использование двухкомпонентного солевого комплекса гиалуроновой кислоты, содержащего катионы натрия и, например, 10% от количества карбоксильных групп, катионов цинка, помимо восстановления эластичности кожи способствует формированию косметического рубца в результате, например, различных повреждений кожного покрова, что более предпочтительно по сравнению с применением косметических форм, содержащих преимущественно цинковый компонент.

Особенно важно снижение токсичного эффекта за счет минимального введения d-металла, когда препараты используют, например, как инъекционные. Так, например, можно предположить, что препараты платины как противоопухолевые агенты, вводимые внутрь организма, лучше использовать в виде двухкомпонентных солевых комплексов, содержащих катионы натрия и минимальное содержание катионов платины, например 1-5%, или 5-10% от общего количества карбоксильных групп гиалуроната натрия - абсолютно совместимого с организмом (за редким исключением - в зависимости от естественной аллергической реакции организма) полисахарида.

Водорастворимые ассоциаты гиалуроната и катионов, например, цинка или меди получают путем добавления солей (предпочтительно хлоридов или других) меди и цинка в раствор гиалуроната натрия с последующей ультрафильтрацией на разделительных мембранах, исключающих выход гиалуроната в зависимости от его молекулярной массы. Цинк и медь выбраны из других d-металлов по причине наиболее известного применения в фармакологии и косметологии различных неорганических препаратов с их содержанием и существующего потребительского спроса.

После промывки деионизированной водой на установке ультрафильтрации раствор осаждают этиловым спиртом с получением осадка ассоциата гиалуроната меди или цинка. Сухое вещество можно также получить лиофильной сушкой либо раствор используют непосредственно после стерилизационной фильтрации через мембраны с порами 0,20-0,45 мкм. Способ получения однокомпонентного солевого комплекса гиалуроната цинка заключается в следующем. К гиалуронату натрия в водной среде добавляют эквивалентное количество, по карбоксильным группам, хлорида цинка. Раствор выдерживают при перемешивании сутки для полного прохождения реакции комплексообразования, затем разбавляют и начинают промывать 0,07% раствором хлорида цинка на установке ультрафильтрации с порами мембраны, предотвращающими выход гиалуроната, для удаления избытка катионов натрия и смещения химического равновесия в сторону образования гиалуроната цинка. Затем раствор промывают деионизированной водой для удаления избытка катионов цинка, хлорид-ионов и катионов натрия. Раствор концентрируют и фильтруют на мембранах с порами 0,20-0,45 мкм для того, чтобы отделить возможные привнесенные извне составляющие, например патогенную микрофлору, в результате чего получается готовый для применения раствор, либо осаждают этанолом с последующей сушкой или сушат лиофильно. Данный способ позволяет получать беспримесные образцы гиалуроната, карбоксильные группы которого практически полностью - на 95% и выше - насыщены катионами цинка и содержащие менее 5% катионов натрия.

Химический состав полученной соли: [(C₁₄H₂₀NO₁₁)Zn]_n.

Способ получения двухкомпонентного цинко-натриевого солевого комплекса гиалуроната заключается в следующем. К гиалуронату натрия в водной среде добавляют необходимое количество, например не более 95% от эквивалентного по карбоксильным группам, хлорида цинка в растворе. Раствор выдерживают при перемешивании сутки для полного прохождения реакции комплексообразования, затем разбавляют и начинают промывать деионизированной водой на установке ультрафильтрации с порами, предотвращающими выход гиалуроната. За счет естественных процессов вымывания металлов получается, например, соль с количеством карбоксильных групп, содержащих катионы цинка, равным примерно 90%. Далее раствор концентрируют и фильтруют на мембранах с порами 0,2-0,45 мкм, либо осаждают этанолом с последующей сушкой, или сушат лиофильно. Данный способ позволяет получать беспримесные образцы двухкомпонентной соли гиалуроната, карбоксильные группы которой частично насыщены катионами цинка и содержащие незамещенные катионы натрия.

