Измененный штамм модифицированного вируса коровьей оспы ankara (mva)

Изобретение относится к области генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA). Способ предусматривает инфицирование клеток непрерывной линии клеток млекопитающего вирусом коровьей оспы Ankara (MVA) дикого типа, последующее культивирование и сбор вирусов. Далее проводят инфицирование свежих клеток той же самой клеточной линии новообразованными вирусами. При необходимости вышеуказанные этапы повторяют. Предложены также штаммы модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), полученные таким способом, и их использование. Предложенные штаммы имеют значительно пониженную вирулентность в отношении млекопитающих, но также способны расти в непрерывных клеточных линиях. Изобретение может быть использовано в медицине. 13 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 табл.

 

ОПИСАНИЕ

Данное изобретение относится к новым штаммам модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), которые имеют значительно пониженную вирулентность в отношении большинства млекопитающих, особенно людей, но тем не менее растут в клетках непрерывной клеточной линии, одобренной для продуцирования лекарственного средства, такого как вакцина. Данное изобретение относится также к способу получения указанных адаптированных штаммов MVA. Эти MVA могут быть использованы, например, для парентеральной иммунизации, в качестве векторной системы или в активной или инактивированной форме в качестве адъюванта или в качестве регулятора неспецифических компонентов иммунной системы.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Организм постоянно подвергается воздействию инфекционных агентов, таких как бактерии, вирусы, грибки или паразиты. Иммунная система предохраняет организм от перманентной инфекции, вызываемой этими агентами, посредством деструкции и элиминации этих инфекционных агентов и токсичных молекул, продуцируемых ими. Иммунная система может быть подразделена на специфическую и неспецифическую часть, хотя обе части являются тесно связанными. Неспецифическая иммунная реакция делает возможной немедленную защиту против большого разнообразия чужеродных веществ и инфекционных агентов. В противоположность этому, специфическая иммунная реакция индуцируется после лаг-фазы, когда организм подвергается действию вещества в первый раз. Однако специфическая иммунная реакция является высокоэффективной. Специфическая иммунная реакция ответственна за то, что индивидуум, выздоравливающий от специфичной инфекции, защищен от этой специфичной инфекции, но все еще восприимчив к другим инфекционным болезням. Обычно повторная инфекция тем же самым или очень сходным инфекционным агентом вызывает гораздо более слабые симптомы или вообще не вызывает симптомов. Иммунитет сохраняется в течение длительного времени, в некоторых случаях даже в течение всей жизни. Эта иммунологическая память используется при вакцинации, когда организм стимулируют безвредной или инактивированной формой инфекционного агента для индуцирования специфического иммунитета. Иногда в вакцины включают адъюванты для усиления специфической иммунной реакции.

Большой объем знаний об инфекционных заболеваниях и иммунитете был получен в исследованиях натуральной оспы. Это заболевание вызывается вирусом натуральной оспы, членом рода Orthopoxvirus. Почти два столетия назад были начаты профилактические инокуляции вирусом коровьей оспы, приводящие к иммунизации против натуральной оспы. Повторную иммунизацию выполняли вирусом коровьей оспы. В ранние 1950-е годы многие промышленно развитые страны ликвидировали эндемическую натуральную оспу посредством использования вакцинации вирусом коровьей оспы. Однако вакцинация против натуральной оспы вирусом коровьей оспы приводила в некоторых случаях к серьезным осложнениям, таким как поствакцинальный энцефалит, генерализованная вакциния или контактная инфекция.

Новая вакцина, которая не обнаруживает этих осложнений, была создана Anton Mayr. Эта противооспенная вакцина состояла из поксвируса модифицированного вируса коровьей оспы Анкары (MVA), и ее использовали для парентеральной вакцинации против натуральной оспы в приблизительно 150000 вакцинаций без каких-либо осложнений, связанных с этой вакцинацией. Серьезных побочных эффектов не наблюдалось даже у детей с иммунодефицитами. MVA получали мутацией и отбором первоначального вируса коровьей оспы Ankara после 575 пассажей в культурах фибробластов куриных эмбрионов. Безопасность этого MVA подтверждается биологическими, химическими и физическими характеристиками. MVA имеет уменьшенную молекулярную массу, шесть делеций в геноме и является высокоаттенуированным в отношении клеток млекопитающих, т.е. ДНК и белок синтезируются, но фактически не образуются вирусные частицы. Модифицированный вирус коровьей оспы Ankara, разработанный Anton Mayr, был депонирован в Европейской Коллекции Клеточных Культур Животных (ЕСАСС), Salisbury, UK, под депозитным номером V 94012707.

Вакцинация против натуральной оспы была чрезвычайно успешной. В 1979 году Всемирная организация здравоохранения заявила о ликвидации натуральной оспы. Поэтому массовая вакцинация детей была прекращена, и только некоторых работников и членов вооруженных сил некоторых стран вакцинируют.

