Способ получения бактериального пигментного препарата

Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ предусматривает культивирование Serratia marcescens на питательной среде, получение пигментсодержащей биомассы, отделение культуральной жидкостной биомассы. После отделения культуральной жидкости от биомассы последнюю концентрируют. Затем полученную концентрированную биомассу обрабатывают ионным детергентом, экстрагируют полярным растворителем и выделяют пигментный препарат - продигиозин. Выделенный продигиозин концентрируют. Отделение культуральной жидкости от биомассы, ее концентрирование, выделение продигиозина осуществляют на одном фильтрующем модуле с трубчатыми керамическими элементами. Способ позволяет ускорить технологический процесс в среднем на 20-25% и увеличить выход бактериального препарата продигиозина на 10-15%. 1 ил.

 

Изобретение относится к технологии получения пигментных препаратов, которые можно использовать для окрашивания полимеров.

Для крашения в массе различных полимеров, в т.ч. полиолефинов, используются органические пигменты. Современные требования, предъявляемые к пигментам, весьма высоки: температурный диапазон переработки, особо тонкое распределение в материале-носителе, которое сохраняется в готовом изделии, миграционная устойчивость, светостойкость композиций. Для получения яркой окраски органические пигменты вводят в полимер 0,1-0,2 мас.% по чистому пигменту. Вышеизложенные критерии для окрашенных полимерных изделий определяют высокую стоимость органических красителей.

Расширение сырьевой базы по синтезу новых пигментов, отвечающих современным требованиям экологии и применяемых при переработке и окраске полимеров, является актуальной задачей в химической промышленности.

Разнообразие пигментированных микроорганизмов в природе представляет перспективный источник продуцентов красителей, различных по химической структуре.

Бактериальные пигменты являются продуктами вторичного метаболизма и максимально синтезируются в период стационарной фазы роста культуры параллельно с накоплением биомассы.

В литературе описаны многочисленные способы выделения продуктов метаболизма микроорганизмов, в т.ч. рибофлавина (А.В.Глазунов, Р.И.Акишина, В.М.Серебренников. «Изучение периодического культивирования Bacillus subtilis - продуцента рибофлавина». Биотехнология, 2001, №4, с.85-91); получение меланина из растительного сырья (Патент RU № 2000116048, МПК 7 С 09 В 61/00).

Предложен способ выделения красителя из биомассы гриба Hypomyces rosellus ( Патент RU №2039774; 6 С 09 В 61/00, С 12 P 1/02), a также из культуральной жидкости этой культуры с применением смеси растворителей (Патент RU №2065462, 6 С 09 В 61/00). Недостатком предлагаемых методов получения красителя являются как длительность процесса выращивания гриба, многостадийность выделения пигмента, так и использование токсических растворителей (метанола).

Описан способ (Патент Японии № 61-43039, МКИ⁴ С 12 Р 17/16, С 12 R 1:43), который состоит в подборе питательной среды при выращивании культуры Serratia marcescens с высоким выходом продукта.

Метод экстракции продигиозина кислым раствором этанола используется при определении концентрации пигмента (Williams R.P., Gott C.L., Green J.A. Studies on pigmentation of Serratia marcescens, J.Bacteriol. 1961, v.81, №3, p.376-379). Однако этот метод непригоден для окрашивания полимеров в промышленном производстве ввиду того, что продигиозин не выдерживает температурный режим обработки.

Впервые предлагается способ промышленного получения бактериального пигментного препарата продигиозина, продуцентом которого является Serratia marcescens.

Ближайшим по технологической сущности аналогом - прототипом является способ выделения продигиозина из пигментированной биомассы, предварительно обработанной ионогенным детергентом -додецилсульфатом натрия (ДДС), который позволяет применять пигментный препарат в составе полимерной красящей композиции - концентрата (Патент RU №2129136, 6 С 09 В 61/00, С 08 L 23/04; 20.04.99 Бюлл. №11).

Цель изобретения - технологическая разработка выделения из биомассы пигментного препарата продигиозина на принципиально новой пилотной установке, включающей известные конструктивные элементы.