Химический состав полученной соли: [(C₁₄H₂₀NO₁₁)Zn_xNa_n-x]_n. Способ получения однокомпонентного солевого комплекса гиалуроната меди заключается в следующем. К гиалуронату натрия в водной среде добавляют эквивалентное количество, по карбоксильным группам, хлорида меди. Раствор выдерживают при перемешивании сутки для полного прохождения реакции комплексообразования, затем разбавляют и начинают промывать 0,07% раствором хлорида меди на установке ультрафильтрации с порами мембраны, предотвращающими выход гиалуроната, для удаления избытка катионов натрия и смещения химического равновесия в сторону образования гиалуроната меди. Затем раствор промывают деионизированной водой для удаления избытка катионов меди, хлорид-ионов и катионов натрия. Раствор концентрируют, фильтруют на мембранах с порами 0,20-0,45 мкм, либо осаждают этанолом с последующей сушкой, или сушат лиофильно. Данный способ позволяет получать беспримесные образцы гиалуроната, карбоксильные группы которого практически полностью насыщены катионами меди и не содержащие катионов натрия на карбоксильных группах.

Химический состав полученной соли: [(С₁₄H₂₀NO₁₁)Cu]_n.

Способ получения двухкомпонентного медно-натриевого солевого комплекса гиалуроната заключается в следующем. К гиалуронату натрия в водной среде добавляют необходимое количество, например не более 95% от эквивалентного по карбоксильным группам, хлорида меди в растворе. Раствор выдерживают при перемешивании сутки для полного прохождения реакции комплексообразования, затем разбавляют и начинают промывать деионизированной водой на установке ультрафильтрации с порами мембраны, предотвращающими выход гиалуроната. За счет естественных процессов вымывания металлов получается, например, соль с количеством карбоксильных групп, содержащих катионы меди, равным примерно 89%. Раствор концентрируют, фильтруют на мембранах с порами 0,20-0,45 мкм, либо осаждают этанолом с последующей сушкой, или сушат лиофильно. Данный способ позволяет получать беспримесные образцы гиалуроната, карбоксильные группы которого частично насыщены катионами меди и содержащие незамещенные катионы натрия.

Химический состав полученной соли: [(C₁₄H₂₀NO₁₁)Cu_xNa_n-x]_n.

Таким же образом получают соли, например, золота, кобальта, серебра и других d-металлов IV, V и VI периодов Периодической системы.

Характеристики гиалуроната натрия, используемого в примерах для получения солевых ассоциатов гиалуроната с цинком и медью:

- средняя молекулярная масса 1500000;

- содержание протеина не более 0,05 мас.% от сухого вещества;

- вязкость 2% раствора гиалуроната натрия 1450 мПа·с;

- содержание гиалуроната натрия 98,53%;

- рН водного раствора 6,5.

Изобретения более подробно иллюстрируются нижеследующими примерами.

Пример 1. Получение однокомпонентного солевого комплекса гиалуроната цинка.

10,0 г гиалуроната натрия растворяют в 900 мл деионизированной воды с получением 1,1% раствора. Готовят 90,0 мл 1,9% раствора хлорида цинка. Затем медленно при перемешивании вливают раствор хлорида цинка в раствор гиалуроната натрия. Раствор при комнатной температуре перемешивают в течение суток, по истечении которых смесь разбавляют деионизированной водой до 10 л. Раствор подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с порами 0,03 мкм, медленно добавляя, по мере выхода раствора через мембраны, 0,07% раствор хлорида цинка объемом 5,0 л. Затем раствор промывают деионизированной водой объемом 10 л. Далее раствор концентрируют до объема 3,5 л. Данный раствор осаждают 3 объемами высокочистого 95% этанола. Осадок собирают на стеклянном фильтре и сушат при температуре 60°С при пониженном давлении. В результате получается комплекс гиалуроната цинка массой 10,0 г. Выход продукта составляет 93%.

