Антигенные пептиды neisseria

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, антигенным пептидным последовательностям из бактерий Neisseria meningitidis и N.gonorrhoeae. Описанные в изобретении белки содержат фрагмент одного или более белков Neisseria с определенной аминокислотной последовательностью с определенным количеством аминокислотных остатков (аминокислотные последовательности приведены в описании). Описаны также нуклеиновые кислоты (НК), кодирующие указанные белки, и их использование в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, обусловленной нейссериями. Показано использование белка или НК в составе диагностического реагента для обнаружения нейссерий или антител против нейссерий. Описана иммуногенная композиция на основе белка или НК для получения специфических антител и ее использование для лечения соответствующей инфекции. Использование изобретения позволяет получать белковые вакцины, эффективные в отношении N.meningitidis В. 7 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к антигенным пептидным последовательностям из бактерии Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

N. meningitidis является неподвижным грамотрицательным диплококком, который является патогенным для человека.

На основании капсулярного полисахарида указанного организма было идентифицировано 12 серологических групп N. meningitidis. Группа А является патогеном, наиболее часто участвующим в эпидемическом заболевании в лежащей южнее Сахары Африке. Серологические группы В и С являются ответственными за огромное большинство случаев в Соединенных Штатах и наиболее развитых странах. Серологические группы W135 и Y являются ответственными за остальные случаи в Соединенных Штатах и развитых странах.

Применяемая в настоящее время менингококковая вакцина является четырехвалентной полисахаридной вакциной, состоящей из серологических групп А, С, Y и W135. Однако менингококк В остается проблемой. Полисахаридный подход не может быть использован, так как капсулярный полисахарид menB является полимером α(2-8)-связанной N-ацетилнейраминовой кислоты, которая присутствует также в ткани млекопитающих. Один подход к вакцине menB использует смеси наружных мембранных белков (ОМР). Для преодоления антигенной вариабельности были сконструированы поливалентные вакцины, содержащие до девяти различных поринов [например, Poolman JT (1992) Development of meningococcal vaccine. Infect. Agents Dis. 4:13-28]. Дополнительными белками, используемыми в вакцинах на основе белков наружной мембраны, были белки ора и орс, но ни один из этих подходов не был в состоянии преодолеть антигенную вариабельность [например, Ala'Aldeen & Borriello (1996)]. Менингококковые трансферринсвязывающие белки 1 и 2 находятся на поверхности и генерируют бактерицидные антитела, способные убивать гомологичные и гетерологичные штаммы. [Vaccine 14 (1):49-53].

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном изобретении представлены фрагменты белков, описанных в международных патентных заявках WO 99/57280 и WO 00/22430 (далее: «Международные заявки»), причем эти фрагменты содержат по меньшей мере одну антигенную детерминанту. При этом последовательностям No. 2370 и No. 2372 Международной заявки WO 99/57280 соответствуют в списке последовательностей, прилагаемом к описанию настоящей заявки, последовательности 998 и 999.

Так, если длина любой конкретной белковой последовательности, описанной в Международных заявках, составляет х аминокислот, то в данном изобретении представлены фрагменты самое большее в х-1 аминокислот этого белка. Фрагмент может быть более коротким (например, х-2, х-3, х-4,...) и предпочтительно имеет 100 аминокислот или менее (например, 90 аминокислот, 80 аминокислот и т.д.). Этот фрагмент может составлять в длину даже 3 аминокислоты, но предпочтительно является более длинным (например, до 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 аминокислот).

Предпочтительные фрагменты содержат менингококковые пептидные последовательности, описанные в таблице 1, или их субпоследовательности. Фрагменты могут быть более длинными, чем приведенные в таблице 1, например, в случае, когда фрагмент в таблице 1 простирается от аминокислотного остатка р до остатка q белка, данное изобретение относится также к фрагментам от остатка (р-1), (р-2) или (р-3) до остатка (q+1), (q+2) или (q+3).

В данном изобретении представлены также полипептиды, которые являются гомологичными (т.е. имеют идентичность последовательности) относительно этих фрагментов. В зависимости от конкретного фрагмента степень идентичности последовательности является предпочтительно большей, чем 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Эти гомологичные полипептиды включают мутанты и аллельные варианты этих фрагментов. Идентичность между двумя последовательностями предпочтительно определяют обычно с использованием алгоритма поиска гомологии Smith-Waterman, обеспеченного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), с использованием поиска аффинного гэпа с параметрами пенальти (штраф) открывания гэпа = 12 и пенальти (штраф) удлинения гэпа = 1.

В данном изобретении представлены также белки, содержащие один или более определяемых выше фрагментов.

Данное изобретение подчиняется условию, что оно не включает в свой объем белки, ограничиваемые любой из полноразмерных белковых последовательностей, описанных в Международных заявках (т.е. четных последовательностей SEQ ID NO:2-3020 WO 99/57280 и нечетных SEQ ID NO:963-1045 WO 00/22430).

Белки согласно изобретению могут, конечно, быть получены различными способами (например, путем рекомбинантной экспрессии, очистки из культуры клеток, путем химического синтеза и т.д.) и в различных формах (например, в нативном виде, в виде С-концевых и/или N-концевых гибридов и т.д.). Предпочтительно их получают по существу в чистом виде (т.е. по существу не содержащими других белков Neisseria или клетки-хозяина). Короткие белки получают предпочтительно при помощи химического синтеза пептидов.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение относится к антителам, которые узнают фрагменты согласно изобретению, при условии, что данное изобретение не включает в свой объем антитела, которые узнают любую из полноразмерных белковых последовательностей, представленных в Международных заявках. Эти антитела могут быть поликлональными или моноклональными и могут быть получены любым подходящим способом.

Данное изобретение представляет также белки, содержащие пептидные последовательности, узнаваемые этими антителами. Эти пептидные последовательности будут, конечно, включать фрагменты менингококковых белков в Международных заявках, но будут также включать пептиды, которые имитируют антигенную структуру менингококковых пептидов, будучи связанными с иммуноглобулином.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую фрагменты и белки данного изобретения, при условии, что данное изобретение не включает в свой объем нуклеиновую кислоту, кодирующую любую из полноразмерных белковых последовательностей в Международных заявках. Нуклеиновые кислоты могут быть не длиннее 10 нуклеотидов, но предпочтительно являются более длинными (например, до 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 или 100 нуклеотидов).

Кроме того, данное изобретение представляет нуклеиновые кислоты, содержащие последовательности, гомологичные (т.е. имеющие идентичность последовательности) этим последовательностям. Степень идентичности последовательности предпочтительно является большей, чем 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более). Кроме того, данное изобретение представляет нуклеиновую кислоту, которая может гибридизоваться с этими последовательностями, предпочтительно в условиях "высокой жесткости" (например, 65°С в растворе 0,1×SSC, 0,5% ДСН).

Должно быть понятно, что данное изобретение представляет нуклеиновую кислоту, содержащую последовательности, комплементарные описанным выше последовательностям (например, для применения в качестве антисмысловых последовательностей или зондов).

Нуклеиновая кислота данного изобретения может быть, конечно, получена многочисленными путями (например, химическим синтезом, из библиотек геномных ДНК или кДНК, из самого организма и т.д.) и может принимать различные формы (например, одноцепочечные, двухцепочечные, векторы, зонды и т.д.). Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные скелеты молекул, а также пептиднуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д..

Согласно следующему аспекту, данное изобретение представляет векторы, содержащие нуклеотидные последовательности данного изобретения (например, экспрессирующие векторы), и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.

Согласно следующему аспекту, данное изобретение представляет композиции, содержащие белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту в соответствии с данным изобретением. Эти композиции могут быть пригодными, например, в качестве вакцин или в качестве диагностических реагентов или в качестве иммуногенных композиций.

Данное изобретение представляет также нуклеиновую кислоту, белок или антитело согласно данному изобретению для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин или в качестве иммуногенных композиций) или в качестве диагностических реагентов. Оно представляет также применение нуклеиновой кислоты, белка или антитела в соответствии с данным изобретением в производстве: (i) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, вызываемой бактериями Neisseria; (ii) диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных в отношении бактерий Neisseria; и/или (iii) реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria. Указанные бактерии Neisseria могут быть любым видом или штаммом (таким как Neisseria gonorrhoeae), но предпочтительно являются N. meningitidis, в частности, штаммом А или штаммом В.

Данное изобретение представляет также способ лечения пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела данного изобретения.

Согласно следующим аспектам, данное изобретение представляет различные способы, например:

представлен способ получения белков данного изобретения, включающий стадию культивирования клетки-хозяина в соответствии с данным изобретением в условиях, которые индуцируют экспрессию белка;

представлен способ получения белка или нуклеиновой кислоты данного изобретения, в котором белок или нуклеиновую кислоту синтезируют с использованием частично или полностью химических способов;

представлен способ обнаружения полинуклеотидов данного изобретения, включающий стадии: (а) контактирования зонда нуклеиновой кислоты данного изобретения с биологической пробой в условиях гибридизации с образованием дуплексов; и (b) обнаружения указанных дуплексов; и

представлен способ обнаружения белков данного изобретения, включающий стадии: (а) контактирования антитела в соответствии с данным изобретением с биологической пробой в условиях, подходящих для образования комплексов антитело-антиген; и (b) обнаружения указанных комплексов.

Далее следует краткое описание стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления данного изобретения (например, для использования описанных последовательностей для вакцинации или для диагностических целей). Это краткое изложение не является ограничением данного изобретения, а скорее дает примеры, которые могут быть использованы, но которые не являются обязательными.

Общая часть

Практика данного изобретения будет использовать, если нет других указаний, общепринятые способы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые находятся в рамках квалификации в данной области. Такие способы объясняются в полном виде в литературе, например, Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and ii (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed, 1984); Vucleic Acid Hybridisation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D.Hames & S.J.Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I.Freshney ed. 1986); Immobilised Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); В.Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), в частности тома 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H.Miller and M.P.Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds 1986).

В данной заявке используются стандартные аббревиатуры для нуклеотидов и аминокислот.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые здесь, включены в качестве ссылки в полном объеме.

Определения

Композиция, содержащая X, является "по существу не содержащей" Y, когда по меньшей мере 85% по весу общего количества X+Y в этой композиции составляет X. Предпочтительно, Х составляет по меньшей мере около 90% по весу общей суммы X+Y в композиции, более предпочтительно по меньшей мере около 95% или даже 99% по весу.

Термин "содержащий" означает "включающий", а также "состоящий", например, композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из Х или может включать что-либо дополнительно к X, например, X+Y.

Термин "антигенная детерминанта" включает В-клеточные эпитопы и Т-клеточные эпитопы.

Термин "гетерологичный" относится к двум биологическим компонентам, которые не находятся вместе в природе. Этими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные участки, такие как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты не обнаруживаются вместе в природе, они могут функционировать вместе, как, например, когда промотор, гетерологичный для гена, функционально связан с этим геном. Другим примером является случай, когда менингококковая последовательность является гетерологичной для мышиной клетки-хозяина. Дополнительными примерами могли бы быть два эпитопа из одного и того же или различных белков, которые были собраны в единый белок в расположении, не обнаруживаемом в природе.

"Точка начала репликации" является полинуклеотидной последовательностью, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Точка начала репликации ведет себя как автономная единица репликации полинуклеотидов в клетке, способной к репликации под его собственным контролем. Точка начала репликации может быть необходимой для репликации вектора в конкретной клетке-хозяине. С определенными точками начала репликации экспрессирующий вектор может быть репродуцирован в высоком числе копий в присутствии подходящих белков в клетке. Примерами точек начала репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, которые являются эффективными в дрожжах; и вирусный Т-антиген, эффективный в клетках COS-7.

Системы экспрессии

Менингококковые нуклеотидные последовательности могут быть экспрессированы в разнообразных системах экспрессии;

например, системах экспрессии, которые используются клетками млекопитающих, бакуловирусами, растениями, бактериями и дрожжами.

i. Системы млекопитающих

Системы экспрессии млекопитающих известны в данной области. Промотором млекопитающих является любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих и инициировать в направлении хода транскрипции (3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь участок инициации транскрипции, который обычно расположен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности, и ТАТА-бокс, обычно расположенный на 25-30 пар нуклеотидов (п.н.) слева (против хода транскрипции) от сайта инициации транскрипции. Предполагается, что ТАТА-бокс определяет начало синтеза РНК РНК-полимеразой II в правильном месте. Промотор млекопитающих содержит также левый промоторный элемент, обычно расположенный в 100-200 п.н. слева от ТАТА-бокса. Левый промоторный элемент определяет скорость, при которой инициируется транскрипция и может действовать в любой ориентации [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. (1989)].

Гены вирусов млекопитающих часто являются высокоэкспрессируемыми и имеют широкий спектр хозяев; таким образом, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают ранний промотор SV40, LTR-промотор мышиного вируса опухоли молочной железы, основной поздний промотор аденовируса (Ad MLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, произведенные из не-вирусных генов, такие как ген мышиного металлотионеина, также представляют применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть либо конститутивной, либо регулируемой (индуцируемой), в зависимости от того, может ли данный промотор индуцироваться глюкокортикоидом в чувствительных к гормону клетках.

Наличие энхансерного элемента (энхансера), объединенного с описанными выше промоторными элементами, будет обычно увеличивать уровни транскрипции. Энхансер является регулярной последовательностью ДНК, которая может стимулировать транскрипцию до 1000-кратного уровня при связывании с гомологичным или гетерологичным промоторами, причем синтез начинается в нормальном стартовом (инициирующем) сайте РНК. Энхансеры являются также активными, когда они помещены против хода транскрипции (слева) или по ходу транскрипции (справа) от сайта инициации транскрипции, либо в нормальной, либо в обратной ориентации, или на расстоянии более 1000 нуклеотидов от промотора [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Albertis et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2^nd ed.]. Энхансерные элементы, произведенные из вирусов, могут быть особенно применимыми, так как они обычно имеют широкий спектр хозяев. Примеры включают энхансер раннего гена SV40 [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761] и энхансер/промоторы, произведенные из длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] и из цитомегаловируса человека [Boshart et al. (1989) Cell 41:521]. Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в клетках млекопитающих. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с этой молекулой ДНК, и в этом случае первая аминокислота на N-конце рекомбинантного белка всегда будет метионином, который кодируется инициирующим кодоном ATG. Если желательно, этот N-конец может быть отщеплен от белка инкубацией in vitro с цианогенбромидом.

Альтернативно, чужеродные белки могут быть также секретированы из клетки в среду для выращивания посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, которая представляет секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительно, имеются сайты процессинга, кодируемые между этим лидерным фрагментом и чужеродным геном, которые могут быть отщеплены in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые регулируют секрецию белка из клетки. Аденовирусный. состоящий из трех частей лидер является примером лидерной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих.