Технический результат заключается в ускорении технологического процесса в среднем на 20-25% по сравнению с традиционной технологией разделения или концентрирования жидких сред на фильтр-прессе. При этом выход бактериального пигментного препарата продигиозина на стадии микрофильтрации увеличивается в среднем на 10-15% по отношению к выделению пигмента в лабораторных условиях.

Поставленная задача решается и осуществляется по схеме новой пилотной установки. В схему включен один из принципиально новых технологических элементов - фильтрующий модуль. В настоящее время в биотехнологической промышленности внедряются новые технологические разработки. К таким относится отечественная фильтрационная установка на основе трубчатых керамических элементов. Она позволяет относительно быстро и экономично вести процесс разделения различных сред, в частности культуральной жидкости после ферментации, которая направляется внутрь трубчатых керамических элементов. Клеточный осадок - биомасса концентрируется на поверхности селективного слоя.

Способ поясняется схемой, на которой показаны: ферментатор с мешалкой 1, в него подается стерильный воздух через фильтр воздуха 2; насос 3, подающий биомассу на фильтрующий модуль (микрофильтрационную установку) с трубчатыми керамическими элементами 4; емкость с мешалкой для приема биомассы 5; емкость с рубашкой для приема спиртового раствора пигментного препарата 6; аппарат регенерации этанола 7; приемник этанола 8; узел фасовки готового продукта 9.

Предлагаемый способ осуществляют в следующей последовательности (схема 1).

Выращивание продуцента продигиозина; получение инокулята

В качестве продуцента продигиозина используют культуру Serratia marcescens. Наработку пигментного препарата осуществляют в условиях периодического культивирования в реакторе-ферментаторе 1 (объем 1 м³⁾ на стандартной глицерин-пептонной среде. До стерилизации устанавливают рН питательной среды 7,1-7,3.

Посевной материал выращивают на мясо-пептонном бульоне (МПБ) или глицерин-пептонной среде на качалке в течение 48-54 ч при 180-200 об/мин. Объем инокулята вводят из расчета 0,05-0,1 % (по объему) при плотности клеточной суспензии не менее 2,0 опт.ед. при 670 нм.

Стадия ферментации

Введение инокулята в ферментатор 1 осуществляют стерильно. Процесс биосинтеза продигиозина начинается с 18-20 часов ферментации, и максимальное накопление пигмента происходит в стационарную фазу роста культуры. Продолжительность ферментации составляет 56-60 часов. Процесс ферментации проводят при аэрации 1,0-1,2 м³/м³ среды/мин и постоянной работе мешалки.

Стадия отделения биомассы от культуральной жидкости.

Выделение из биомассы пигментного препарата продигиозина

По окончании ферментации культуральную жидкость подают насосом 3 на впускной коллектор микрофильтрационной установки ММТ-1-4. Основной конструктивной составляющей фильтрующего модуля являются керамические мембраны в виде одноканальных трубчатых керамических элементов типа КМФЭ («НПО «Керамикфильтр»). Культуральную жидкость подают внутрь трубчатых керамических элементов фильтрующего модуля, которые обеспечивают отделение биомассы от культуральной жидкости и концентрирование биомассы.

Концентрированная биомасса с влажностью 85-90 % поступает в емкость с мешалкой 5.

Биомассу обрабатывают ионогенным детергентом додецилсульфатом натрия (ДДС), тщательно и равномерно перемешивают и вводят полярный растворитель, например этанол, для экстракции пигментного препарата продигиозина. Соотношение биомасса:полярный растворитель 1:3-5. Выделение из биомассы экстрагированного пигментного препарата продигиозина осуществляют путем подачи обработанной биомассы с растворителем на впускной коллектор фильтрующего модуля с трубчатыми керамическими элементами 4. Экстракцию пигмента из биомассы растворителем повторяют несколько раз для более полного извлечения пигмента.

Стадия концентрирования пигментного препарата продигиозина

Конечный объем спиртового раствора пигментного препарата продигиозина объединяют в аппарате с рубашкой 6. Через рубашку емкость нагревают, в результате происходит испарение растворителя и через аппарат регенерации 7 растворитель регенерирует, поступая в приемник 8 для последующей экстракции.