С ликвидацией натуральной оспы была удалена преобладающая причина оспенной инфекции у людей. Однако некоторые поксвирусы, отличные от человеческого, уменьшили свою специфичность, т.е. они вызывают инфекции не только в их обычном хозяине (например, коровах в случае коровьей оспы), но также и в других животных (например, крысах и кошках). Люди также могут быть инфицированы этим путем. Поскольку часть населения уже не является иммунизированной против натуральной оспы, инфекции ортопоксвирусом животных могут быть опасными для нее. Домашние животные являются главным источником инфекции для людей. Таким образом значение вакцинации домашних животных против ортопоксвирусов все возрастает. Кроме того, MVA может быть применимым в качестве вектора для генотерапии, т.е. для переноса последовательностей нуклеиновых кислот в клетку-мишень, где они экспрессируются.

Для логарифмического размножения MVA необходимы клеточные культуры первичных или вторичных фибробластов куриных эмбрионов. Эти клетки получают из куриных яиц, которые инкубируют в течение 10-12 дней. Поскольку яйца подвержены биологической изменчивости, клетки, полученные для системы клеточной культуры, также являются вариабельными на клеточном уровне. Кроме того, в "культуре фибробластов" куриных эмбрионов часто находят другие типы клеток, такие как эпителиальные клетки. Эта изменчивость клеток приводит также к изменчивости вирусов, продуцируемых в фибробластах куриных эмбрионов. Таким образом трудно стандартизовать и одобрить эту систему культуры клеток для гарантии постоянно высокого качества получаемого MVA. Кроме того, загрязнение этой системы культуры клеток микроорганизмами или вирусами, уже присутствующими в инкубированных яйцах, не может быть полностью исключено. Когда MVA растет в загрязненных вирусами клетках, этот MVA может подвергаться рекомбинации с загрязняющим вирусом. В результате этого может продуцироваться MVA с новыми и непредсказуемыми характеристиками. Для получения этого вируса в крупном масштабе в суспензионной культуре первичные или вторичные фибробласты куриных эмбрионов являются не очень подходящими. Кроме того, очистка и концентрирование MVA градиентным ультрацентрифугированием была бы предпочтительной. Однако такая очистка является затруднительной, когда MVA культивируют на первичном или вторичном фибробласте куриного эмбриона. Наконец, у большого числа пациентов на альбумин куриного яйца развиваются аллергические реакции. Хотя условия культивирования in vitro сильно уменьшают аллергенный потенциал, риск аллергической реакции не может быть исключен полностью.

Таким образом, с одной стороны, MVA может эффективно расти только в первичных или вторичных фибробластах куриных эмбрионов, что вызывает ряд недостатков, но, с другой стороны, безопасность применения MVA на людях была показана крупномасштабным применением его в качестве вакцины.

ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью данного изобретения является создание условий для получения гомогенных вирусных частиц MVA. Кроме того, указанные условия должны обеспечивать легкое и крупномасштабное получение MVA.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Для достижения вышеуказанных и других целей данное изобретение обеспечивает штамм MVA, который адаптирован к росту в клетках непрерывной клеточной линии, причем указанная клеточная линия является одобренной для получения лекарственного средства.

Согласно данному изобретению впервые возможно эффективное и крупномасштабное получение MVA. Поскольку клетки непрерывной клеточной линии являются гомогенными и их характеристики являются стабильными, MVA, собранный из этих клеточных линий, является также гомогенным и имеет высокопредсказуемые характеристики. Кроме того, риск загрязнения микроорганизмами может контролироваться, и загрязнение препарата MVA белками куриного яйца - наблюдаемое при культивировании MVA на фибробластах куриных эмбрионов - может быть исключено. Работа с перманентной клеточной линией является удобной и, следовательно, чрезвычайно применимой для промышленного применения.

В предпочтительном варианте данного изобретения MVA адаптируют для роста в клетках клеточной линии млекопитающего, которая одобрена для получения вакцины. Неожиданно было обнаружено, что MVA, адаптированный к клеточной линии млекопитающего, такой как линия клеток Vero, все еще имеет пониженную вирулентность для людей, а также для широкого диапазона других млекопитающих. Таким образом, этот MVA является высокоаттенуированным, т.е. ДНК и белок синтезируются, но практически не образуются вирусные частицы, что практически обеспечивает устранение болезнетворной способности. Таким образом, MVA в соответствии с данным изобретением является также чрезвычайно применимым в качестве вакцины для людей и для широкого круга млекопитающих. Таким образом, MVA применим, в частности, в области ветеринарии.