Обычно последовательности терминации и полиаденилирования, узнаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными участками, расположенными 3' (справа) относительно стоп-кодона трансляции, и, следовательно, вместе с промоторными элементами, фланкируют кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой мРНК образуется сайт-специфическим посттрансляционным расщеплением и полиаденилированием [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3'end processing of eukariotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D. Hames and D.M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Эти последовательности направляют транскрипцию мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примеры сигналов терминации транскрипции/полиаденилирования включают сигналы, произведенные из SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed. (1989)].

Обычно, описанные выше компоненты, содержащие промотор, сигнал полиаденилирования и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессионные конструкции. Энхансеры, интроны с функциональными донорным и акцепторным сайгами сплайсинга и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессионную конструкцию, если желательно. Экспрессионные конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как клетки млекопитающих или бактерии. Репликационные системы млекопитающих включают системы, происходящие из вирусов животных, которые требуют транс-действующих факторов для репликации. Например, плазмиды, содержащие репликационные системы паповавирусов, таких как SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] или полиомавирус, реплицируются до исключительно высокой копийности в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительные примеры репликонов млекопитающих включают репликоны, происходящие из бычьего папилломавируса и вируса Эпстайна-Барр. Дополнительно, репликон может иметь две системы репликации, что позволяет ему сохраняться, например, в клетках млекопитающих для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов млекопитающее-бактерии включают рМТ2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] и рНЕВО [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074].

Используемая процедура трансформации зависит от подлежащего трансформации хозяина. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают опосредованную декстраном трансфекцию, кальций-фосфатную преципитацию, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.

Линии клеток млекопитающих, доступные в качестве хозяев для экспрессии, известны в данной области и включают многочисленные иммортализованные клеточные динии из Американской Коллекции Типовых культур (АТСС), в том числе, но не только, клетки яичника китайского хомячка (СНО), HeLa-клетки, клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер G2) и ряд других клеточных линий.

ii. Бакуловирусные системы

Полинуклеотид, кодирующий белок, может быть также встроен в подходящий экспрессирующий вектор насекомого и функционально связан с регуляторными элементами в этом векторе. Конструирование векторов использует способы, которые известны в данной области. Обычно, компоненты экспрессионной системы включают вектор-переносчик, обычно бактериальную плазмиду, который содержит как фрагмент бакуловирусного генома, так и удобный сайт рестрикции для встраивания гетерологичного гена или гетерологичных генов, которые должны быть экспрессированы; бакуловирус дикого типа с последовательностью, гомологичной бакуловирус-специфическому фрагменту в векторе-переносчике (это позволяет осуществить гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в геном бакуловируса); и подходящие клетки-хозяева насекомого и среды для выращивания.

После встраивания ДНК-последовательности, кодирующей данный белок, в вектор-переносчик, этот вектор и геном вируса дикого типа трансфицируют в клетку-хозяин насекомого, где этому вектору и вирусному геному дают рекомбинироваться. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется, и рекомбинантные бляшки идентифицируют и очищают. Материалы и способы для систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными в форме набора от, помимо прочего, Invitrogen, San Diego CA (набор "МахВас"). Эти способы обычно известны специалистам в данной области и в полном виде описаны в Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin NO. 1555 (1987) (далее называемом "Summers and Smith").

Перед встраиванием ДНК-последовательности, кодирующей данный белок, в бакуловирусный геном, описанные выше компоненты, в том числе промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, обычно собирают в промежуточную перемещающую конструкцию (вектор-переносчик). Эта конструкция может содержать единственный ген и функционально связанные регуляторные элементы; множественные гены, каждый со своим собственным набором функционально связанных регуляторных элементов; или множественные гены, регулируемые одним и тем же набором регуляторных элементов. Промежуточные перемещающие конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, таком как бактерия. Репликон будет иметь систему репликации, что позволяет ему сохраняться в подходящем хозяине для клонирования и амплификации.

В настоящее время, наиболее обычно используемым вектором-переносчиком для введения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Многие другие векторы, известные специалистам в данной области, также могут быть сконструированы. Они включают, например, pVL985 (который изменяет инициирующий кодон полиэдрина с ATG на АТТ и который вводит клонирующий сайт BamHI в 32 п.н. по ходу транскрипции (справа) от АТТ; см. Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31.

Эта плазмида обычно содержит также сигнал полиаденилирования полиэдрина (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) и прокариотический ген устойчивости к ампициллину (атр) и точку начала репликации для отбора и размножения в Е.coli.

Бакуловирусные векторы-переносчики обычно содержат промотор бакуловируса. Промотором бакуловируса является любая ДНК-последовательность, способная связывать бакуловирусную РНК-полимеразу и инициировать по ходу транскрипции (5'→3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь участок инициации транскрипции, который обычно помещен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности. Этот участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный вектор-переносчик может также иметь второй домен, называемый энхансером, который, в случае его присутствия, находится обычно дистально от структурного гена. Экспрессия может быть либо регулируемой, либо конститутивной.

Структурные гены, многокопийно транскрибируемые в поздние периоды цикла вирусной инфекции, представляют особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают последовательности, происходящие из гена, кодирующего вирусный белок полиэдрон, Friesen et al., (1986) "Regulation of Baculovirus Gene Expression," in The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127 839 and 155476; и гена, кодирующего белок р10, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.

ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть получена из генов для секретируемых белков насекомых или бакуловируса, таких как ген полиэдрина бакуловируса (Carbonell et al., (1988) Gene, 73:409). Альтернативно, поскольку сигналы для посттрансляционных модицикаций клеток млекопитающих (таких как отщепление сигнального пептида, протеолитическое расщепление и фосфорилирование) узнаются, по-видимому, клетками насекомых, и сигналы, требующиеся для секреции и ядерного накопления, также, по-видимому, являются консервативными между клетками беспозвоночных и клетками позвоночных, лидеры, происходящие не из насекомых, такие как полученные из генов, кодирующих -интерферон человека, Maeda et al., (1985), Nature 315:592; гастрин-высвобождающий пептид человека, Lebacq-Verheyden et al., (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 человека. Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:8404; мышиный IL-3 (Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; и глюкоцереброзидазу человека, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, могут быть также использованы для обеспечения секреции в насекомых.

Рекомбинантный полипептид или полипротеин может экспрессироваться внутриклеточно или, если он экспрессируется с правильными регуляторными последовательностями, он может быть секретирован. Хорошая внутриклеточная экспрессия неслитых чужеродных белков обычно требует гетерологичных генов, которые в идеале имеют короткую лидерную последовательность, содержащую подходящие сигналы инициации трансляции, находящиеся впереди стартового (инициирующего) сигнала ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от зрелого белка инкубированием in vitro цианогенбромидом.

Альтернативно, рекомбинантные полипротеины или белки, которые природно не секретируются, могут быть секретированы из клетки насекомого посредством создания химерных ДНК-молекул, которые кодируют слитый (гибридный) белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, который обеспечивает секрецию чужеродного белка в насекомых. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые управляют транслокацией этого белка в эндоплазматический ретикулум.

После встраивания последовательности ДНК и/или гена, кодирующего экспрессионный продукт-предшественник этого белка, клетку-хозяина насекомого котрансформируют с гетерологичной ДНК вектора-переносчика и геномной ДНК бакуловируса дикого типа - обычно посредством котрансфекции. Промотор и последовательность терминации транскрипции этой конструкции будет обычно содержать участок 2-5 т.п.н. генома бакуловируса. Способы введения гетерологичной ДНК в желаемый сайт в бакуловирусе известны в данной области. (См. Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; и Luckow and Summers (1989)). Например, встраивание может производиться в ген, такой как ген полиэдрина, гомологичной рекомбинацией с двойным кроссинговером; встраивание может производиться также в сайт рестрикционного фермента (рестриктазы), введенный генной инженерией в желаемый ген бакуловируса. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. ДНК-последовательность при клонировании вместо гена полиэдрина в экспрессирующий вектор, фланкирована как 5', так и 3' специфическими последовательностями полиэдрина и расположена справа (по ходу транскрипци) от промотора полиэдрина.

Затем новообразованный бакуловирусный экспрессирующий вектор упаковывают в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит при низкой частоте (между около 1% и около 5%); таким образом, большая часть вируса, продуцируемого после котрансфекции, все еще является вирусом дикого типа. Таким образом, необходим способ для идентификации рекомбинантного вируса. Преимуществом этой экспрессионной системы является визуальный скрининг, позволяющий отличать рекомбинантные вирусы. Белок полиэдрин, который продуцируется нативным вирусом, продуцируется при очень высоких уровнях в ядрах инфицированных клеток в поздние периоды после вирусного инфицирования. Накопленный белок полиэдрин образует тела включения, которые также содержат уложенные в них частицы. Эти тельца включения, размером до 15 являются высокопреломляющими свет, что придает им яркий блестящий вид, который легко визуализируется под световым микроскопом. Клетки, инфицированные рекомбинантными вирусами, не имеют телец включения. Для отличения рекомбинантного вируса от вируса дикого типа супернатант после трансфекции наносят в виде пятен на монослой клеток насекомых способами, известными специалистам в данной области. А именно, бляшки подвергают скринингу под световым микроскопом на присутствие (являющееся признаком вируса дикого типа) или отсутствие (являющееся признаком рекомбинантного вируса) телец включения. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel et al. eds) at 16.8 (Suppl. 10, 1990); Summers and Smith, выше; Miller et al. (1989).

Рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы были разработаны для инфицирования в некоторых клетках насекомых. Например, рекомбинантные бакуловирусы были разработаны для, помимо прочего: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni (WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; и см. в общем, Fraser, et al., (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Клетки и среды для культур клеток являются коммерчески доступными как для прямой, так и для гибридной экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной системе экспрессии; технология культуры клеток в общем известна специалистам в данной области. См., например. Summers and Smith, выше.

Затем модифицированные клетки насекомых могут выращиваться в подходящей питательной среде, которая позволяет стабильное поддержание плазмиды (плазмид), присутствующих в модифицированном насекомом-хозяине. Если ген продукта экспрессии находится под индуцируемым контролем, хозяин может выращиваться до высокой плотности и затем экспрессию индуцируют. Альтернативно, если экспрессия является конститутивной, продукт будет непрерывно экспрессироваться в среду и питательная среда должна постоянно циркулироваться, удаляя представляющий интерес продукт и увеличивая количество истощаемых питательных веществ. Продукт может быть очищен такими способами, как хроматография, например, ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионообменная хроматография и т.д.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителями или т.п. В случае необходимости, продукт может быть дополнительно очищен, если требуется, с тем, чтобы удалить по существу любые белки насекомого, которые также секретируются в среду или происходят из лизиса клеток насекомых, с тем, чтобы получить продукт, который по существу не содержит по меньшей мере клеточного дебриса хозяина, например, белков, липидов и полисахаридов.

Для получения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, полученные из трансформантов, инкубируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию кодирующей рекомбинантный белок последовательности. Эти условия будут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако, эти условия могут быть легко определены специалистами в данной области на основе того, что известно в данной области.

iii. Растительные системы

Существует много генетических экспрессионных систем с использованием культуры клеток растений и целого растения, известных в данной области. Примеры генетических экспрессионных систем с использованием клеток растений включают системы, описанные в патентах, таких как: патент США US 5693506; патент США US 5659122, патент США US 5608143. Дополнительные примеры генетической экспрессии в культуре клеток растений были описаны Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Описания сигнальных пептидов белков растений могут быть найдены, кроме ссылок, описанных выше, в Vaulcombe et al., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler et al., Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein et al., Gene 55:353-356 (1987); Whittier et al., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel et al.. Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu et al., Gene 122:247-253 (1992). Описание регуляции экспрессии генов растений фитогормоном, гибберелловой кислотой и секретируемыми ферментами, индуцируемыми гибберелловой кислотой, можно найти в R.L. Jones and J. MacMillin, Gibberellins: in: Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. Ссылки, которые описывают другие метаболически регулируемые гены: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990); Maas et al., EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel and Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:1337-1339 (1987).

Обычно, с использованием способов, известных в данной области, желаемую полинуклеотидную последовательность встраивают в экспрессионную кассету, содержащую генетические регуляторные элементы, сконструированные для функционирования в растениях. Экспрессионную кассету вставляют в желаемый экспрессирующий вектор с вспомогательными последовательностями против хода транскрипции и по ходу транскрипции от этой экспрессионной кассеты, пригодными для экспрессии в растении-хозяине. Эти вспомогательные последовательности имеют плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивают необходимые характеристики вектору для создания возможности этим векторам перемещать ДНК из исходного клонирующего хозяина, такого как бактерии, в желательное растение-хозяин. Основная конструкция бактериального/растительного вектора будет предпочтительно обеспечивать прокариотическую точку начала репликации широкого круга хозяев; прокариотический селектируемый маркер и, для трансформаций с использованием Agrobacterium, Т-ДНК-последовательности для опосредованного Agrobacterium переноса в хромосомы растений. Если гетерологичный ген не поддается легко детектированию, эта конструкция будет предпочтительно иметь также ген селектируемого маркера, пригодный для определения, трансформировано ли растение. Общий обзор подходящих маркеров, например, для членов семейства злаковых, можно найти в Wilmink and Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr, 11 (2):165-185.

Рекомендуются также последовательности, подходящие для интеграции гетерологичной последовательности в геном растений. Они могут содержать последовательности транспозонов и т.п. для гомологичной рекомбинации, а также Ti-последовательности, которые делают возможной случайное встраивание гетерологичной экспрессионной кассеты в геном растения. Подходящие прокариотические селектируемые маркеры включают гены устойчивости к антибиотикам, таким как ампициллин или тетрациклин. Другие ДНК-последовательности, кодирующие дополнительные функции, могут также присутствовать в векторе, как это известно в данной области. Молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть включены в экспрессионную кассету для экспрессии представляющего интерес белка (представляющих интерес белков). Обычно, это будет только одна экспрессионная кассета, хотя возможными являются две или более кассет. Рекомбинантная экспрессионная кассета будет содержать, кроме последовательностии, кодирующей рекомбинантный белок, следующие элементы: промоторный участок, 5'-нетранслируемые последовательности растения, инициирующий кодон, зависящий от того имеет ли структурный ген этот участок, и последовательность терминации транскрипции и трансляции. Уникальные сайты рестрикционных ферментов на 5'- и 3'-концах этой кассеты делают возможным легкое встраивание в заранее существующий вектор.