Целевой продукт - сконцентрированный пигментный препарат продигиозина представляет густую суспензию/пасту, и в таком виде его подают на узел фасовки 9.

Пигментный препарат продигиозина представляет собой смесь, содержащую природный пигмент продигиозин, следовые количества додецилсульфата натрия и полярный растворитель.

Количественное содержание продигиозина в препарате определяют спектрофотометрическим методом при 535 нм, коэффициент абсорбции продигиозина равен 51,5х10³ см²/мг (Williams R.P., Gott C.L., Green J.A. Studies on pigmentation of Serratia marcescens, J.Bacteriol. 1961, v.81, №3, p.376-379).

Пример выполнения способа на технологической установке

Выращивание посевного материала (инокулята)

Продуцент продигиозина культуру Serratia marcescens выращивают в колбе (объем 2 л) на глицерин-пептонной среде на качалке при 180-200 об/мин в течение 54 час. Объем инокулята в колбе составляет 0,7 л, плотность клеточной суспензии не менее 2,0 опт.ед. при 670 нм.

Ферментация

Приготовление питательной среды для ферментации осуществляют в ферментаторе (объем 1 м³), коэффициент заполнения 700 л. Вводят ингредиенты питательной среды следующего состава (на 1 л водопроводной воды): пептон - 5 г, глицерин - 10 мл, при постоянном перемешивании. До стерилизации питательной среды доводят рН 7,2-7,4, используя 1 N раствор NaOH.

После стерилизации в ферментатор 1 вводят инокулят через посевной штуцер.

Процесс ферментации осуществляют при постоянной подаче стерильного воздуха через фильтр 2 в ферментатор 1, скорость подачи воздуха 1,2 м³/м³ среды/мин, и постоянной работе мешалки.

Биосинтез продигиозина начинается с 18-20 ч ферментации, и максимальное накопление пигмента происходит в стационарную фазу роста культуры. Одновременно наращивается биомасса продуцента. Время ферментации составляет 56-58 часов.

Отделение биомассы от культуральной жидкости и выделение пигментного препарата продигиозина

На микрофильтрационной установке ММТ-1 (фильтрующий модуль с трубчатыми керамическими элементами) 4 происходит отделение биомассы от культуральной жидкости и концентрирование биомассы влажностью 85-90%.

Отделение экстрагированного из биомассы пигментного препарата осуществляют следующим образом. Концентрированная биомасса поступает в емкость 5, где тщательно перемешивается с додецилсульфатом натрия (ДДС), в эту же емкость 5 вводят этанол в соотношении биомасса-этанол 1:3 и проводят экстракцию пигмента.

Смесь подают на впускной коллектор фильтрующего модуля с трубчатыми керамическими элементами 4.

Фильтрат - раствор пигментного препарата поступает в емкость 6 приема спиртового раствора пигментного препарата. Осадок - биомасса поступает в емкость 5, в которую вводят этанол, и вновь проводят экстракцию пигмента.

Отработанную биомассу, как и отработанную культуральную жидкость, после разделения смешивают со сточными водами и подают на очистные сооружения.

Концентрирование пигментного препарата продигиозина

Конечный объем раствора пигментного препарата продигиозина через рубашку емкости 6 нагревают и растворитель отгоняется через аппарат регенерации 7, поступая в приемник 8 для последующей экстракции.

Сконцентрированный пигментный препарат продигиозин в виде пасты/густой суспензии поступает на узел фасовки 9.

Способ получения бактериального пигментного препарата для окрашивания полимеров, включающий культивирование Serratia marcescens на питательной среде, получение пигментсодержащей биомассы, отделение культуральной жидкости от биомассы, обработку полученной биомассы ионным детергентом, экстрагирование полярным растворителем и выделение пигментного препарата-продигиозина, отличающийся тем, что после отделения культуральной жидкости от биомассы последнюю концентрируют, причем отделение культуральной жидкости от биомассы, ее концентрирование, выделение продигиозина осуществляют на одном фильтрующем модуле с трубчатыми керамическими элементами, а полученный пигментный препарат - продигиозин концентрируют.