Кроме того, обеспечен способ получения штамма MVA по данному изобретению. Согласно этому воплощению данного изобретения клетки клеточной линии, которая одобрена для получения лекарственного вещества, инфицируют MVA дикого типа. Предпочтительно, для инфицирования применяют высокую множественность заражения (MOI), т.е. высокое число вирусов на клетку. Затем вирусы собирают и свежие клетки той же самой клеточной линии инфицируют новообразованными вирусами. Указанный процесс повторяют (серийное пассирование), пока MVA не адаптируется к указанной клеточной линии. Адаптация достигается при 72 ч после инфекции, титр вируса равен по меньшей мере 1-9-кратно, предпочтительно 10-99-кратно, более предпочтительно 100-106-кратно и наиболее предпочтительно более чем 107-1010-кратно увеличенному титру в сравнении с введенным титром вируса. Адаптация достигается после ограниченного числа пассажей.

«Адаптирован для роста» означает, что количество вируса, продуцируемого из инфицирования (выход), является увеличенным в сравнении с количеством вируса, первоначально используемого для инфицирования клеток (входом). В этом случае отношение выход/вход является большим, чем 1.

«Производное» MVA, депонированное в ЕСАСС, Salisbury, UK, под депозитарным номером 99101431 и/или предварительным номером доступа 01021411, означает MVA, который адаптирован для роста в клетках Vero при скорости, которая является по существу одинаковой со скоростью роста депонированного штамма, но несет по меньшей мере одно различие в его геноме в сравнении с этим депонированным штаммом.

Термин «иммунная система» описывает по существу комплекс, участвующий в защите организма против чужеродных веществ и микроорганизмов. Она подразделяется на клеточную часть, включающую в себя несколько типов клеток, таких как, например, лимфоциты и другие клетки, произведенные из лейкоцитов, и гуморальную часть, включающую в себя пептиды и белки, такие как антитела, факторы комплемента и цитокины.

Термин «иммунная реакция» описывает реакцию иммунной системы, когда чужеродное вещество или микроорганизм проникают в данный организм. Обычно иммунная реакция подразделяется на специфическую и неспецифическую реакцию, хотя обе реакции являются тесно связанными. Неспецифическую реакцию рассматривают как немедленную защиту против большого разнообразия чужеродных веществ и инфекционных агентов. Специфическая иммунная реакция может быть охарактеризована как высокоэффективный защитный механизм организма против чужеродного вещества, который индуцируется против указанного вещества после лаг-фазы и является высоко специфическим для указанного вещества. Специфическая иммунная реакция ответственна за феномен, заключающийся в том, что индивидуум, который выздоровел от специфичной инфекции, является защищенным против этой специфичной инфекции в будущем.

«Активатор иммунной системы» обозначает любое вещество, способное вызывать или усиливать иммунную реакцию.

«Супрессор иммунной системы» обозначает любое вещество, способное ослаблять или ингибировать иммунную реакцию.

«Стабилизатор иммунной системы» обозначает любое вещество, способное поддерживать иммунную реакцию на постоянном уровне.

Авторы изобретения описали два предпочтительных штамма MVA, которые адаптированы к линии клеток Африканской зеленой мартышки, называемой клеточной линией Vero (ATCC №CCL-81). Штамм MVA, который был пассирован 100 раз в клетках Vero, был назван "Vero-MVA" и депонирован в Европейской Коллекции Клеточных Культур, Salisbury, UK, под депозитарным номером 99101431. Штамм MVA после 200 пассажей в клетках Vero был назван "Vero-MVA-200" и депонирован в ЕСАСС под предварительным номером доступа 01021411.

MVA, полученный, как описано выше, размножают дополнительно культивированием клеток этой одобренной клеточной линии при подходящих условиях, инфицированием клеток MVA и сбором вирусных частиц, продуцируемых указанными клетками. Таким образом, MVA может быть эффективно и легко размножен в крупном масштабе. Неожиданно, MVA данного изобретения не обнаруживает увеличенной вирулентности в клетках, иных, чем клетки Vero, таких как клеточные линии человека, в том числе HL, НЕР-2 или HeLa.

В другом варианте данного изобретения MVA содержит по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, т.е. последовательность нуклеиновой кислоты, которая не содержится в нативном геноме MVA (рекомбинантный MVA). Предпочтительно, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты является геном, более предпочтительно геном, кодирующим иммунизирующий белок, и наиболее предпочтительно кодирующим белок, иммунизирующий против малярии, бешенства и/или гепатита. Экспрессия указанной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты находится предпочтительно под транскрипционным контролем промотора вируса коровьей оспы, более предпочтительно собственного промотора MVA. В следующем предпочтительном варианте данного изобретения гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты встраивают в природно встречающийся делеционный сайт в геноме MVA (описанный в РСТ/ЕР96/02926).