Гетерологичная кодирующая последовательность может быть любым белком, относящимся к данному изобретению. Последовательность, кодирующая представляющий интерес белок, будет кодировать сигнальный пептид, который делает возможными процессинг и транслокацию данного белка, если это необходимо, и обычно не будет содержать последовательности, которая может привести к связыванию желаемого белка данного изобретения с мембраной. Поскольку, преимущественно, участок инициации транскрипции будет функционировать для гена, который экспрессируется и транслоцируется во время прорастания, с использованием сигнального пептида, который обеспечивает транслокацию, можно также обеспечить транслокацию представляющего интерес белка. Таким образом представляющий интерес белок (белки) будет транслоцироваться из клеток, в которых он экспрессируется, и может быть эффективно собран. Обычно секреция в семенах происходит через алейроновый слой и слой щитка в эндосперм семени. Хотя и не является обязательным, чтобы этот белок секретировался из клеток, в которых данный белок продуцируется, это облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.

Поскольку окончательная экспрессия желаемого генного продукта будет происходить в эукариотической клетке, желательно определить, содержит ли какая-либо часть клонированного гена последовательности, которые будут процессироваться в виде интронов аппаратом сплайсосом хозяина. Если это так, может быть проведен сайт-направленный мутагенез "интронного" участка для предупреждения потери части генетической матрицы в виде ложного интронного кода, Reed and Maniatis, Cell 41:95-105, 1985.

Вектор может быть микроинъецирован непосредственно в растительные клетки с использованием микропипеток для механического переноса рекомбинантной ДНК. Crossway, Moi. Gen. Genet, 202:179-185, 1985. Генетический материал может быть также перенесен в растительную клетку с использованием полиэтиленгликоля, Krens, et al., Nature, 296, 72-74, 1982. Другим способом введения сегментов нуклеиновых кислот является высокоскоростное баллистическое проникновение малых частиц с нуклеиновой кислотой либо в матриксе небольших гранул или частиц, либо на поверхности, Klein, et al., Nature, 327, 70-73, 1987 и Knudsen and Muller, 1991, Planta, 185:330-336, описывающие бомбардировку частицами эндосперма ячменя для создания трансгенного ячменя. Еще одним способом введения могло бы быть слияние протопластов с другими компонентами, либо миниклетками, клетками, лизосомами, либо другими способными к слиянию тельцами, имеющими липиды на поверхности, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.

Вектор может быть также введен в растительные клетки электропорацией. (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824, 1985). В этом способе, протопласты растений электропорируют в присутствии плазмид, содержащих генную конструкцию. Электрические импульсы поля с высокой напряженностью делают биомембраны обратимо проницаемыми, что позволяет вводить эти плазмиды. Электропорированные растительные протопласты восстанавливают клеточную стенку, делятся и образуют растительный каллус.

Все растения, из которых протопласты могут быть выделены и культивированы для получения целых регенерированных растений, могут быть трансформированы согласно данному изобретению таким образом, что образуются целые растения, которые содержат перенесенный ген. Известно, что практически все растения могут быть регенерированы из культивируемых клеток или тканей, в том числе, но не только, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых и овощных культур. Некоторые подходящие растения включают, например, виды из родов Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hererocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum и Datura.

Способы регенерации варьируются от вида к виду растений, но обычно сначала обеспечивают суспензию трансформированных протопластов, содержащих копии гетерологичного гена. Образуется каллусная ткань и проростки могут быть введены из каллуса и затем они укореняются. Альтернативно, из суспензии протопластов может быть индуцировано образование зародышей. Эти зародыши прорастают как природные зародыши с образованием растений. Культуральные среды обычно будут содержать различные аминокислоты и гормоны, такие как ауксин и цитокинины. Предпочтительно также добавление к среде глутаминовой кислоты и пролина, особенно для таких видов, как кукуруза и люцерна. Проростки и корни обычно развиваются одновременно. Эффективная регенерация будет зависеть от среды, от генотипа и от истории культуры. Если эти три переменные контролируются, то регенерация будет полностью воспроизводимой и повторяемой.

В некоторых системах культур клеток растений, желаемый белок данного изобретения может экскретироваться, или, альтернативно, этот белок может быть экстрагирован из целого растения. Если желаемый белок данного изобретения секретируется в среду, он может быть собран. Альтернативно, зародыши и не содержащие зародышей половинки семян или другие растительные ткани могут быть механически разрушены для высвобождения всего секретируемого белка между клетками и тканями. Эта смесь может быть суспендирована в буферном растворе для извлечения растворимых белков. Затем используют общепринятые способы выделения и очистки для очистки рекомбинантного белка. Параметры времени, температуры, рН, кислорода и объемов корректируют посредством рутинных способов для оптимизации экспрессии и выделения гетерологичного белка.

iv. Бактериальные системы

Способы бактериальной экспрессии известны в данной области. Бактериальным промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать в направлении хода транскрипции (3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь участок инициации транскрипции, который обычно расположен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности. Этот участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы и сайт инициации транскрипции. Бактериальный промотор может также иметь второй домен, называемый оператором, который может перекрываться с соседним сайтом связывания РНК-полимеразы, при котором начинается синтез РНК. Оператор делает возможной негативно регулируемую (индуцируемую) транскрипцию, так как белок-репрессор гена может связывать оператор и тем самым ингибировать транскрипцию конкретного гена. Конститутивная экспрессия может происходить в отсутствие негативных регуляторных элементов, таких как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может быть достигнута посредством последовательности, связывающей белок-активатор гена, который, если он присутствует, находится обычно проксимально (5') относительно связывающей РНК-полимеразу последовательности. Примером белка-активатора гена является катаболический активаторный белок (CAP), который споособствует инициации транскрипции оперона lac в Escherichia coli (E.coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. Таким образом, регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, посредством этого либо усиливающей, либо снижающей транскрипцию.

Последовательности, кодирующие ферменты метаболического пути, представляют особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают промоторные последовательности, полученные из ферментов, метаболизирующих сахара, такие как галактоза, лактоза (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056] и мальтоза. Дополнительные примеры включают промоторные последовательности, полученные из биосинтетических ферментов, такие как триптофан (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; US patent 4738921; ЕР-А-0036776 и ЕР-А-0121775]. Промоторная система g-лактамазы (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (ed. I. Grosser)], промоторные системы бактериофага лямбда PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] и промоторная система Т5 [патент США US 4689406] также представляют применимые промоторные последовательности.

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве бактериальных промоторов. Например, последовательности активации транскрипции одного бактериального промотора или промотора бактериофага могут быть соединены с последовательностями оперона другого бактериального промотора или промотора бактериофага с образованием синтетического гибридного промотора [патент США 4551433]. Например, промотор tac является гибридным trp-lac-промотором, состоящим как из последовательностей промотора trp, так и оперона lac, который регулируется репрессором lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Кроме того, бактериальный промотор может включать природно встречающиеся промоторы не-бактериального происхождения, которые способны связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Природно встречающийся промотор не-бактериального происхождения может быть также связан с совместимой РНК-полимеразой для продуцирования высоких уровней экспрессии некоторых генов в прокариотах. Система РНК-полимераза бактериофага Т7/промотор является примером сопряженной промоторной системы [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Кроме того, гибридный промотор может быть также составлен из промотора бактериофага и операторного участка Е.coli (EPO-A-0267851).

Кроме функционирования промоторной последовательности, эффективный сайт связывания рибосом также применим для экспрессии чужеродных генов в прокариотах. В Е.coli сайт связывания рибосом называют последовательностью Шайна-Далгарно (SD), и он включает инициирующий кодон (ATG) и последовательность длиной 3-9 нуклеотидов, расположенной на 3-11 нуклеотидов слева (против хода транскрипции) от инициирующего кодона [Shine et al. (1975) Nature 254:34]. Считается, что SD-последовательность стимулирует связывание мРНК с рибосомой посредством спаривания оснований между SD-последовательностью и 3'-концом рРНК 16S Е.coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F.Goldberger)]. В отношении экспрессии эукариотических генов и прокариотических генов со слабым сайтом связывания рибосом см. [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с ДНК-молекулой, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце всегда будет метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубацией in vitro с цианогенбромидом или инкубацией in vivo или in vitro с бактериальной метионин-N-концевой-пептидазой (ЕРО-А-0219237).

Слитые белки обеспечивают альтернативу прямой экспрессии. Обычно, ДНК-последовательность, кодирующую N-концевую часть эндогенного бактериального белка или другой стабильный белок, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. При экспрессии, эта конструкция будет обеспечивать слияние двух аминокислотных последовательностей. Например, ген клетки бактериофага лямбда может быть связан на 5'-конце чужеродного гена и экспрессироваться в бактериях. Полученный слитый белок предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (фактора Ха) для отщепления белка бактериофага от чужеродного гена [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. Слитые (гибридные) белки могут быть также изготовлены с последовательностями из генов lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:197], trpE [Alien et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11] и Chey {EP-A-0324647]. Последовательность ДНК в месте соединения двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. Другим примером является слитый белок убихитина. Такой слитый белок готовят с участок участком убихитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, специфической для убихитина процессирующей протеазы) для отщепления убихитина от чужеродного белка. С использованием этого способа нативный чужеродный белок может быть выделен [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7:698].

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента сигнальной пептидной последовательности, которая обеспечивает секрецию чужеродного белка в бактериях [патент США US 4336336]. Фрагмент сигнальной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые регулируют секрецию этого белка из клетки. Этот белок секретируется либо в среду для выращивания (в случае грамположительных бактерий), либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и наружной мембранами клетки (в случае грамотрицательных бактерий). Предпочтительно, имеются сайты процессинга, которые могут расщепляться in vivo или in vitro, кодируемые между фрагментом сигнального пептида и чужеродным геном.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых бактериальных белков, таких как ген белка наружной мембраны Е.coli (ompA) [Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] и сигнальной последовательности щелочной фосфатазы Е.coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212]. В качестве дополнительного примера, сигнальная последовательность гена альфа-амилазы из различных штаммов Bacillus может быть использована для секреции гетерологичных белков из В. subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0244042].

Обычно последовательности терминации транскрипции, узнаваемые бактериями, являются регуляторными участками, расположенными 3' (справа) относительно стоп-кодона трансляции, и таким образом они вместе с промотором фланкируют кодирующую последовательность. Эти последовательности направляют транскрипцию мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Последовательности терминации транскрипции часто включают ДНК-последовательности из приблизительно 50 нуклеотидов, способные к образованию структур типа "стебель-петля", которые способствуют терминации транскрипции. Примеры включают последовательности терминации транскрипции, полученные из генов с сильными промоторами, таких как ген trp в Е.coli, а также другие биосинтетические гены.

Обычно описанные выше компоненты, включающие промотор, сигнальную последовательность (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессионные конструкции. Экспрессионные конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, например в бактерии. Репликон может иметь систему репликации, которая позволяет ему сохраняться в прокариотическом хозяине либо для экспрессии, либо для клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может быть плазмидой либо с высокой, либо с низкой копийностью. Плазмида с высоким числом копий будет обычно иметь число копий в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 200 и обычно приблизительно 10 - приблизительно 150. Хозяин, содержащий плазмиду высокой копийности, будет содержать по меньшей мере 10 и более предпочтительно по меньшей мере 20 плазмид. Может быть выбран вектор с высоким или низким числом копий, в зависимости от действия этого вектора и чужеродного белка на хозяина.

Альтернативно, экспрессионные конструкции могут быть интегрированы в бактериальный геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную бактериальной хромосоме, что позволяет этому вектору интегрироваться. Интеграции, по-видимому, происходят вследствие рекомбинаций между гомологичной ДНК в векторе и бактериальной хромосоме. Например, интегрирующие векторы, сконструированные с ДНК из различных штаммов Bacillus, интегрируются в хромосому Bacillus (ЕР-А-0127328). Интегрирующие векторы могут также состоять из последовательностей бактериофага или транспозонов.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессионные конструкции могут содержать селектируемые маркеры для возможности отбора бактериальных штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут экспрессироваться в бактериальном хозяине и могут включать гены, которые делают бактерии устойчивыми к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Селектируемые маркеры могут также включать биосинтетические гены, такие как гены, участвующие в путях биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующие векторы. Трансформирующие векторы обычно содержат селектируемый маркер, который либо сохраняется в репликоне, либо развивается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы, либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации во многие бактерии. Например, экспрессирующие векторы были разработаны для, помимо прочего, следующих бактерий: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 и ЕР-А-0063953; WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; EP-A-0036776, EP-A-0136829 и EP-A-0136907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Micribiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [патент США US 4745056].

Способы введения экзогенной ДНК в бактериальные хозяева хорошо известны в данной области и обычно включают либо трансформацию бактерий, обработанных CaCl₂, либо другими агентами, такими как двухвалентные катионы и ДМСО. ДНК может быть также введена в бактериальные клетки электропорацией. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от бактериальных видов, которые должны быть трансформированы. См., например, [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 and EP-A-0063953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W.Boyer and S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Takelo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacleriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1:412, Streptococcus].

v. Экспрессия в дрожжах

Экспрессионные системы дрожжей также известны специалисту в данной области. Промотором дрожжей является любая последовательность ДНК, способная связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать в направлении хода транскрипции (3') транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь участок инициации транскрипции, который обычно расположен проксимально относительно 5'-конца кодирующей последовательности. Этот участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы ("ТАТА-бокс") и сайт инициации транскрипции. Дрожжевой промотор может также иметь второй домен, называемый правой (3')-активаторной последовательностью (UAS), которая, если она присутствует, обычно расположена дистально относительно структурного гена. UAS делает возможной регулируемую (индуцируемую) экспрессию. Конститутивная экспрессия происходит в отсутствие UAS. Регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, вследствие этого либо усиливающей, либо понижающей транскрипцию.

Дрожжи являются ферментирующимся организмом с активным метаболическим путем, поэтому последовательности, кодирующие ферменты в этом метаболическом пути, представляют особенно применимые промоторные последовательности. Примеры включают алкогольдегидрогеназу (ADH) (ЕР-А-0284044), енолазу, глюкокиназу, глюкозо-6-фосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAP или GAPDH), гексокиназу, фосфофруктокиназу, 3-фосфоглицератмутазу и пируваткиназу (РуК) (ЕРО-А-0329203). Ген РНO5 дрожжей, кодирующий кислую фосфатазу, также представляет применимые промоторные последовательности [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1].

Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве дрожжевых промоторов. Например, последовательности UAS одного дрожжевого промотора могут быть соединены с участком активации транскрипции другого дрожжевого промотора с образованием синтетического гибридного промотора. Примеры таких гибридных промоторов включают регуляторную последовательность ADH, связанную с участком активации транскрипции GAP (патенты США US 4876197 и 4880734). Другие примеры гибридных промоторов включают промоторы, которые состоят из регуляторных последовательностей генов ADH2, GAL4, GAL10 или РНO5, объединенных с районом активации транскрипции гена гликолитического фермента, такого как GAP или РуК (ЕР-А-0164556). Кроме того, дрожжевой промотор может включать природно встречающиеся промоторы не-дрожжевого происхождения, которые способны связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Примеры таких промоторов включают, помимо прочего, [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff el al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis and A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109].