Пример 2. Получение однокомпонентного солевого комплекса гиалуроната меди.

10,0 г гиалуроната натрия растворяют в 900 мл деионизированной воды с получением 1,1% раствора. Готовят 90,0 мл 1,8% раствора хлорида меди. Затем медленно при перемешивании вливают раствор хлорида меди в раствор гиалуроната натрия. Раствор при комнатной температуре перемешивают в течение суток, по истечении которых смесь разбавляют деионизированной водой до 10 л. Раствор подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с порами 0,03 мкм, медленно добавляя, по мере выхода раствора через мембраны, 0,07% раствор хлорида меди объемом 5,0 л. Затем раствор промывают деионизированной водой объемом 10 л. Далее раствор концентрируют до объема 3,5 л. Данный раствор осаждают 3 объемами высокочистого 95% этанола. Осадок собирают на стеклянном фильтре и сушат при температуре 60°С при пониженном давлении. В результате получается комплекс гиалуроната меди массой 10,0 г. Выход продукта составляет 93%.

Пример 3. Получение двухкомпонентного солевого комплекса гиалуроната, карбоксильные группы в котором на 50% замещены катионами цинка.

10,0 г гиалуроната натрия растворяют в 900 мл деионизированной воды с получением 1,1% раствора. Готовят 90,0 мл 1,0% раствора хлорида цинка. Затем медленно при перемешивании вливают раствор хлорида цинка в раствор гиалуроната натрия. Раствор при комнатной температуре перемешивают в течение суток, по истечении которых смесь разбавляют деионизированной водой до 10 л. Раствор подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с порами 0,03 мкм, медленно добавляя, по мере выхода раствора через мембраны, деионизированную воду объемом 10 л. Далее раствор концентрируют до объема 3,5 л. Данный раствор осаждают 3 объемами высокочистого 95% этанола. Осадок собирают на стеклянном фильтре и сушат при температуре 60°С при пониженном давлении. В результате получается 9,7 г двухкомпонентного комплекса гиалуроната цинка, составляющего примерно 58% от общей массы, и гиалуроната натрия, составляющего примерно 35%. Таким образом, выход продукта составляет 93%.

Пример 4. Получение двухкомпонентного солевого комплекса гиалуроната, карбоксильные группы которого на 80% замещены катионами меди.

10,0 г гиалуроната натрия растворяют в 900 мл деионизированной воды с получением 1,1% раствора. Готовят 90,0 мл 1,5% раствора хлорида меди. Затем медленно при перемешивании вливают раствор хлорида меди в раствор гиалуроната натрия. Раствор при комнатной температуре перемешивают в течение суток, по истечении которых смесь разбавляют деионизированной водой до 10 л. Раствор подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с порами 0,03 мкм, медленно добавляя, по мере выхода раствора через мембраны, деионизированную воду объемом 10 л. Далее раствор концентрируют до объема 3,5 л. Данный раствор осаждают 3 объемами высокочистого 95% этанола. Осадок собирают на стеклянном фильтре и сушат при температуре 60°С при пониженном давлении. В результате получается 9,9 г двухкомпонентного комплекса гиалуроната меди, составляющего примерно 80% от общей массы, и гиалуроната натрия, составляющего примерно 13%. Как видно, выход продукта составляет 93%.

Пример 5. Получение 1,0% стерильного раствора однокомпонентного солевого комплекса гиалуроната цинка.

10,0 г гиалуроната натрия растворяют в 900 мл деионизированной воды с получением 1,1% раствора. Готовят 90,0 мл 1,9% раствора хлорида цинка. Затем медленно при перемешивании вливают раствор хлорида цинка в раствор гиалуроната натрия. Раствор при комнатной температуре перемешивают в течение суток, по истечении которых смесь разбавляют деионизированной водой до 10 л. Раствор подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с порами 0,03 мкм, медленно добавляя, по мере выхода раствора через мембраны, 0,07% раствор хлорида цинка объемом 5,0 л. Затем раствор промывают деионизированной водой объемом 10 л. Далее раствор концентрируют до объема 990 мл. Затем раствор фильтруют в асептических условиях через мембрану с порами 0,45 мкм при давлении 2-4 атм. Получают 1,0% прозрачный стерильный раствор полной соли гиалуроната цинка.