Рекомбинантный MVA используют для введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, причем указанная последовательность нуклеиновой кислоты является гомологичной или гетерологичной для клетки-мишени. Введение гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень может быть использовано для получения гетерологичных нуклеиновых кислот, пептидов и/или полипептидов и/или белков, кодируемых указанной последовательностью нуклеиновой кислоты in vitro. Этот способ предусматривает инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным MVA, культивирование инфицированной клетки-хозяина при подходящих условиях и необязательное выделение и/или обогащение пептида и/или белка, продуцируемого указанной клеткой-хозяином.

Кроме того, введение гомологичной или гетерологичной последовательности может применяться для генотерапии in vitro и предпочтительно in vivo. Для генотерапии in vitro и ex vivo, соответственно, клетки выделяют из индивидуума, подлежащего лечению, трансформируют рекомбинантным MVA и повторно вводят индивидууму, из которого были взяты эти клетки. Для генотерапии in vivo рекомбинантный MVA вводят непосредственно в тело живого животного, в том числе в тело человека. В предпочтительном варианте данного изобретения рекомбинантный MVA экспрессирует антиген или антигенный эпитоп. Наиболее предпочтительно указанный вектор экспрессирует антигенную детерминанту из Plasmodium falciparum, Mycobacteria, вируса простого герпеса, вируса гриппа, вируса гепатита или вируса иммунодефицита человека.

Поскольку MVA в соответствии с данным изобретением является - неожиданно - все еще высокоаттенуированным, MVA является идеальным для иммунизации большого разнообразия млекопитающих, в том числе человека. Таким образом, данное изобретение обеспечивает также вакцину, содержащую MVA, для иммунизации живого животного организма, в том числе человеческого организма, против оспенных инфекций, предпочтительно инфекций Orthopoxvirus. Эта вакцина может содержать, кроме MVA, одну или несколько добавок, например антибиотик, консервант или стабилизатор. Вакцина особенно применима в области ветеринарии, например, для иммунизации животных против инфекций ортопоксвируса, например, кошек, против кошачьей оспы, мышей против эктромелии или верблюдов против оспы верблюдов. Иммунизацию проводят предпочтительно парентерально.

Иммунизирующее действие антигенной детерминанты в вакцине часто усиливают добавлением так называемого адъюванта. Адъювант костимулирует иммунную систему неспецифическим образом, вызывая более сильную специфическую иммунную реакцию против антигенной детерминанты этой вакцины. В соответствии с данным изобретением MVA используют в качестве адъюванта для костимуляции иммунной реакции против антигенной детерминанты вакцины. В этом случае предпочтительно, чтобы этот MVA был инактивированным. Инактивацию MVA можно выполнять, например, нагреванием или с использованием химикалиев. Предпочтительно, MVA инактивируют β-пропиолактоном. Согласно этому варианту данного изобретения инактивированный MVA может быть добавлен к вакцинам против многочисленных инфекционных болезней для усиления иммунитета против такой болезни.

При инфекции иммунная, нервная, эндокринная и сосудистая система индивидуума работают в тесной взаимосвязи. Эти взаимодействия могут регулироваться элементами неспецифической иммунной системы, например цитокинами, такими как интерфероны и интерлейкины. Поксвирусы могут влиять на регуляцию этой иммунной системы (Swiss Vet 11/99, 13-17). Следовательно, в следующем варианте данного изобретения MVA и предпочтительно инактивированный MVA используют в млекопитающих, в том числе человеке, для регуляции клеточных и гуморальных элементов неспецифической (природной) иммунной системы. Предпочтительно, MVA используют в качестве биорегулятора, причем дисфункции иммунной системы элиминируются, и собственные защитные механизмы организма активируются, стабилизируются и/или супрессируются. Наиболее предпочтительно, MVA используют в качестве биорегулятора в случае вирусной инфекции, например, вирусом герпеса, вирусом гепатита В или С, в случае хронического воспалительного заболевания и/или для подкрепления опухолевой терапии. MVA может быть также использован для стабилизации иммунной системы в ситуации увеличенной чувствительности к инфекциям, например в случае стресса или у новорожденных. Активный и/или предпочтительно инактивированный MVA может вводиться системно, например, внутримышечно и/или локально, например, через слизистые мембраны и/или кожу.

Таким образом, данное изобретение обеспечивает штаммы MVA, которые могут обычно использоваться для тех же самых применений, что и MVA дикого типа, но исключают проблемы, вызываемые размножением MVA дикого типа в фибробластах куриных эмбрионов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение inter alia включает в себя следующее, по отдельности или в комбинации.

Модифицированный вирус коровьей оспы Ankara (MVA), адаптированный для роста в клетках непрерывной клеточной линии, причем указанная клеточная линия является одобренной для получения лекарственного вещества.

MVA, указанный выше, адаптированный для роста в клетках клеточной линии млекопитающего.

MVA, указанный выше, где клеточная линия является одобренной для получения вакцины.