Молекула ДНК может экспрессироваться внутриклеточно в дрожжах. Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с ДНК-молекулой, и в этом случае первой аминокислотой на N-конце всегда будет метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. Если желательно, метионин на N-конце может быть отщеплен от белка инкубацией in vitro с цианогенбромидом.

Слитые белки обеспечивают альтернативу дрожжевым экспрессионным системам, так же как в случае экспрессионных систем млекопитающих, бакуловирусных и бактериальных систем. Обычно, ДНК-последовательность, кодирующую N-концевую часть эндогенного дрожжевого белка или другой стабильный белок, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. При экспрессии, эта конструкция будет обеспечивать слияние двух аминокислотных последовательностей. Например, ген супероксиддисмутазы (SOD) дрожжей или человека может быть связан на 5'-конце чужеродного гена и экспрессироваться в дрожжах. Последовательность ДНК в месте соединения двух аминокислотных последовательностей может кодировать или может не кодировать сайт расщепления. См., например, ЕР-А-0196056. Другим примером является слитый белок убихитина. Такой слитый белок получают с участком убихитина, который предпочтительно сохраняет сайт для процессирующего фермента (например, специфической для убихитина процессирующей протеазы) для отщепления убихитина от чужеродного белка. Таким образом, с использованием этого способа нативный чужеродный белок может быть выделен (например, WO 88/024066).

Альтернативно, чужеродные белки могут также секретироваться из клетки в среду для выращивания посредством создания химерных молекул ДНК, которые кодируют слитый белок, состоящий из фрагмента лидерной последовательности, который обеспечивает секрецию чужеродного белка в дрожжах. Предпочтительно, имеются сайты процессинга между лидерным фрагменток и чужеродным геном, которые могут расщепляться in vivo или in vitro. Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые регулируют секрецию этого белка из клетки.

ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть получены из генов для секретируемых дрожжевых белков, таких как ген инвертазы дрожжей (ЕР-А-0012873; JPO 62096086) и ген А-фактора (патент США US 4588684). Альтернативно, существует лидеры не-дрожжевого происхождения, такие как лидер интерферона, которые также обеспечивают секрецию в дрожжах (ЕР-А-0060057).

Предпочтительным классом секретирующих лидеров являются лидерные последовательности, которые используют фрагмент гена альфа-фактора дрожжей, который содержит как "пре"-сигнальную последовательность, так и "про"-участок. Типы фрагментов альфа-фактора, которые могут быть использованы, включают полноразмерный пре-про-лидер альфа-фактора (приблизительно 83 аминокислотных остатка), а также укороченные лидеры альфа-фактора (обычно приблизительно 25-50 аминокислотных остатков) (патенты США US 4546083 и 4870008; ЕР-А-0324274). Дополнительные лидеры, использующие фрагмент лидера альфа-фактора, который обеспечивает секрецию, включают гибридные лидеры альфа-фактора, полученные с пре-последовательностью первых дрожжей, но с про-участком из альфа-фактора других дрожжей (например, см. WO 89/02463).

Обычно последовательности терминации транскрипции, узнаваемые дрожжами, являются регуляторными участками, расположенными 3' (справа) относительно стоп-кодона трансляции, и таким образом они вместе с промотором фланкируют кодирующую последовательность. Эти последовательности направляют транскрипцию мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примерами последовательности терминации транскрипции и других узнаваемых дрожжами последовательностей терминации транскрипции являются последовательности, кодирующие гликолитические ферменты.

Обычно описанные выше компоненты, включающие промотор, лидер (если желательно), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессионные конструкции. Экспрессионные конструкции часто сохраняются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способном к стабильному сохранению в хозяине, например, в дрожжах или бактерии. Репликон может иметь две системы репликации, что, следовательно, позволяет ему сохраняться, например, в дрожжах для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Примеры таких челночных векторов дрожжи-бактерии включают YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17-24], pCl/1 [Brake et al. (1984) PNAS USA 81:4642-4646] и Yrp17 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Кроме того, репликон может быть плазмидой либо с высокой, либо с низкой копийностью. Плазмида с высоким числом копий будет обычно иметь число копий в диапазоне от приблизительно 5 до 200 и обычно от приблизительно 10 до 150. Хозяин, содержащий плазмиду высокой копийности, будет предпочтительно содержать по меньшей мере 10 и более предпочтительно по меньшей мере 20 плазмид. Может быть выбран вектор с высоким или низким числом копий, в зависимости от влияния этого вектора и чужеродного белка на хозяина. См., например. Brake et al., выше.

Альтернативно, экспрессионные конструкции могут быть интегрированы в дрожжевой геном интегрирующим вектором. Интегрирующие векторы обычно содержат по меньшей мере одну последовательность, гомологичную дрожжевой хромосоме, что позволяет этому вектору интегрироваться, и предпочтительно содержат две гомологичные последовательности, фланкирующие эту экспрессионную конструкцию. Интеграции, по-видимому, происходят вследствие рекомбинаций между гомологичной ДНК в векторе и дрожжевой хромосоме [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Интегрирующий вектор может быть направлен на специфический локус в дрожжах посредством выбора подходящей гомологичной последовательности для включения в вектор. См. Orr-Weaver et al., выше. Могут интегрироваться одна или более экспрессионных конструкций, возможно, влияя на уровни продуцируемого рекомбинантного белка [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750]. Хромосомные последовательности, включенные в вектор, могут встречаться либо в виде единственного сегмента в этом векторе, что приводит к интеграции всего вектора, либо в виде двух сегментов, гомологичных смежным сегментам в хромосоме и фланкирующих экспрессионную конструкцию в этом векторе, что может приводить к стабильной интеграции только этой экспрессионной конструкции.

Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессионные конструкции могут содержать селектируемые маркеры для возможности отбора дрожжевых штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут включать биосинтетические гены, которые могут экспрессироваться в дрожжевых клетках-хозяевах, такие как ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, и ALG7 и ген устойчивости G418, которые придают дрожжевым клеткам устойчивость к туникамицину и G418, соответственно. Кроме того, подходящий селектируемый маркер может также обеспечивать дрожжи способностью расти в присутствии токсичных соединений, таких как металлы. Например, присутствие CUP1 позволяет дрожжам расти в присутствии ионов меди [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51:351].

Альтернативно, некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в трансформирующие векторы. Трансформирующие векторы обычно содержат селектируемый маркер, который либо сохраняется в репликоне, либо развивается в интегрирующий вектор, как описано выше.

Экспрессирующие и трансформирующие векторы, либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации во многие дрожжи. Например, экспрессирующие векторы были разработаны для, помимо прочего, следующих дрожжей: Candida albicans [Kuriz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, el al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158-1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourl et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; US Patent Nos. 4837148 and 4929555}, Saccharomyces cerevisiae [Hinnen el al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706), and Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10:49].

Способы введения экзогенной ДНК в дрожжевые хозяева хорошо известны в данной области и обычно включают либо трансформацию сферопластов, либо трансформацию интактных дрожжевых клеток, обработанных катионами щелочных металлов. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от видов дрожжей, которые должны быть трансформированы. См., например, [Kurtz el al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:11165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces], [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; US Patent Nos. 4837148 and 4929555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75;1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163 Saccharomyces]; [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow el al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49, Yarrowia].

Антитела

В применении здесь, термин "антитела" относится к полипептиду или группе полипептидов, состоящей из по меньшей мере одного антигенсвязывающего центра антитела (антидетерминанты). "Антигенсвязывающий центр" является трехмерным связывающим пространством с внутренней конфигурацией поверхности и распределением зарядов, комплементарными признакам эпитопа антигена, что позволяет связывание антитела с антигеном. "Антитело" обозначает, например, антитела позвоночных, гибридные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, измененные антитела, неполные (моновалентные) антитела, Fab-белки и антитела с единственным доменом.

Антитела против белков данного изобретения применимы для аффинной хроматографии, иммуноанализов и отличения/идентификации менингококкового белка.

Антитела к белкам данного изобретения, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены общепринятыми способами. В общем виде, белок сначала используют для иммунизации подходящего животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики и козы являются предпочтительными для получения поликлональных сывороток вследствие объема получаемой сыворотки и доступности меченых анти-кроличьих и анти-козьих антител. Иммунизацию обычно выполняют смешиванием или эмульгированием белка в солевом растворе, предпочтительно в адъюванте, таком как полный адъювант Фрейнда, и инъекцией этой смеси или эмульсии парентерально (обычно подкожно или внутримышечно). Обычно достаточной является доза на инъекцию. Иммунизацию обычно повторяют спустя 2-6 недель с одной или более инъекциями данного белка в солевом растворе, предпочтительно с использованием неполного адъюванта Фрейнда. Альтернативно можно генерировать антитела иммунизацией in vitro с использованием способов, известных в данной области, которые считаются для целей данного изобретения эквивалентными иммунизации in vivo. Поликлональные антисыворотки получают путем забора крови у иммунизированных животных в стеклянный или пластиковый контейнер, инкубированием крови при 25°С в течение одного часа с последующей инкубацией при 4°С в течение 2-18 часов. Сыворотку извлекают центрифугированием (например, 1000 g в течение 10 минут). У кроликов можно получать 20-50 мл на один забор крови.

Моноклональные антитела получают с использованием стандартного способа Kohler & Millstein [Nature (1975) 256:495-96] или его модификации. Обычно, мышь или кролика иммунизируют, как описано выше. Однако, предпочтительнее забор крови у животного для экстракции сыворотки не выполняют, а удаляют селезенку (и в случае необходимости крупные лимфатические узлы) и разрушают на отдельные клетки. Если желательно, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления неспецифически прилипших клеток) нанесением суспензии клеток на чашку или лунку, покрытую белковым антигеном. В-клетки, экспрессирующие мембраносвязанный иммуноглобулин, специфический для антигена, связываются с этой чашкой и не вымываются с остальной суспензией. Затем полученные В-клетки или все клетки разрушенной селезенки индуцируют для слияния с миеломными клетками с образованием гибридом и культивируют в селективной среде (например, содержащей гипоксантин, аминоптерин, тимидин среде, "HAT"). Полученные гибридомы высевают по способу лимитирующего (предельного) разведения и анализируют на продуцирование антител, которые специфически связываются с иммунизирующим антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Затем отобранные mAb-секретирующие гибридомы культивируют in vitro (например, в культуральных флаконах для ткани или реакторах с полыми волокнами) или in vivo (в виде асцитов в мышах).

Если желательно, антитела (поликлональные или моноклональные) могут быть помечены с использованием общепринятых способов. Подходящие метки включают флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы (в частности, ³²P и ¹²⁵I), электроноплотные реагенты, ферменты и лиганды, имеющие партнеров специфического связывания. Ферменты детектируют обычно по их активности. Например, пероксидазу хрена обычно детектируют по ее способности превращать 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, определяемый количественно при помощи спектрофотометра. "Партнером специфического связывания" называют белок, способный связывать молекулу-лиганд с высокой специфичностью, как например, в случае антигена и специфического для него моноклонального антитела. Другие партнеры специфического связывания включают биотин и авидин или стрептавидин, IgG и белок А и многочисленные пары рецептор-лиганд, известные в данной области. Должно быть понятно, что приведенное выше описание не предназначается для распределения многочисленных меток на четко определенные классы, так как одна и та же метка может служить в нескольких различных механизмах действия. Например, ¹²⁵ I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве электроноплотного реагента. HRP (пероксидаза хрена) может служить в качестве фермента или в качестве антигена для mAb. Далее, можно объединять различные метки для желательного эффекта. Например, mAb и авидин также требуют меток для осуществления данного изобретения: так, можно пометить mAb биотином и детектировать их присутствие авидином, меченым ¹²⁵I, или моноклональными антителами против биотина, мечеными HRP. Другие перестановки и возможности будут вполне очевидными для специалистов в данной области и рассматриваются как эквиваленты в рамках данного изобретения.

Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции могут содержать либо полипептиды, антитела, либо нуклеиновую кислоту данного изобретения. Фармацевтические композиции будут содержать терапевтически эффективное количество либо полипептидов, антител, либо полинуклеотидов данного изобретения.

Термин "терапевтически эффективное количество" в применении здесь обозначает количество терапевтического агента для лечения, ослабления или профилактики рассматриваемого заболевания или состояния или для проявления терапевтического или профилактического действия. Это действие может быть обнаружено, например, посредством химических маркеров или уровней антигенов. Терапевтические эффекты включают также уменьшение физических симптомов, таких как уменьшение температуры тела. Точное эффективное количество для субъекта будет зависеть от размера и здоровья субъекта, характера и степени состояния и терапевтических средств или комбинации терапевтических средств, выбранных для введения. Таким образом, нет смысла определять точное количество заранее. Однако эффективное количество для конкретной ситуации может быть определено рутинным экспериментированием и находится в пределах возможности оценки лечащим врачом.

Для целей данного изобретения эффективная доза будет находиться между приблизительно 0,01 мг/кг и 50 мг/кг или 0,05 мг/кг и приблизительно 10 мг/кг конструкций ДНК в индивидууме, которому она вводятся.

Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" обозначает носитель для введения терапевтического агента, такого как антитела или полипептид, гены и другие терапевтические агенты. Этот термин относится к любому фармацевтическому носителю, который сам не индуцирует образования антител, вредных для индивидуума, принимающего эту композицию, и который может вводиться без нежелательной токсичности. Подходящими носителями могут быть большие, медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области.

В них могут использоваться фармацевтически приемлемые соли, например, минеральные соли, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. В таких носителях могут дополнительно присутствовать вспомогательные вещества, например, увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферящие рН вещества и т.п. Обычно, эти терапевтические композиции готовят в виде инъекционных растворов, в виде жидких растворов или суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. В определение фармацевтически приемлемый носитель включены также липосомы.

Способы доставки

После приготовления композиции данного изобретения могут вводиться непосредственно субъекту. Подлежащими лечению субъектами могут быть животные, в частности, могут лечиться люди.

Прямую доставку композиций данного изобретения обычно выполняют посредством инъекции, подкожно, внутрибрюшинно, внутивенно или внутримышечно, или доставкой в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут также вводиться в повреждение. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные или чрескожные введения (например, см. WO 98/20734), при помощи игл, генных ружей или гипоспреев. Дозированное лечение может быть схемой введения отдельной дозы или схемой введения множественных доз.

Вакцины

Вакцины в соответствии с данным изобретением могут быть либо профилактическими (т.е. для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е. для лечения заболевания после инфицирования).