Пример 6. Получение 0,5% стерильного раствора однокомпонентного солевого комплекса гиалуроната меди.

10,0 г гиалуроната натрия растворяют в 900 мл деионизированной воды с получением 1,1% раствора. Готовят 90,0 мл 1,8% раствора хлорида меди. Затем медленно при перемешивании вливают раствор хлорида меди в раствор гиалуроната натрия. Раствор при комнатной температуре перемешивают в течение суток, по истечении которых смесь разбавляют деионизированной водой до 10 л. Раствор подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с порами 0,03 мкм, медленно добавляя, по мере выхода раствора через мембраны, 0,07% раствор хлорида меди объемом 5,0 л. Затем раствор промывают деионизированной водой объемом 10 л. Далее раствор конденсируют до объема 1980 мл. Затем раствор фильтруют в асептических условиях через мембрану с порами 0,45 мкм при давлении 2-4 атм. Получают 0,5% прозрачный стерильный раствор полной соли гиалуроната меди.

Примеры 7-10. Получение разнообразных однокомпонентных и двухкомпонентных солевых комплексов гиалуроната меди или цинка соответствует способам, указанным в примерах 1-4, за исключением того, что после ультрафильтрации раствора на разделительных мембранах он сразу же поступает на лиофильную сушку. Выход продукта составляет 93,4%.

Таким образом, в результате использования изобретений возможно достаточно простыми способами получить высокочистые однокомпонентные солевые комплексы гиалуроновой кислоты, содержащие катионы какого-либо d-металла, или, как правило, двухкомпонентные солевые комплексы гиалуроновой кислоты, содержащие помимо катионов какого-либо d-металла также и катионы натрия, для медицинских и косметологических целей, включающие минимальное количество примесей добавляемых солей металлов и контролируемое количество выделившейся в процессе реакции соли натрия, которые отличаются небольшим временем протекания процессов и малыми затратами.

1. Способ получения водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты, включающий получение водного раствора соли d-металла IV, V и VI периодов Периодической системы и его смешивание с натриевой солью гиалуроновой кислоты, выдерживание смеси, ее перемешивание, разбавление водой и выделение конечного продукта, отличающийся тем, что для смешивания используют количество водного раствора соли вышеуказанного d-металла, эквивалентное количеству карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты или лежащее в пределах от 0,95 до 1,10, после разбавления водой смесь раствора подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с одновременной промывкой вначале водным раствором соли вышеуказанного d-металла, а после деионизированной водой, после чего продукт концентрируют.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что после концентрирования продукт подвергают спиртоосаждению или лиофильной сушке.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что после концентрирования продукт подвергают стерильной фильтрации.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что после стерильной фильтрации продукт подвергают спиртоосаждению или лиофильной сушке.

5. Способ получения водорастворимых солевых комплексов гиалуроновой кислоты, включающий получение водного раствора соли d-металла IV, V и VI периодов Периодической системы и его смешивание с натриевой солью гиалуроновой кислоты, выдерживание смеси, ее перемешивание, разбавление водой и выделение конечного продукта, отличающийся тем, что для смешивания используют количество водного раствора соли вышеуказанного d-металла, меньшее эквивалентного количества карбоксильных групп натриевой соли гиалуроновой кислоты, после разбавления водой смесь раствора подвергают ультрафильтрации на разделительных мембранах с одновременной промывкой деионизированной водой, после чего продукт концентрируют.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что после концентрирования продукт подвергают спиртоосаждению или лиофильной сушке.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что после концентрирования продукт подвергают стерильной фильтрации.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что после стерильной фильтрации продукт подвергают спиртоосаждению или лиофильной сушке.