MVA, указанный выше, где указанная одобренная клеточная линия является линией клеток Vero.

MVA, указанный выше, где указанная одобренная клеточная линия является линией клеток Vero ATCC №CCL-81.

MVA, указанный выше, депонированный в Европейской Коллекции Клеточных Культур, Salisbury, UK, под номером депозитария 99101431, и/или его производное.

MVA, указанный выше, депонированный в ЕСАСС, Salisbury, UK, под временным номером доступа 01021411, и/или его производное.

MVA, указанный выше, содержащий по меньшей мере одну гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты.

MVA, указанный выше, содержащий гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую, например, лекарственный белок и/или антигенную детерминанту, например, пептид, иммунизирующий против инфекции малярии, гепатита и/или бешенства.

Клетка-хозяин, инфицированная вышеописанным MVA.

Композиция, предпочтительно фармацевтическая композиция, содержащая вышеописанный MVA и/или ДНК этого MVA.

Фармацевтическая композиция, описанная выше, где эта фармацевтическая композиция является вакциной.

Вакцина, описанная выше, для иммунизации живого организма животного, в том числе человека.

Вакцина, описанная выше, для иммунизации против инфекции ортопоксвируса.

Вакцина, описанная выше, для иммунизации кошек против инфекции кошачьей оспы, мышей против инфекции эктромелии и/или верблюдов против инфекции оспы верблюдов.

Фармацевтическая композиция, описанная выше, где MVA является активатором, супрессором и/или стабилизатором неспецифической иммунной системы.

Фармацевтическая композиция, описанная выше, содержащая вышеописанный MVA и/или ДНК этого MVA в качестве адъюванта.

Фармацевтическая композиция, содержащая вышеописанный рекомбинантный MVA и/или ДНК этого рекомбинантного MVA.

Фармацевтическая композиция, описанная выше, для применения в генотерапии.

Способ для введения гомологичной и/или гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, предусматривающий инфицирование клетки-мишени вышеописанным MVA.

Способ получения штамма MVA, описанного выше, предусматривающий: а) инфицирование клеток одобренной клеточной линии MVA дикого типа, предпочтительно MVA, депонированным в ЕСАСС под номером депозитария V 94012707; b) сбор этих вирусов; с) инфицирование свежих клеток той же самой клеточной линии новообразованными вирусами и, необязательно, d) повторение b) и с) пока вирус не будет адаптирован к росту в клетках указанной клеточной линии.

Способ получения вирусных частиц вышеописанного MVA, предусматривающий культивирование клеток одобренной клеточной линии при подходящих условиях, инфицирование указанной клеточной линии указанным MVA и сбор вирусных частиц, продуцируемых указанной клеточной линией.

Способ, описанный выше, где указанную клеточную линию инфицируют MVA, депонированным в ЕСАСС под номером депозитария 99101431, и/или MVA, депонированным в ЕСАСС под временным номером доступа 01021411, или производным одного из этих штаммов.

Способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, пептида, полипептида и/или белка, предусматривающий инфицирование клетки-хозяина с вышеописанным рекомбинантным MVA, культивирование инфицированной клетки-хозяина при подходящих условиях и, необязательно, выделение и/или обогащение последовательности нуклеиновой кислоты, пептида и/или белка, продуцируемых указанной клеткой-хозяином.

Применение вышеописанного MVA для приготовления фармацевтической композиции для лечения или профилактики заболевания или нарушения, чувствительного к указанному MVA.

Применение вышеописанного MVA для приготовления вакцины для иммунизации живого организма животного, в том числе человека.

Применение вышеописанного MVA для получения активатора, супрессора и/или стабилизатора неспецифической иммунной системы.

Применение, описанное выше, для приготовления адъюванта.

Применение вышеописанного MVA в качестве вакцины.

Применение вышеописанного MVA в качестве адъюванта.

Применение вышеописанного MVA в качестве активатора, супрессора и/или стабилизатора неспецифической иммунной системы.

Способ иммунизации живого организма животного, в том числе человека, предусматривающий введение лицу, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества вышеописанной фармацевтической композиции.

Способ введения гомологичной и/или гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, предусматривающий инфицирование клетки-мишени описанным выше MVA и/или ДНК этого MVA.

Способ активации, супрессии и/или стабилизации иммунной системы живого организма животного, в том числе человека, предусматривающий введение вышеописанной фармацевтической композиции живому организму животного, в том числе человеку.

Способ усиления специфической иммунной реакции против антигенной детерминанты в вакцине, предусматривающий введение вышеописанного MVA в качестве адъюванта живому организму животного, в том числе человеку.