Такие вакцины содержат иммунизирующий антиген (антигены), иммуноген (иммуногены), полипептид (полипептиды), белок (белки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с "фармацевтически приемлемыми носителями", которые включают любой носитель, который сам не индуцирует образования антител, вредных для индивидуума, принимающего эту композицию. Подходящими носителями могут быть большие, медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры, липидные агрегаты (такие как масляные капли или липосомы) и неактивные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области. Кроме того, эти носители могут функционировать как иммуностимулирующие агенты ("адъюванты"). Кроме того, антиген или иммуноген могут быть конъюгированы с бактериальным токсином, например, токсоидом из дифтерийного, столбнячного, холерного, Н. pylori и других патогенов.

Предпочтительные адъюванты для усиления эффективности композиции включают, но не ограничиваются ими: (1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.д.; (2) эмульсионные композиции типа масло в воде (с другими специфическими иммуностимулирующими агентами, такими как мурамилпептиды (см. ниже) или компоненты стенок бактериальных клеток, или без них), такие как, например, (a) MF59™ (WO 90/14837; Chapter 10 in Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell and Newman, Plenum Press 1995), содержащий 5% сквален, 0,5% Твин 80 и 0,5% Span 85 (необязательно содержащий различные количества МТР-РЕ (см. ниже), хотя это не является обязательным), приготовленный в виде субмикронных частиц при помощи микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, содержащий 10% сквален, 0,4% Твин 80, 5% плуроник-блокированный полимер L121, и thr-MDP (см. ниже), либо микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, либо обработанный вортексом для получения эмульсии с частицами большего размера, и (с) система адъюванта Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 2% сквален, 0,2% Твин 80 и один или более компонентов стенок бактериальных клеток из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), трегалозодимиколата (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (Detox™); (3) сапониновые адъюванты, такие как Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), могут быть использованы, или частицы, полученные из них, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); (4) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (5) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и т.д.), интерфероны (например, гамма-интерферон), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-GSF), фактор некроза опухолей (TNF), и т.д.; и (6) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие агенты для усиления эффективности композиции. Предпочтительными являются MF59™ и квасцы.

Как упоминалось выше, мурамилпептиды включают, но не ограничиваются ими, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамиинил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), и т.д.

Иммуногенные композиции (например, иммунизирующий антиген/иммуноген/полипептид/белок/нуклеиновая кислота, фармацевтически приемлемый носитель и адъювант) обычно должны содержать разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин, этанол и т.д. В таких носителях могут дополнительно присутствовать вспомогательные вещества, например увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферящие рН вещества и т.п.

Обычно эти иммуногенные композиции готовят в виде инъекционных растворов, в виде либо жидких растворов, либо суспензий; могут быть также приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат может быть также эмульгирован или инкапсулирован в липосомах для усиленного адъювантного эффекта, как обсуждалось выше в отношении фармацевтически приемлемых носителей.

Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигенных или иммуногенных полипептидов, а также любые другие вышеуказанные компоненты, в случае необходимости. Под "иммунологически эффективным количеством" имеют в виду, что введение этого количества индивидууму, в виде единственной дозы или в виде части дозы последовательно, является эффективным для лечения или профилактики. Это количество варьируется в зависимости от состояния здоровья и физического состояния подлежащего лечению индивидуума, таксономической группы подлежащего лечению индивидуума (например, примата нечеловека, примата и т.д.), способности иммунной системы человека к синтезу антител, степени желаемой защиты, состава вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других уместных факторов. Ожидается, что это количество будет находится в относительно широком диапазоне, который может быть определен при помощи рутинных испытаний.

Иммуногенные композиции обычно вводят парентерально, например, инъекцией, подкожно, внутримышечно или трансдермально/чрескожно (например, WO 98/20734). Дополнительные композиции, пригодные для других форм введения, включают пероральные и легочные композиции, суппозиториии и трансдермальные приспособления. Дозированное лечение может быть схемой введения отдельной дозы или схемой введения множественных доз. Вакцина может вводиться в сочетании с другими иммунорегуляторными агентами.

В качестве альтернативы вакцинам на основе белков может быть использована вакцинация ДНК [например, Robinson and Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283; Donelli et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648; см. здесь ниже].

Носители для доставки генов

Носители гемотерапии для доставки конструкций, содержащих кодирующую последовательность терапевтического агента данного изобретения, которая должны быть доставлена в млекопитающее, могут вводиться либо местно, либо системно. Эти конструкции могут использовать подходы с вирусным или невирусным вектором в способах in vivo или ex vivo. Экспрессия такой кодирующей последовательности может быть индуцирована с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности in vivo может быть конститутивной или регулируемой.

Данное изобретение включает носители доставки генов, способные экспрессировать рассматриваемые последовательности нуклеиновых кислот. Носителем доставки генов является предпочтительно вирусный вектор и, более предпочтительно ретровирусный, аденовирусный, аденоассоциированный вирусный (AAV), герпесвирусный или альфавирусный вектор. Вирусным вектором может быть также астровирусный, коронавирусный, ортомиксовирусный, паповавирусный, парамиксовирусный, парвовирусный, пикорнавирусный, поксвирусный или тогавирусный вектор. См., в общем, Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human Gene Therapy 5:845-852; Connely (1995) Human Gene Therapy 6:185-193 и Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153. Ретровирусные векторы хорошо известны в данной области, и авторы изобретения предполагают, что любой вектор ретровирусной генотерапии является применимым в данном изобретении, в том числе ретровирусы типов В, С и D, ксенотропные ретровирусы (например, NZB-X1, NZB-X2 и NZB9-1 (см. O'Neill (1985) J. Virol. 53:160), политропные ретровирусы, например, MCF и MCF-MLV (см. Kelly (1983) J. Virol. 45:291), спумавирусы и лентивирусы. См. RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Части ретровирусного вектора генотерапии могут быть получены из различных ретровирусов. Например, ретровектор LTR может быть произведен из вируса мышиной саркомы, сайта связывания тРНК из вируса саркомы Рауса, сигнала упаковки из вируса мышиного лейкоза и точки начала синтеза второй цепи из вируса лейкоза птиц.

Эти рекомбинантные ретровирусные векторы могут быть использованы для генерирования частиц трансдукционно-компетентного ретровирусного вектора введением их в подходящие упаковывающие клеточные линии (см. патент США US 5591624). Ретровирусные векторы могут быть сконструированы для сайт-специфической интеграции в ДНК клетки-хозяина включением химерного фермента интегразы в эту ретровирусную частицу (см. WO 96/37626). Предпочтительно, чтобы рекомбинантный вирусный вектор был репликационно-дефектным (т.е. дефектным по репликации) рекомбинантным вирусом.

Упаковывающие клеточные линии, пригодные для применения с вышеописанными ретровирусными векторами, хорошо известны в данной области, их легко получить (см. WO 95/30763 и WO 92/05266) и они могут быть использованы для создания линий клеток-продуцентов (также называемых векторными клеточными линиями или "VCL") для получения рекомбинантных векторных частиц. Предпочтительно, упаковывающие клеточные линии готовят из исходных клеток человека (например, клеток НТ1080) или исходных клеточных линий норки, что исключает инактивацию в сыворотке человека.

Предпочтительные ретровирусы для конструирования ретровирусных векторов генотерапии включают вирус лейкоза птиц, вирус бычьего лейкоза, вирус мышиного лейкоза, вирус, индуцирующий очаги в клетках норки, вирус мышиной саркомы, вирус ретикулоэндотелиоза и вирус саркомы Рауса. Особенно предпочтительные вирусы мышиного лейкоза включают 4070А и 1504А (Hartley and Rowe (1976) J Virol 19:19-25), Abelson (ATCC No. VR-999), Friend (ATCC No. VR-245), Graffi, Gross (ATCC No. VR-590), вирус саркомы Kirsten, Harvey и вирус Раушера (вирус эритролейкозов и лимфатических лейкозов мышей) (ATCC No. VR-998) и вирус Молони лейкоза мышей (ATCC No. VR-190). Такие ретровирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как Американская Коллекция типовых культур ("ATCC") в Роквилле, Мериленд, или выделены из известных источников при помощи общедоступных способов.

Примеры известных ретровирусных векторов генотерапии, используемые в данном изобретении, включают векторы, описанные в патентных заявках GB 2200651, ЕР 0415731, ЕР 0345242, ЕР 0334301, WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, WO 91/02825, WO 95/07994, US 5219740, US 4405712, US 4861719, US 4980289, US 4777127, US 5591624. См. также Vile (1993) Cancer Res 53:3860-3864; Vile (1993) Cancer Res 53:962-967; Ram (1993) Cancer Res (1993) 53:83-88; Takamiya (1992) J Neurosci Res 33:493-503; Baba (1993) J Neurosurg 79:729-735; Mann (1983) Cell 33:153; Cane (1984) Proc Nati Acad Sci 81:6349; и Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Аденовирусные векторы для генотерапии человека также известны в данной области и могут быть использованы в данном изобретении. См., например, Berkner (1988) Biotechniques 6:616 и Rosenfeld (1991) Science 252:431 и WO 93/07283, WO 93/06223 и WO 93/07282. Примеры известных векторов аденовирусной генотерапии, используемые в данном изобретении, включают векторы, описанные в цитируемых выше документах и в WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984, WO 95/00655, WO 95/27071, WO 95/29993, WO 95/34671, WO 96/05320, WO 94/08026, WO 94/11506, WO 93/06223, WO 94/24299, WO 95/14102, WO 95/24297, WO 95/02697, WO 94/28152, WO 94/24299, WO 95/09241, WO 95/25807, WO 95/05835, WO 94/18922 и WO 95/09654. Альтернативно, может быть использовано введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154. Примерами носителей доставки генов данного изобретения являются также аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы. Главными и предпочтительными примерами таких векторов для применения в данном изобретении являются векторы на основе AAV-2, описанные в Srivastava, WO 93/09239. Наиболее предпочтительные AAV-векторы содержат два инвертированных концевых повтора AAV, в которых нативные D-последовательности модифицированы заменой нуклеотидов, так что по меньшей мере от 5 природных нуклеотидов и до 18 природных нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере от 10 природных нуклеотидов до 18 природных нуклеотидов, наиболее предпочтительно 10 природных нуклеотидов сохранены, а остальные нуклеотиды D-последовательности делегированы или заменены неприродными нуклеотидами. Природными D-последовательностями инвертированных концевых повторов AAV являются последовательности 20 последовательных нуклеотидов в каждом инвертированном повторе AAV (т.е. имеется одна последовательность на каждом конце), которые не участвуют в образовании HP. Неприродным заменяющим нуклеотидом может быть любой нуклеотид иной, чем нуклеотид, обнаруживаемый в природной D-последовательности в том же самом положении. Другими примерами AAV-векторов являются pWP-19, pWN-1, раскрытые в Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Другим примером такого AAV-вектора является psub201 (см. Samulski (1987) J. Virol. 61:3096. Другим примером AAV-вектора является вектор Double-D ITR. Конструирование вектора Double-D ITR описано в патенте США US 5478745. Другими векторами являются векторы, описанные в патенте США 4797368, выданном Carter, и патенте США 5139941, выданном Muzyczka, патенте США 5474935, выданном Chartejee, и WO 94/288157, Kotin. Еще одним примером AAV-вектора, применяемого в данном изобретении, является SSV9AFABTKneo, который содержит энхансер AFP и промотор альбумина и регулирует экспрессию преимущественно в печени. Его структура и конструирование описаны в Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Дополнительные генотерапевтические AAV-векторы описаны в патентах США US 5354678, US 5173414, US 5139941 и US 5252479.

Генотерапевтические векторы данного изобретения включают также векторы герпеса. Основными и предпочтительными примерами являются векторы на основе вируса простого герпеса, содержащие последовательность, кодирующую полипептид тимидинкиназы, такой как описанный в патенте США US 5288641 и в ЕР 0176170 (Roizman). Дополнительные примеры векторов на основе вируса простого герпеса включают HFEM/ICP-LacZ, описанный в WO 95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, описанный в Geller (1988) Science 241:1667-1669 и в WO 90/09441 и WO 92/07945, HSV Us3::pgC-lacZ, описанный в Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 и HSV 7134, 2 RH 105 и GAL4, описанные в ЕР 0453242 (Breakefield), и векторы, депонированные в АТСС с номерами доступа АТСС VR-977 и АТСС VR-260.

Рассматриваются также генотерапевтические векторы на основе альфавируса, которые могут быть использованы в данном изобретении. Предпочтительными альфавирусными векторами являются векторы на основе вируса лихорадки Синдбис, тогавирусы, вирус лесов Семлики (АТСС VR-67; ATCC VR-1247), вирус Миддлеберга (АТСС VR-370), вирус реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246), Венесуэльский вирус лошадиного энцефалита (АТСС VR-923; АТСС VR-1250; АТСС VR-1249; АТСС VR-532) и векторы, описанные в патентах США US 5091309, 5217879 и WO 92/10578. Более конкретно, могут использоваться векторы на основе альфавируса, описанные в US Serial No. 08/405 627, поданной 15 марта, 1995 года, WO 94/21792, WO 92/10578, WO 95/07994, US 5091309 и US 5217879. Такие альфавирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как Американская Коллекция типовых культур ("АТСС") в Роквилле, Мериленд, или выделены из известных источников при помощи общедоступных способов. Предпочтительно, используются альфавирусные векторы с пониженной цитотоксичностью (см. USSN 08/679640).

Векторные системы ДНК, такие как эукариотические слоистые (layered) экспрессионные системы, также применимы для экспрессии нуклеиновых кислот данного изобретения. См. WO 95/07994 в отношении подробного описания эукариотических слоистых экспрессионных систем. Предпочтительно, эукариотические слоистые экспрессионные системы данного изобретения являются производными альфавирусных векторов и наиболее предпочтительно векторов на основе вируса Синдбис.

Другие вирусные векторы, пригодные для применения в данном изобретении, включают вирусные векторы, полученные из полиовируса, например, АТСС VR-58, и векторы, описанные в Evans, Nature 339 (1989) 385 и Sabin (1973) J. Biol. Standardization 1:115; риновирус, например, АТСС VR-1110, и векторы, описанные в Arnold (1990) J Cell Biochem L401; поксвирусы, такие как вирус оспы канареек или вирус коровьей оспы, например, АТСС VR-111 и АТСС VR-2010, и векторы, описанные в Fisher-Hoch (1989) Proc Natl Acad Sci 86:317; Flexner (1989) Ann NY Acad Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; в патентах США US 4603112 и US 4769330 и WO 89/01973; вирус SV40, например, АТСС VR-305 и векторы, описанные в Mulligan (1979) Nature 277:108 и Madzak (1992) J Gen Virol 73:1533; вирус гриппа, например, АТСС VR-797 и рекомбинантные вирусы гриппа, полученные с использованием способов обратной генетики, как описано в патенте США US 5166057 и в Enami (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:3802-3805; Enami and Palese (1991) J Virol 65:2711-2713 и Luytjes (1989) Cell 59:110, (см. также McMichael (1983) NEJ Med 309:13 и Yap (1978) Nature 273:238 и Nature (1979) 277:108); вирус иммунодефицита человека, описанный в ЕР-0386882 и в Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; вирус кори, например, АТСС VR-67 и VR-1247 и вирусы, описанные в ЕР-0440219; ауравирус, например, АТСС VR-368; вирус Бебару, например, АТСС VR-600 и АТСС VR-1240; вирус Кабассу, например, АТСС VR-922; вирус Чикунгунья, например, АТСС VR-64 и АТСС VR-1241; вирус Форт-Морган, например, АТСС VR-924; вирус Гета, например, АТСС VR-369 и АТСС VR-1243; вирус Кизилагач, например, АТСС VR-927; вирус Майяро, например, АТСС VR-66; вирус Мукамбо, например, АТСС VR-580 и АТСС VR-1244; вирус Ндуму, например, АТСС VR-371; вирус Пиксуна, например, АТСС VR-372 и АТСС VR-1245; вирус Тонате, например, АТСС VR-925; вирус Тринити, например, АТСС VR-469; вирус Уна, например, АТСС VR-374; вирус Уотароа, например, АТСС VR-926; вирус Y-62-33, например, АТСС VR-375; вирус O-Ньонг-Ньонг, вирус Восточного энцефалита, например, АТСС VR-65 и АТСС VR-1242; вирус Западного энцефалита, например, АТСС VR-70, АТСС VR-1251, АТСС VR-622 и АТСС VR-1252; и коронавирус, например, АТСС VR-740 и вирусы, описанные в Hamre (1966) Proc Soc Exp Biol Med 121:190.

Доставка композиций данного изобретения в клетки не ограничивается вышеупомянутыми вирусными векторами. Другие способы и среды доставки могут быть использованы, такие как, например, экспрессионные векторы нуклеиновых кислот, конденсированная поликатионами ДНК, связанная или не связанная с убитым аденовирусом, например, см. US Serial No. 08/366787, поданную 30 декабря 1994 года и Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154, связанная лигандом ДНК, например, см. Wu (1989) J Biol Chem 264:16985-16987, клетки-носители для доставки в эукариотические клетки, например, US Serial No. 08/240030, поданная 9 мая 1994 года, US Serial No. 08/404796, депонирование полимеризуемых под действием света гидрогельных материалов, ручной пистолет для частиц для переноса генов, как описано в патенте США US 5149655, ионизирующее излучение, описанное в патенте США US 5206152 и в WO 92/11033, нейтрализация заряда нуклеиновой кислоты или слияние с клеточными мембранами. Дополнительные подходы описаны в Philip (1994) Mol Cell Biol 14:2411-2418 и в Woffendin (1994) Proc Nati Acad Sci 91:1581-1585.

Может быть использован опосредованный частицами перенос генов, например, см. патент США с регистрационным номером 60/023867. Вкратце, последовательность может быть встроена в общепринятые векторы, которые содержат обычные регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубирована с синтетическими молекулами переноса генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, как описано в Wu and Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432, инсулин, как описано в Hucked (1990) Biochem Pharmacol 40:253-263, галактоза, как описано в Plank (1992) Bioconjugate Chem 3:533-539, лактоза или трансферрин.

Может быть также использована "голая" ДНК. Примеры способов введения "голой" ДНК описаны в WO 90/11092 и патенте США US 5580859. Эффективность поглощения может быть улучшена с использованием биодеградируемых латексных гранул. Покрытые ДНК латексные гранулы эффективно транспортируются в клетки после инициации эндоцитоза этими гранулами. Этот способ может быть улучшен дополнительно обработкой гранул для увеличения гидрофобности и тем самым облегчения разрушения эндосомы и высвобождения ДНК в цитоплазму.

Липосомы, которые могут действовать в качестве носителей генной доставки, описаны в патенте США US 5422120, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 и ЕР 524968. Как описано в USSN 60/023867, при не-вирусной доставке последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид, могут быть введены в обычные векторы, которые содержат обычные регуляторные последовательности для экспрессии высокого уровня, и затем инкубированы с синтетическими молекулами переноса генов, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, такие как полилизин, протамин и альбумин, связанные с нацеливающими на клетки лигандами, такими как асиалоорозомукоид, инсулин, галактоза, лактоза или трансферрин. Другие системы доставки включают применение липосом для инкапсулирования ДНК, содержащей ген под контролем различных тканеспецифических или повсеместно активных промоторов. Дополнительная не-вирусная доставка, пригодная для использования, включает системы механической доставки, такие как в методике, описанной в Woffendin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581-11585. Кроме того, кодирующая последовательность и продукт ее экспрессии могут быть доставлены посредством депонирования полимеризуемых под действием света гидрогельных материалов. Другие традиционные способы доставки генов, которые могут быть использованы для доставки этой кодирующей последовательности, включают, например, применение ручного пистолета для частиц для переноса генов, как описано в патенте США US 5149655, применение ионизирующего излучения, как описанно в патенте США US 5206152 и в WO 92/11033.

Примерами липосомных и поликатионных носителей доставки генов являются носители, описанные в патенте США US 5422120 и 4762915; в WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 и ЕР-0524968; и в Stryer, Biochemistry, pages 236-240 (1975) W.H. Freeman, San Francisco; Szoka (1980) Biochem Biophys Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem Biophys Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth Enzymol 149:119; Wang (1987) Proc Nati Acad Sci 84:7851; Plant (1989) Anal Biochem 176:420.

Полинуклеотидная композиция может содержать терапевтически эффективное количество генотерапевтического носителя, как этот термин определен выше. Для целей данного изобретения, эффективная доза будет равна от приблизительно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг конструкций ДНК в индивидууме, которому ее вводят.

Способы доставки

После приготовления полинуклеотидные композиции данного изобретения могут быть введены (1) непосредственно субъекту; (2) доставлены ex vivo к клеткам, полученным из субъекта; или (3) in vitro для экспрессии рекомбинантных белков. Субъектами, которые должны быть подвергнуты лечению, могут быть млекопитающие или птицы. Могут также быть подвергнуты лечению люди.

Прямую доставку композиций обычно выполняют инъекцией, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно или доставкой в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут также вводиться в повреждение. Другие способы введения включают пероральное и легочное введение, суппозитории и трансдермальные или чрескожные введения (например, см. WO 98/20734), при помощи игл, генных ружей или гипоспреев. Дозированное лечение может быть схемой введения отдельной дозы или схемой введения множественных доз.

Способы для доставки ex vivo и повторной имплантации трансформированных клеток в субъект известны в данной области и описаны, например, в WO 93/14778. Примеры клеток, которые могут быть использованы в применениях ех vivo, включают, например, стволовые клетки, в частности, гемопоэтические, лимфатические клетки, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.

Обычно, доставка нуклеиновых кислот в применениях как ех vivo, так и in vitro может выполняться с использованием следующих процедур, например, опосредованной декстраном трансфекции, кальций-фосфатной преципитации, опосредованной полибреном трансфекции, слияния протопластов, электропорации, инкапсулирования полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и прямой микроинъекции ДНК в ядра, как хорошо известно в данной области.

Полинуклеотидные и полипептидные фармацевтические композиции

Кроме фармацевтически приемлемых носителей и солей, описанных выше, следующие дополнительные агенты могут быть использованы с полинуклеотидными и/или полипептидными композициями.

А. Полипептиды

Одним примером являются полипептиды, которые включают, без ограничения: асиалоорозомукоид (ASOR); трансферрин; асиалогликопротеины; антитела; фрагменты антител; ферритин; интерлейкины; интерфероны; колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрафагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Могут быть также использованы вирусные антигены, такие как белок оболочки, а также белки из других инвазивных организмов, такие как пептид из 17 аминокислот из околоспорозоитного белка Plasmodium falciparum, известный как RII.

В. Гормоны, витамины и т.д.

Другими группами, которые могут быть включены, являются, например, гормоны, стероиды, андрогены, эстрогены, тиреоидный гормон, или витамины, фолиевая кислота.

С. Полиалкилены, полисахариды и т.д.

Полиалкиленгликоль может быть включен с желаемыми полинуклеотидами/полипептидами. В предпочтительном варианте, полиалкиленгликоль является полиэтиленгликолем. Кроме того, могут быть включены моно-, ди- или полисахариды. В предпочтительном варианте этого аспекта, полисахаридом является декстран или ДЭАЭ-декстран, а также хитозан и поли(сополимер лактида и гликолида).

D. Липиды и липосомы

Желаемый полинуклеотид/полипептид может быть также инкапсулирован в липидах или упакован в липосомы перед доставкой субъекту или полученным из него клеткам.

Липидную инкасуляцию выполняют с использованием липосом, которые способны стабильно связывать или улавливать и удерживать нуклеиновую кислоту. Отношение конденсированного полинуклеотида к липидному препарату может варьироваться, но обычно будет около 1:1 (мг ДНК:микромоли липида) или с большим количеством липида. В отношении обзора применения липосом в качестве носителей для доставки нуклеиновых кислот см. Hug and Sleight (1991) Biochim. Biophys. Acta, 1097:1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.

Липосомные препараты для применения в данном изобретении включают катионные (положительно заряженные), анионные (отрицательно заряженные) и нейтральные препараты. Было показано, что катионные липосомы опосредуют внутриклеточную доставку плазмидной ДНК (Felgner (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7416); мРНК (Malone (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6077-6081); и очищенных факторов транскрипции (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192) в функциональной форме.

Катионные липосомы являются легкодоступными. Например, N-[1-2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триэтиламмоний(DOTMA)-липосомы доступны под торговой маркой Липофектин от GIBCO BRL, Grand Island, NY. (См. также Felgner supra). Другие коммерчески доступные липосомы включают трансфектазу (DDAB/DOPE) и DOTAP/DOPE (Boerhinger). Другие катионные липосомы могут быть получены из легкодоступных материалов при помощи способов, хорошо известных в данной области. См., например, Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; WO 90/11092 в отношении описания синтеза DOTAP (1,2-бис(олеилокси)-3-(триметиламмонио)пропан)-липосом.

Подобным образом, анионные и нейтральные липосомы являются легкодоступными, например, от Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), или могут быть получены с использованием легкодоступных материалов. Такие материалы включают фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеилфосфатидилхолин (DOPC), диолеилфосфатидилглицерин (DOPG), диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE), в том числе. Эти материалы могут быть также смешаны с исходными материалами DOTMA и DOTAP в подходящих соотношениях. Способы приготовления липосом из этих материалов известны в данной области.

Липосомы могут содержать многослойные везикулы (MLV), малые однослойные везикулы (SUV) или большие однослойные везикулы (LUV). Различные комплексы липосома-нуклеиновая кислота готовят при помощи способов, известных в данной области. См., например, Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483; Wilson (1979) Cell 17:77); Deamer & Bangham (1976) Biochim. Biophys. Acta 443:629; Ostro (1977) Biochem. Biophys. Res. Commun. 76:836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348); Enoch & Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:145; and Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166.

E. Липопротеины

Кроме того, липопротеины (липопротеиды) могут быть включены с подлежащим доставке полинуклеотидом/полипептидом. Примеры липопротеинов, которые могут быть использованы, включают: хиломикроны, HDL, IDL, LDL и VLDL. Могут быть также использованы мутанты, фрагменты или слияния (гибриды) этих белков. Могут быть также использованы модификации природно встречающихся липопротеинов, таких как LDL. Эти липопротеины могут нацеливать доставку полинуклеотидов в клетки, экспрессирующие рецепторы липопротеинов. Предпочтительно, если липопротеины включаются с полинуклеотидом для доставки, в эту композицию не включают никакого другого нацеливающего лиганда.

Природно встречающиеся липопротеины содержат липидную и белковую часть. Белковая часть называется апопротеином. В настоящее время были выделены и идентифицированы апопротеины А, В, С, D и E. По меньшей мере два из них содержат несколько белков, обозначаемых римскими цифрами, AI, All, AIV; CI, СII, CIII.

Липопротеин может содержать более одного апопротеина.

Например, природно встречающиеся хил омикроны содержат А, В, С и Е, со временем эти липопротеины теряют А и приобретают апопротеины С и Е. VLDL содержит апопротеины А, В, С и Е, LDL содержит апопротеин В; HDL содержит апопротеины А, С и Е.

Аминокислоты этих апопротеинов известны и описаны, например, в Breslow (1985) Annu Rev. Biochem 54:699; Law (1986) Adv. Exp. Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J Biol Chem 261:12918; Kane (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:2465 и Uterman (1984) Hum Genet 65:232.

Липопротеины содержат различные липиды, в том числе, триглицериды, холестерин (свободный и эфиры) и фосфолипиды. Состав липидов варьируется в природно встречающихся липопротеинах. Например, хиломикроны содержат в основном триглицериды. Более подробное описание липидного содержания природно встречающихся липопротеинов может быть найдено, например, в Meth. Enzymol. 128 (1986). Состав липидов выбирают для помощи в создании требуемой конформации апопротеина для рецептор-связывающей активности. Состав липидов может быть также выбран для облегчения гидрофобного взаимодействия и связи с полинуклеотид-связывающей молекулой.

Природно встречающиеся липопротеины могут быть выделены из сыворотки, например, ультрацентрифугированием. Такие способы описаны в Meth. Enzymol. (выше); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 и Mahey (1979) J Clin. Invest 64:743-750. Липопротеины могут быть также получены in vitro или рекомбинантными способами экспрессией генов апопротеинов в желаемой клетке-хозяине. См., например, Atkinson (1986) Annu Rev Biophys Chem 15:403 и Radding (1958) Biochim Biophys Acta 39:443. Липопротеины могут быть также закуплены у коммерческих поставщиков, таких как Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA. Дополнительное описание липопротеинов может быть найдено в Zuckermann et al. WO 98/06437.

F. Поликатионные агенты

Поликатионные агенты, с липопротеином или без липопротеина, могут быть включены в композицию с желаемым полинуклеотидом/полипептидом для доставки.

Поликатионные агенты, обычно, проявляют в целом положительный заряд при физиологическом рН и способны нейтрализовать электрический заряд нуклеиновых кислот для облегчения доставки в желаемое местоположение. Эти агенты могут применяться in vitro, ex vivo и in vivo. Поликатионные агенты могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот живому субъекту внутримышечно, подкожно и т.д.

Далее приводятся примеры применимых полипептидов в качестве поликатионных агентов: полилизин, полиаргинин, полиорнитин и протамин. Другие примеры включают гистоны, протамины, сывороточный альбумин человека, ДНК-связывающие белки, негистоновые белки хромосом, белки оболочки из ДНК-вирусов, такие как X174, факторы транскрипции также содержат домены, которые связывают ДНК и, следовательно, могут быть использованы в качестве конденсирующих нуклеиновую кислоту агентов. Вкратце, факторы транскрипции, такие как С/СЕВР, с-jun, c-fos, АР-1, АР-2, АР-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP и TFIID, содержат основные домены, которые связывают ДНК-последовательности.