Модифицированный вирус коровьей оспы Ankara, адаптированный для роста в клетках непрерывной клеточной линии, который может быть получен способом, предусматривающим следующее: инфицирование клеток клеточной линии, которая является одобренной для получения терапевтического вещества, сбор вирусных частиц, продуцируемых указанными клеточными линиями, и, необязательно, повторение вышеуказанных стадий пока не будут получены желаемые характеристики роста указанного MVA в указанных клетках.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры будут дополнительно иллюстрировать данное изобретение. Специалисту с квалификацией в данной области будет хорошо понятно, что приведенные примеры никаким образом не могут интерпретироваться как ограничивающие применимость технологии, обеспечиваемой данным изобретением, только этими примерами.

Пример. Адаптация MVA к клеткам Vero и характеристика указанного штамма MVA

1. Адаптация MVA к клеткам Vero

Разработанный Anton Mayr MVA дикого типа, т.е. модифицированный вирус коровьей оспы Ankara, был депонирован в ЕСАСС под депозитарным номером V 94012707. Этот MVA дикого типа был адаптирован для роста в клетках Vero серийным пассированием этого вируса в клетках Vero (таблица 1). Клеточный клон ATCC№. CCL-81 стационарной клеточной линии Vero (исходный материал для посева WHO (Всемирной организации здравоохранения) ЕСАСС №88020401)) использовали в пассажах №148-165 (партия для посева WHO, Master and Working Bank). Эти клетки размножали в среде, состоящей из минимальной поддерживающей среды (Earle's MEM (ICN)), pH 7,4-7,6 и 5% заменителя сыворотки BMS (Biochrom). Согласно способу, известному квалифицированным в данной области специалистам, всегда одни и те же клетки банка культивируемых репродуктивных клеток высевали разделением этих клеток на части 1:2-1:4. Среда содержала приблизительно 250000 клеток на мл. Клетки соответственно размножали в пробирках (2 мл), чашках Roux (100 мл) и пластиковых чашках (6 и 40 мл, соответственно). Обычно клетки образовывали конфлюентный монослой после 16-24 ч. После этого среду заменяли простой минимальной поддерживающей средой (Eagle's MEM) без каких-либо добавок.

Для адаптации MVA дикого типа использовали систему культуры в пробирках. Результаты пассажей суммированы в таблицах 1 и 2. Клетки Vero инфицировали при множественности заражения 10 MOI MVA дикого типа, т.е. в среднем 10 вирусными частицами на одну клетку Vero. Исходный MVA дикого типа был генетически гомогенным, очищенным из бляшек MVA после 575 пассажей в фибробластах куриных эмбрионов (титр: 107,75 KID50/мл). После 24 ч 90% клеток Vero конфлюентного монослоя разрушались токсичными процессами (50% вследствие токсичности, 40% вследствие лизиса). Среду плюс клеточные остатки после замораживания и оттаивания клеток, содержащие продуцированные вирусы, собирали и 0,2 мл этой смеси засевали на монослой клеток Vero в культуральных пробирках (2-ой пассаж). Эту процедуру повторяли 200 раз. После третьего пассажа больше уже не наблюдали токсического эффекта, тогда как наблюдали слабое цитопатическое действие (СРЕ), характеризующееся округлением клеток и лизисом в период 4-6 дней после инфекции (p.inf.). Титр вируса был 101,0 KID50/мл. Был сделан вывод, что пролиферация MVA в клетках Vero началась, хотя очень неэффективно. После пятого пассажа наблюдали типичное СРЕ, которое завершалось после 4-5 дней после инфекции. Титр вируса увеличивался с 101,0 KID50/мл после третьего пассажа до 104,0 KID50/мл после пятого пассажа. Таким образом, вирус размножался более эффективно в клетках Vero. В пассажах №5-11 полное СРЕ наблюдали все более и более рано, и титр вируса увеличивался с каждым пассажем. При пассаже №11 достигалось плато при 107,5 KID50/мл. Соответственно после одиннадцати пассажей достигалась адаптация MVA к клеткам Vero. В следующих 30 дополнительных пассажах результаты для всех пассажей были одинаковыми и высоковоспроизводимыми: СРЕ начиналось уже при 24 ч после инфекции, и все клетки были поражены после трех дней после инфекции. В это время 20% клеток Vero были округлившимися и 80% клеток были лизированы. Спустя три дня после инфекции титр вируса был всегда около 107,75 KID50/мл. После пятнадцатого пассажа вирусы всегда собирали после двух-трех дней после инфекции и только 1 MOI вместо 10 MOI использовали для инфицирования этих клеток (таблица 2). В следующих дополнительных пассажах характеристики MVA изменялись лишь в слабой степени. Следует отметить, что оптимальный титр вируса дополнительно увеличивался и достигал 1010 KID50/мл при пассаже 200.