Органические поликатионные агенты включают: спермин, спермидин и путресцин.

Размеры и физические свойства поликатионного агента могут быть экстраполированы из приведенного выше перечня, для конструирования других полипептидных поликатионных агентов или для получения синтетических поликатионных агентов.

Синтетические поликатионные агенты, которые являются применимыми, включают, например, ДЭАЭ-декстран, полибрен. Липофектин и липофектАМИН являются мономерами, которые образуют поликатионные комплексы при объединении с полинуклеотидом/полипептидом.

Иммунодиагностические анализы

Менингококковые антигены данного изобретения могут быть использованы в иммуноанализах для детектирования уровней антител (или, наоборот, анти-менингококковые антитела могут быть использованы для детектирования уровней антигенов). Иммуноанализы на основе хорошо определенных, рекомбинантных антигенов могут быть разработаны для замены инвазивных диагностических способов. Антитела к менингококковым белкам могут детектироваться в биологических пробах, в том числе, например, пробах крови или сыворотки. Создание иммуноанализов является предметом большого числа вариаций, и многие из них известны в данной области. Протоколы для иммуноанализа могут быть основаны, например, на конкуренции или на прямой реакции или на анализах типа сэндвич-анализа. Протоколы могут также использовать, например, твердые носители или могут включать иммунопреципитацию. Большинство анализов включают применение меченого антитела или полипептида; метки могут быть, например, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными или в виде молекул-красителей. Анализы, которые усиливают сигналы из зонда, также известны; примерами их являются анализы, которые используют биотин и авидин, и меченые и опосредованные ферментом иммуноанализы, такие как анализы ELISA.

Наборы, пригодные для иммунодиагностики и содержащие подходящие меченые реагенты, создают посредством упаковывания подходящих материалов, в том числе композиций данного изобретения, в подходящие контейнеры, вместе с остальными реагентами и материалами (например, подходящими буферами, солевыми растворами и т.д.), требующимися для проведения данного анализа, а также соответствующего набора инструкций к анализу.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Термин "гибридизация" относится к связыванию двух последовательностей нуклеиновых кислот друг с другом посредством водородных связей. Обычно одну последовательность фиксируют на твердом носителе, а другая находится свободной в растворе. Затем эти две последовательности помещают в контакт друг с другом при условиях, которые благоприятствуют образованию водородных связей. Факторы, которые влияют на образование водородных связей, включают: тип и объем растворителя; температуру реакции; время гибридизации; перемешивание агентов для блокирования неспецифического присоединения последовательности жидкой фазы к твердому носителю (реагента Денхардта или BLOTTO); концентрацию последовательности; использование соединений, увеличивающих скорость связывания последовательностей (декстрансульфата или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации. См. Sambrook et al. [выше] Volume 2, chapter 9, pages 9.47-9.57.

Термин "жесткость" относится к условиям в реакции гибридизации, которые благоприятствуют преимущественной связи очень сходных последовательностей в сравнении с последовательностями, которые отличаются. Например, должна быть выбрана комбинация температуры и солевых условий, при которой температура приблизительно на 120-200°С ниже рассчитанной Tm (температуры плавления) исследуемого гибрида. Температура и солевые условия часто могут быть определены эмпирически в предварительных экспериментах, в которых пробы геномной ДНК, иммобилизованные на фильтрах, гибридизуют с представляющей интерес последовательностью и затем промывают при условиях различной жесткости. См. Sambrook et al., page 9.50.

Переменными, которые следует учитывать, например, при выполнении Саузерн-блоттинга, являются: (1) сложность ДНК, подлежащей блоттингу, и (2) гомология между зондом и детектируемой последовательностью. Общее количество фрагмента (фрагментов), подлежащего исследованию, может варьироваться с амплитудой 10, от 0,1-1 мкг для плазмиды или продукта расщепления фага до 10^-9-10^-8 г для малокопийного гена в высокосложном эукариотическом геноме. Для полинуклеотидов низкой сложности могут быть использованы существенно более короткие периоды блоттинга, гибридизации и экспонирования, меньшее количество исходных полинуклеотидов и более низкая удельная активность зондов. Например, однокопийный ген может быть детектирован со временем экспонирования только 1 час с исходным 1 мкг дрожжевой ДНК, блоттингом в течение двух часов и гибридизацией в течение 4-8 часов с зондом 10⁸ имп/мин/мкг. Для однокопийного гена млекопитающего консервативный подход начинается с 10 мкг ДНК в качестве исходного материала, блоттинг проводят в течение ночи и гибридизацию в течение ночи в присутствии 10% декстрансульфата с использованием зонда более 10⁸ имп/мин/мкг при времени экспонирования ˜24 часа.

Несколько факторов могут влиять на температуру плавления (Tm) гибрида ДНК-ДНК между зондом и представляющим интерес фрагментом, и, следовательно, подходящие условия гибридизации и промывки. Во многих случаях зонд не является на 100% гомологичным фрагменту. Другие обычно встречающиеся переменные включают длину и общее содержание G+C гибридизующихся последовательностей и ионную силу и содержание формамида гибридизационного буфера. Действия всех этих факторов могут быть приблизительно суммированы одним уравнением:

Tm=81+16,6(log₁₀Ci)+0,4[%(G+С)]-0,6(%формамида)-600/n-1,5(%ошибочного спаривания)

где Ci обозначает концентрацию соли (одновалентных ионов), а n обозначает длину гибрида в п.н. (слегка модифицировано в сравнении с Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284).

В планировании эксперимента гибридизации, некоторые факторы, влияющие на гибридизацию нуклеиновых кислот, могут быть изменены подходящим образом. Легче всего корректировать температуру гибридизации и промывки и концентрацию соли во время промывки. По мере увеличения температуры гибридизации (т.е. жесткости) уровень гибридизации между цепями, которые являются негомологичными, снижается и, вследствие этого, уменьшается фон. Если радиоактивно меченый зонд является не полностью гомологичным с иммобилизованным фрагментом (как это часто имеет место в случае экспериментов с гибридизацией в семействе генов и межвидовой гибридизацией), температура гибридизации должна быть понижена и фон будет увеличиваться. Температура промывок влияет на интенсивность полосы гибридизации и степень фона сходным образом. Жесткость промывок также увеличивается с уменьшением концентраций соли. Обычно подходящими температурами гибридизации в присутствии 50% формамида являются 42°С для зонда, который на 95-100% гомологичен фрагменту-мишени, 37°С для гомологии 90-95% и 32°С для гомологии 85-90%. Для более низких гомологий содержание формамида должно быть понижено, а температура скорректирована с использованием приведенного выше уравнения. Если гомология между зондом и фрагментом-мишенью неизвестна, самый простой подход заключается в том, чтобы начать с условиями гибридизации и промывок, которые являются нежесткими. Если после авторадиографии наблюдаются неспецифические полосы или высокий фон, фильтр может быть промыт при высокой жесткости и повторно экспонирован на пленке. Если время, требующееся для экспонирования, делает этот подход непрактичным, нужно тестировать параллельно несколько степеней жесткости гибридизации и/или промывок.

Анализы с зондами нуклеиновых кислот

Способы, такие как ПЦР, анализы с боковыми ДНК-зондами или способы блоттинга, использующие зонды нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением, могут определять присутствие кДНК или мРНК. Говорят, что зонд "гибридизуется" с последовательностью данного изобретения, если он может образовать дуплекс или двухцепочечный комплекс, который является достаточно стабильным для детектирования.

Зонды нуклеиновых кислот будут гибридизоваться с менингококковыми нуклеотидными последовательностями данного изобретения (в том числе смысловыми и антисмысловыми цепями). Хотя многие различные нуклеотидные последовательности будут кодировать данную аминокислотную последовательность, природная менингококковая последовательность является предпочтительной, так как она является действительной последовательностью, присутствующей в клетках. мРНК представляет кодирующую последовательность и, следовательно, зонд должен быть комплементарным кодирующей последовательности; одноцепочечная кДНК является комплементарной мРНК и, следовательно, кДНК-зонд должен быть комплементарным некодирующей последовательности.

Последовательность зонда не должна быть обязательно идентичной менингококковой последовательности (или ее коплементу) - некоторая вариация в последовательности и длине может приводить к повышенной чувствительности анализа, если зонд нуклеиновой кислоты может образовывать дуплекс с нуклеотидами мишени, которые могут быть детектированы. Зонд нуклеиновой кислоты может также включать дополнительные нуклеотиды для стабилизации образованного дуплекса. Дополнительная менингококковая последовательность может быть также полезной в качестве метки для детектирования образованного дуплекса. Например, некомплементарная нуклеотидная последовательность может быть присоединена к 5'-концу зонда, причем остальная часть последовательности зонда является комплементарной менингококковой последовательности. Альтернативно, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут быть вставлены с промежутками в зонд, при условии, что последовательность зонда имеет достаточную комплементарность с менингококковой последовательностью для гибридизации с ней и посредством этого образования дуплекса, который может быть детектирован.

Точная длина и последовательность зонда будут зависеть от условий гибридизации, таких как температура, солевые условия и т.п. Например, для диагностических приложений, в зависимости от сложности последовательности аналита, зонд нуклеиновой кислоты обычно содержит по меньшей мере 10-20 нуклеотидов, предпочтительно 15-25 нуклеотидов и более предпочтительно по меньшей мере 30 нуклеотидов, хотя он может быть более коротким. Короткие праймеры обычно требуют более низких температур для образования стабильных гибридных комплексов с матрицей.

Зонды могут быть получены синтетическими процедурами, такими как триэфирный способ Matteucci et al. [J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185], или согласно Urdea et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:7461] или с использованием коммерчески доступных автоматизированных олигонуклеотидных синтезаторов.

Химическая природа зонда может быть выбрана в соответствии с предпочтительным применением. Для некоторых применений подходящими являются ДНК или РНК. Для других приложений могут быть включены модификации, например, модификации скелета, такие как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, могут быть использованы для увеличения периода полужизни in vivo, изменения РНК-аффинности, увеличения резистентности к нуклеазам и т.д. [например, см. Agrawal and Iyer (1995) Curr Opin Biotechnol 6:12-19, Agrawal (1996) TIBTECH 14:376-387]; могут быть также использованы аналоги, такие как пептиднуклеиновые кислоты [например, см. Согеу (1997) TIBTECH 15:224-229; Buchardt et al. (1993) TIBTECH 11:384-386].

Альтернативно, полимеразная цепная реакция (ПЦР) является другим хорошо известным способом для обнаружения малых количеств нуклеиновых кислот-мишеней. Анализ описан в: Mullis et al. [Meth. Enzymol. (1987) 155:335-350]; патентах США US 4683195 и 4683202. Два "праймерных" нуклеотида гибридизуются с нуклеиновыми кислотами-мишенями и используются для праймирования (затравки) реакции. Праймеры могут содержать последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью мишени амплификации (или ее комплементом), для увеличения стабильности, например, для включения удобного сайта рестрикции. Обычно такая последовательность будет фланкировать желаемую менингококковую последовательность.

Термостабильная полимераза создает копии нуклеиновых кислот-мишеней из праймеров с использованием исходных нуклеиновых кислот-мишеней в качестве матрицы. После генерирования порогового количества нуклеиновых кислот-мишеней полимеразой они могут быть детектированы более традиционными способами, такими как Саузерн-блоттинг. При использовании способа Саузерн-блоттинга меченый зонд будет гибридизоваться с менингококковой последовательностью (или ее комплементом).

мРНК и кДНК могут быть также детектированы традиционными способами блоттинга, описанными в Sambrook et al. [выше]. мРНК или кДНК, генерированная из мРНК с использованием полимеразного фермента, могут быть очищены и разделены при помощи гель-электрофореза. Затем нуклеиновые кислоты на геле блоттируют на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза. Твердую подложку экспонируют с меченым зондом и затем промывают для удаления негибридизовавшегося зонда. Затем дуплексы, содержащие меченый зонд, детектируют. Обычно зонд метят радиоактивной составляющей.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ - ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ФРАГМЕНТЫ

Белковые последовательности, описанные в Международных заявках (см. выше), помимо прочего, подвергали компьютерному анализу для предсказания антигенных пептидных фрагментов в полноразмерных белках. В этом анализе использовали три алгоритма:

- AMPHI Эту программу использовали для предсказания Т-клеточных эпитопов [Gao et al. (1989) J. Immunol. 143:3007; Roberts et al. (1996) AIDS Res Hum Retrovir 12:593; Quakyi et al. (1992 Scand J Immunol suppi. 11:9], и она доступна в пакете программ с Protean package of DNASTAR, Inc. (1228 South Park Street, Madison, Wisconsin 53715 USA).

- ANTIGENIC INDEX (антигенный индекс) как описано Jameson and Wolf (1988) The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. CABIOS, 4:181-186.

- HYDROPHILICITY (гидрофильность) как описано Норр and Woods (1981) Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. PNAS, 78:3824-3828.

Эти три алгоритма часто идентифицируют одни и те же фрагменты. Такие множественным путем идентифицированные фрагменты являются особенно предпочтительными. Эти алгоритмы часто идентифицируют перекрывающиеся фрагменты (например, для антигена "013", AMPHI идентифицирует аминокислоты (аа) 42-46, a Antigenic Index (Антигенный Индекс) идентифицирует аминокислоты (аа) 39-45). Данное изобретение в качестве примера включает фрагменты, полученные в результате комбинирования этих перекрывающихся фрагментов (например, фрагмент от остатка 39 до остатка 46, в случае "013"). Фрагменты, разделенные одной аминокислотой, часто также идентифицируются (например, для "018-2", Антигенный Индекс идентифицирует аминокислоты 19-23 и 25-41). Данное изобретение включают также фрагменты, простирающиеся на два края таких "смежных" фрагментов (например, 19-41 для "081-2"). Пример представляет предпочтительные антигенные фрагменты белков, описанных в Международных Заявках.

Пример 1 - Предпочтительные антигенные фрагменты белков

Следующие аминокислотные последовательности в таблице 1 идентифицируются названиями, указывающими номер, присвоенный конкретной открытой рамке считывания (ORF), согласующийся с номерами, приведенными в Международных Заявках. Названия имеют следующую форму: [no prefix (без приставки впереди), g, или а] [#], где "no prefix" (без приставки) обозначает последовательность N. meningitidis серотипа В, "а" обозначает последовательность N. meningitidis серотина А, "g" обозначает последовательность из N. gonorrhoeae; и "#" обозначает номер, присвоенный данной открытой рамке считывания (ORF). Например, "127" означает аминокислотную последовательность N. meningitidis В, номер ORF 127. Присутствие суффикса "-1" или "-2" у этих названий указывает на то, что дополнительная последовательность обнаружена для этой конкретной ORF. Так, например, "а12-2" относится к аминокислотной последовательности N. meningitidis А, номер ORF 12, которая является второй последовательностью, обнаруженной для ORF 12, в дополнение к первоначально обозначенной ORF 12 и ORF 12-1. Перед каждой аминокислотной последовательностью стоит номер положения начальной аминокислоты, а затем номер положения конечной аминокислоты.

Должно быть понятно, что изобретение описано выше только со ссылкой на пример и возможны модификации без отступления от объема и сути изобретения.

1. Белок, содержащий фрагмент одного или более белков Neisseria с последовательностью SEQ ID No. 998, где указанный фрагмент (а) содержит по меньшей мере одну антигенную детерминанту указанной последовательности SEQ ID No. 998 и (b) содержит не более чем 558 аминокислот указанной последовательности SEQ ID No. 998 и не более чем 486 аминокислот указанной последовательности SEQ ID No. 999.

2. Белок по п.1, содержащий один или более из следующих фрагментов указанной последовательности SEQ ID No. 998:

NH₂-AlaAsnValArgPheGluGlnProLeuGluLysAsnAsn-COOH

NH₂-AlaAsnValArgPheGluGlnProLeuGluLysAsnAsnTyrValLeuSerGluAspGluThrProCysThrArg-COOH

NH₂-AlaAspTyrGlyArgValSerGlyGluSerAla-COOH

NH₂-AlaGlnAspLysLeuSerIle-COOH

NH₂-AlaGlnAspLysLeuSerIleGlySerArgTyrThrValArgGlyPheAspGlyGluGlnSerLeuPheGlyGluArgGlyPheTyrTrpGInAsnThr-COOH

NH₂-AlaGluLeuArgHis-COOH

NH₂-ArgAspValGluGlnGlyLeuGluAsnLeuArgArgLeuProSerValLysThrAspIle-COOH

NH₂-ArgTyrHisGluAlaThrGlu-COOH

NH₂-ArgValSerAlaGlyGluIleGlyAspIleArgTyrGluGluLysArgAspGlyLysSerAlaGluGlySerIle-COOH

NH₂-AsnLeuSerArgLeuGlnLysAlaAla-COOH

NH₂-AsnLeuSerArgLeuGlnLysAla-COOH

NH₂-AspAsnProLeuGly-COOH

NH₂-AspTyrGlyArgValSerGlyGluSer-COOH

NH₂-GlnThrTyrLysTyrIleAspAspAlaGluIleGluValGlnArgArgArgSerAlaGlyTrpGluAlaGluLeuArgHis-COOH

NH₂-GlnTrpAsnLysThrPro-СООН

NH₂-GluGlnGlyLeuGluAsnLeuArgArgLeuProSerVal-COOH

NH₂-GluIleGlyAspIleArgTyrGluGluLysArgAspGlyLysSerAlaGluGlySer-COOH

NH₂-GlyGlyLysThrThrGlyLysTyr-COOH

NH₂-GlyLysLeuSerTyrLysArgGlyThrGlyMetArgGlnSerMetProAlaProGluGluAsnGlyGly-COOH

NH₂-GlyPheAspGlyGluGln-COOH

NH₂-GlySerAsnAsnLeuSerArgLeuGlnLysAlaAla-COOH

NH₂-HisLysProLysGlyPheGlnThrThrAsnThr-COOH

NH₂-IleGlyIleAspAspAlaGlyGlyLysThrThrGlyLysTyr-COOH

NH₂-IleGlyIleAspAspAlaGlyGlyLysThrThrGlyLysTyrGlnGly-COOH

NH₂-IleIleAsnAspAlaGluLeuIleArgSerMetGlnArgGlnGlnHisIleAsp-COOH

NH₂-IleProSerGluGluGluGlyLysSerAspLeu-COOH

NH₂-LeuAlaHisLysThrAspLeuThrAsp-COOH

NH₂-LeuIleArgSerMetGlnArgGln-COOH

NH₂-LeuSerGluAspGluThrProCys-COOH

NH₂-LysProLeuHisLysProLysGlyPheGln-COOH

NH₂-LysTrpGlnGlnAsnLysProIleArg-COOH

NH₂-MetLeuTrpArgAsnArgLeuHisLysThrSerVal-COOH

NH₂-PheArgGlyGlyHisLysValGly-COOH

NH₂-PheAsnHisAsnGlyHisArgTyrHisGluAlaThrGluGlyTyrSerValAsnTyrAspTyrAsnGlyLysGlnTyrGln-COOH

NH₂-ProGlnAsnMetAspSerGlyIleLeu-COOH

NH₂-ProLeuHisLysProLysGly-COOH

NH₂-ProLeuTyrArgAsnLysIleLeuAsn-COOH

NH₂-ProSerGluGluGluGlyLysSerAspLeu-COOH

NH₂-SerArgMetLysIle-COOH

NH₂-SerAspLeuPheTyr-COOH

NH₂-SerLeuAspAspLysThrValArg-COOH

NH₂-ThrArgGlnThrTyrLysTyrIleAspAsp-COOH

NH₂-ThrGlyThrGluThrGluSerGlySerArgSer-COOH

NH₂-TrpGlnLeuAspGlyLysLeuSerTyrLysArgGlyThrGlyMetArgGlnSerMetProAlaProGluGluAsnGlyGlyAspIleLeuProGlyThrSerArgMetLysIle-COOH

NH₂-TyrGlyArgGlyLeuAlaHisLysThrAspLeuThrAspAlaThrGlyThrGluThrGluSerGlySerArgSerTyr-COOH

NH₂-TyrIleAspAspAlaGluIleGluValGlnArgArgArgSerAlaGlyTrp-COOH

NH₂-ValSerGlyLysGln-COOH

3. Белок по пп.1 и 2, содержащий одну или более из аминокислотных последовательностей, перечисленных в п.2, при условии, что указанный белок не имеет аминокислотной последовательности

MEIINDAELIRSMQRQQHIDAELLTDANVRFEQPLEKNNYVLISEDETPCTRVNYISLDDKTVRKFSFLPSVLMKETAFKTGMCLGSNNLSRLQKAAQQILIVRGYLTSQAIIQPQNMDSGILKLRVSAGEIGDIRYEEKRDGKSAEGSISAFNNKFPLYRNKILNLRDVEQGLENLRRLPSVKTDIQIIPSEEEGKSDLQIKWQQNKPIRFSIG1DDAGGKTTGKYQGNVALSFDNPLGLSDLFYVSYGRGLAHKTDLTDATGTETESGSRSYSVHYSVPVKKWLFSFNHNGHRYHEATEGYSVNYDYNGKQYQSSLAAERMLWRNRLHKTSVGMKLWTRQTYKYIDDAEIEVQRRRSAGWEAELRHRAYLNRWQLDGKLSYKRGTGMRQSMPAPEENGGDILPGTSRMKIITASLDAAAPFILGKQQFFYATAIQAQWNKTPLVAQDKLSIGSRYTVRGFDGEQSLFGERGFYWQNTLTWYFHPNHQFYLGADYGRVSGESAQYVSGKQLMGAVVGFRGGHKVGGMFAYDLFAGKPLHKPKGFQTTNTVYGFNLNYSF.

4. Белок по любому из пп.1-3, предназначенный для использования в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, обусловленной бактериями Neisseria.

5. Белок по любому из пп.1-3, предназначенный для использования в изготовлении диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

6. Белок по любому из пп.1-3, предназначенный для использования в изготовлении реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

7. Белок, содержащий фрагмент одного или более белков Neisseria с последовательностью SEQ ID No.999, где указанный фрагмент (а) содержит по меньшей мере одну антигенную детерминанту указанной последовательности SEQ ID No. 999 и (b) содержит не более чем 558 аминокислот указанной последовательности SEQ ID No. 998 и не более чем 486 аминокислот указанной последовательности SEQ ID No. 999.

8. Белок по п.7, содержащий один или более из следующих фрагментов указанной последовательности SEQ ID No. 999:

NH₂-AsnLeuSerArgLeuGlnLysAla-COOH

NH₂-GluGlnGlyLeuGluAsnLeuArgArgLeuProSerVal-COOH

NH₂-GlyGlyLysThrThrGlyLysTyr-COOH

NH₂-ArgTyrHisGluAlaThrGlu-COOH

NH₂-ThrArgGlnThrTyrLysTyrIleAspAsp-COOH

NH₂-HisLysProLysGlyPheGlnThrThrAsnThr-COOH

NH₂-XxxLysGluThrAlaPhe-COOH

NH₂-GlySerAsnAsnLeuSerArgLeuGlnLysAlaAla-COOH

NH₂-ProGlnAsnMetAspSerGlyIleLeu-COOH

NH₂-ArgValSerAlaGlyGluIleGlyAspIleArgTyrGluGluLysArgAspXxxLysSerAlaGluGlySerIle-COOH

NH₂-AlaPheAsnAsnLysXxxProLeuTyrArgAsnLysIleLeuAsn-COOH

NH₂-ArgAspValGluGlnGlyLeuGluAsnLeuArgArgLeuProSerValLysThrAspIle-COOH

NH₂-IleProSerGluGluGluGlyLysSerAspLeu-COOH

NH₂-LysTrpGlnGlnAsnLysProIleArg-COOH

NH₂-IleGlyIleAspAspAlaGlyGlyLysThrThrGlyLysTyrGlnGly-COOH

NH₂-XxxAspAsnProLeuGlyLeuSer-COOH

NH₂-LeuValHisLysThrAspLeuThrXxxAlaThrGlyThrGluThrGluSerGlySerArgSerTyr-COOH

NH₂-PheAsnHisAsnGlyHisArgTyrHisGluAlaThrGluGlyTyrSerValAsnTyrAspTyrAsnGlyLysGlnTyrGln-COOH

NH₂-GlnThrTyrLysTyrIleAspAspAlaGluIleGluValGlnArgArgArgSerAlaGlyTrpGluAlaGluLeuArgHis-COOH

NH₂-GlnLeuAspGlyLysLeuSerTyrLysArgGlyThrGlyMetArgGlnSerMetProAlaProGluGluAsnGlyGlyGlyThrIleProXxxXxxSerArgMetLysIle-COOH

NH₂-GlnTrpAsnLysThrPro-COOH

NH₂-AlaGlnAspLysLeuSerIleGlySerArgTyrThrValArgGlyPheAspGlyGluGlnSerLeuPheGlyGluArgGlyPheTyrTrpGlnAsnThr-COOH

NH₂-AlaAspTyrGlyArgValSerGlyGluSerAla-COOH

NH₂-ValSerGlyLysGln-COOH

NH₂-PheArgGlyGlyHisLysValGlyGly-COOH

NH₂-LysProLeuHisLysProLysGlyPheGln-COOH

NH₂-XxxLysGluThrAlaPhe-COOH

NH₂-AsnLeuSerArgLeuGlnLysAlaAla-COOH

NH₂-GluIleGlyAspIleArgTyrGluGluLysArgAspXxxLysSerAlaGluGlySer-COOH

NH₂-ArgAspValGluGlnGlyLeuGluAsnLeuArgArgLeuProSerValLysThrAspIle-COOH

NH₂-ProSerGluGluGluGlyLysSerAspLeu-COOH

NH₂-IleGlyIleAspAspAlaGlyGlyLysThrThrGlyLysTyr-COOH

NH₂-LeuValHisLysThrAspLeu-COOH

NH₂-ThrGlyThrGluThrGluSerGlySerArgSer-COOH

NH₂-ArgTyrHisGluAlaThrGlu-COOH

NH₂-TyrIleAspAspAlaGluIleGluValGlnArgArgArgSerAlaGlyTrp-COOH

NH₂-AlaGluLeuArgHis-COOH

NH₂-GlyLysLeuSerTyrLysArgGlyThrGlyMetArgGlnSerMetProAlaProGluGluAsnGlyGly-COOH

NH₂-XxxXxxSerArgMetLysIle-COOH

NH₂-AlaGlnAspLysLeuSerIle-COOH

NH₂-GlyPheAspGlyGluGln-COOH

NH₂-AspTyrGlyArgValSerGlyGluSer-COOH

NH₂-ProLeuHisLysProLysGly-COOH

9. Белок по пп.7 и 8, содержащий одну или более из аминокислотных последовательностей, перечисленных в п.4, при условии, что указанный белок не имеет аминокислотной последовательности

XKETAFKTGMCLGSNNLSRLQKAAQQILIVRGYLTSQAIIQPQNMDSGILKLRVSAGEIGDIRYEEKRDXKSAEGSISAFNNKXPLYRNKILNLRDVEQGLENLRRLPSVKTDIQIIPSEEEGKSDLQIKWQQNKPIRFSIGIDDAGGKTTGKYQGNVALSXDNPLGLSDXFYVSYGRGLVHKTDLTXATGTETESGSRSYSVHYSVXVKKWLFSFNHNGHRYHEATEGYSVNYDYNGKQYQSSLAAERMLWXXXFXXTSVXMKLWTRQTYKYIDDAEIEVQRRRSAGWEAELRHRAYLXRWQLDGKLSYKRGTGMRQSMPAPEENGGGTIPXXSRMKIITAGLDAAAPXMLGKQQFFYATAIQAQWNKTPLVAQDKLSIGSRYTVRGFDGEQSLFGERGFYWQNTLTWYFHPNHQFYLGADYGRVSGESAQYVSGKQLMGAVVGFRGGHKVGGMFAYDLFAGKPLHKPKGFQTTNTVYGFNLNYSF.

10. Белок по любому из пп.7-9, предназначенный для использования в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, обусловленной бактериями Neisseria.

11. Белок по любому из пп.7-9, предназначенный для использования в изготовлении диагностического реагента для обнаружения присутствия бактерий Neisseria или антител, индуцированных против бактерий Neisseria.

12. Белок по любому из пп.7-9, предназначенный для использования в изготовлении реагента, который может индуцировать антитела против бактерий Neisseria.

13. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп.1-3, 7-9, которая характеризуется последовательностью нуклеотидов, определяющих, в соответствии с генетическим кодом, аминокислотную последовательность белка по любому из пп.1-3, 7-9.

14. Нуклеиновая кислота по п.13, предназначенная для использования в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции, обусловленной бактериями Neisseria.

15. Диагностический реагент для обнаружения присутствия бактерий Neisseria, содержащий белок по любому из пп.1-3, 7-9 или нуклеиновую кислоту по п.13.

16. Диагностический реагент для обнаружения присутствия антител, индуцированных против бактерий Neisseria, содержащий белок по любому из пп.1-3, 7-9 или нуклеиновую кислоту по п.13.

17. Иммуногенная композиция для получения антител против бактерий Neisseria, содержащая белок по любому из пп.1-3, 7-9 или нуклеиновую кислоту по п.13.

18. Иммуногенная композиция по п.17, представляющая собой вакцину.

19. Способ лечения инфекции, обусловленной бактериями Neisseria, у пациента, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по п.18.