Таким образом, вирус растет воспроизводимо экспоненциальным образом в клетках Vero. Указанная характеристика роста удивительным образом отличается от характеристик MVA дикого типа. Таким образом, посредством серийного разведения был получен новый штамм MVA. Указанный новый штамм был назван "Vero-MVA", а после пассажа 200 в клетках Vero - "Vero-MVA-200".

Vero-MVA и Vero-MVA-200 культивировали в более высоких количествах. Для хранения Vero-MVA концентрировали центрифугированием, ресуспендировали в 2,5% полигелине и лиофилизировали во флаконах на 2 мл. Титр после лиофилизации был все еще по меньшей мере 108,5 KID50/мл. Лиофилизированные Vero-MVA и Vero-MVA-200 проверяли на загрязнение и токсичность и хранили при +4°С.

2. Характеристика биологических свойств Vero-MVA

Биологические характеристики Vero-MVA (пассажа 100) и Vero-MVA-200 (пассажа 200) сравнивали с характеристиками MVA дикого типа (таблица 3 и таблица 5). При этом использовали способы, известные квалифицированному практику. Авторы изобретения показали, что не изменились ни круг хозяев этого вируса, за исключением клеток Vero, ни вирулентность в отношении людей или животных. Vero-MVA все еще характеризуется абортивным размножением в непермиссивных клетках-хозяевах.

Принципиальная идентичность этих вирусных частиц Vero-MVA в сравнении с вирусными частицами штамма Elstree вируса коровьей оспы была показана перекрестной реактивностью антител, индуцированных против штамма Elstree. Штамм Elstree является штаммом вируса коровьей оспы, рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения для вакцинации против натуральной оспы. Поликлональную гипериммунную сыворотку кроликов, индуцированную против штамма Elstree, добавляли к Vero-MVA. 100 KID50/мл Vero-MVA были полностью нейтрализованы при разведении сыворотки 1:512. Вдвое большее разведение этой сыворотки было необходимо для нейтрализации того же самого количества штамма коровьей оспы Elstree (1:256). Таким образом, Vero-MVA все еще мог эффективно нейтрализоваться иммунной сывороткой коровьей оспы.

Vero-MVA, Vero-MVA-200 и MVA дикого типа сравнивали с использованием ряда дополнительных тестов, как показано в таблице 3, 4 и 5. Авторы изобретения показали, что вирулентность Vero-MVA и Vero-MVA-200 для млекопитающих, в том числе для человека, не увеличивалась в сравнении с MVA дикого типа. Было также показано, что Vero-MVA и Vero-MVA-200 не были контагиозными или токсичными для млекопитающих, в том числе для человека. Неожиданно, клеточная специфичность Vero-MVA была более или менее идентичной специфичности MVA дикого типа, за исключением клеток Vero: Vero-MVA размножается почти так же неэффективно в клетках клеточных линий человека (см. таблицу 4: клетки HL, НЕР-2 и HeLa), как и MVA дикого типа. Таким образом, хотя клетки человека и клетки Африканской зеленой мартышки являются филогенетически близкородственными, Vero-MVA не приобрел способности размножаться в клетках человека. В других тестах также не наблюдали значимого различия.

Кроме того, сравнивали физические, химические и биологические характеристики MVA дикого типа и Vero-MVA-200 (таблица 5). В то время как MVA дикого типа, растущий в культурах фибробластных клеток куриных эмбрионов, имеет три делеции в левом инвертированном концевом районе, Vero-MVA-200 имеет четыре делеции в левом концевом районе в сравнении с геномом поксвируса, исходно выделенного в Ankara. Таким образом, пассирование MVA дикого типа в клетках Vero привело к дополнительной делеции.

Vero-MVA использовали для иммунизации домашних животных против инфекций ортопоксвируса. Сыворотку этих животных собирали и выполняли тест нейтрализации. Авторы изобретения показали, что эти животные продуцировали антитела в высоких титрах. Титры антител были стабильными на протяжении периода по меньшей мере 111 дней. Было также показано, что эти антитела были способны нейтрализовать in vitro вирусные частицы MVA в тесте уменьшения бляшкообразования. В заключение можно сказать, что Vero-MVA может быть использован в качестве вакцины против инфекций ортопоксвируса в домашних животных и в людях.

1. Способ получения модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), предназначенного для роста в клетках непрерывной линии клеток млекопитающего, включающий стадии:

a) инфицирование клеток непрерывной линии клеток млекопитающего вирусами коровьей оспы Ankara (MVA) дикого типа,

b) культивирование вирусов,

c) сбор вирусов,

d) инфицирование свежих клеток той же самой клеточной линии новообразованными вирусами и

e) повторение а)-d), пока вирус не будет адаптирован к росту в клетках указанной клеточной линии, определяемому по показателю превышения титра вируса на стадии с) титра исходного вируса, используемого при инфицировании на стадии а).

2. Способ по п.1, где клеточная линия представляет собой линию клеток Vero.

3. Способ по п.2, где клеточная линия представляет собой линию клеток Vero ATCC №CCL-81.

4. Способ по п.3, где для инфицирования на стадии а) используют MVA, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером V 94012707.

5. Способ по п.4, в результате которого получают MVA, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером 99101431.

6. Способ по п.4, в результате которого получают MVA, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером 01021411.

7. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию d), предусматривающую введение в геном MVA по меньшей мере одной гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты.

8. Способ по п.7, где гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой ген, кодирующий терапевтический белок и/или антигенную детерминанту.

9. Штамм модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), предназначенный для введения в макроорганизм, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером 99101431.

10. Штамм модифицированного вируса коровьей оспы Ankara (MVA), предназначенный для введения в макроорганизм, депонированный в ЕСАСС под депозитарным номером 01021411.

11. Способ получения клетки-хозяина, инфицированной вирусом MVA, включающий стадии:

a) получение вируса MVA способом по любому из пп.1-8,

b) инфицирование клеток-хозяев вирусом, полученным на стадии а) или вирусом по любому из пп.9-10,

с) сбор клеток-хозяев, инфицированных вирусом MVA.

12. Фармацевтическая композиция для введения в макроорганизм, содержащая в качестве действующего вещества вирус MVA, полученный способом по любому из пп.1-8, или вирус MVA по любому из пп.9-10, или ДИК указанных вирусов.

13. Способ размножения MVA, включающий стадии:

a) культивирование клеток клеточной линии, в которой MVA может воспроизводиться при подходящих условиях,

b) инфицирование указанной клеточной линии MVA, полученных способом по любому из пп.1-8, или вирусом по любому из пп.9-10, и

c) сбор вирусных частиц, продуцируемых указанной клеточной линией.

14. Способ иммунизации млекопитающего, в том числе человека, предусматривающий введение лицу, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции по п.12.

15. Способ модификации вируса коровьей оспы Ankara (MVA) с целью адаптации к росту в клетках непрерывной линии клеток млекопитающего, включающий следующие стадии:

a) инфицирование клеток непрерывной линии клеток млекопитающего, которая является одобренной для получения лекарственного вещества, вирусом коровьей оспы Ankara (MVA),

b) сбор вирусных частиц, продуцируемых указанными клеточными линиями, и, необязательно,

c) повторение вышеуказанных стадий, пока не будут получены желаемые характеристики роста указанного MVA в указанных клетках.

16. Способ активации, супрессии и/или стабилизации неспецифической иммунной системы живого организма животного, в том числе человека, предусматривающий введение фармацевтической композиции по п.12.

17. Способ усиления специфической иммунной реакции против антигенной детерминанты в вакцине, предусматривающий введение MVA, полученных способом по любому из пп.1-8, или вирусом по любому из пп.9-10, в качестве адъюванта в живой организм животного, в том числе в человека.

18. Способ введения гомологичной и/или гетерологичной последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-мишень, предусматривающий инфицирование клетки-мишени вирусом MVA, полученным способом по п.7 или 8, или ДНК указанных вирусов.

19. Способ экспрессии терапевтического белка в макроорганизме, включающий стадии:

a) выделение клеток из макроорганизма для обработки;

b) трансформирование выделенных клеток при помощи MVA полученным способом по п.7 или 8 и

c) введение обработанных клеток макроорганизма согласно стадиям (а) и (b) обратно в макроорганизм.

20. Способ экспрессии терапевтического белка в макроорганизме, включающий стадии непосредственного введения в макроорганизм MVA полученным способом по п.7 или 8, или ДНК указанных вирусов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицине. .

Изобретение относится к генной инженерии и может быть использовано в диагностике, терапии и фармацевтической промышленности. .

Изобретение относится к медицине и касается композиции, способа получения не природной упорядоченной и содержащей повторы антигенной матрицы, способа терапевтического лечения и способа иммунизации.

Изобретение относится к медицине и касается вакцины, содержащей мутантный вирус герпеса. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к бактериофагам для использования в лечении или профилактике бактериальных инфекций, особенно бактериальных инфекций слизистых оболочек. .

Изобретение относится к медицине и касается химерного живого инфекционного аттенуированного вируса, который применяется для создания химерных флавивирусных вакцин.

Изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и иммунологии и может быть использовано для создания вакцины против вируса классической свиной лихорадки (CSFV). .
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. .
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а точнее к производству диагностикумов и вакцинных препаратов против вируса "аденовирусного гепатита с включениями - гидроперикардита кур (АДВГГ)", и может быть использовано как для изготовления диагностикумов и вакцин, так и для экспериментального изучения болезни.
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к производству биопрепарата. .
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. .

Изобретение относится к области генной инженерии. .

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицине. .

Изобретение относится к области генной инженерии. .
Наверх