Инфекционные клоны полномерной кднк клещевого флавивируса

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен способ изготовления стабильного клона полномерной кДНК клещевого флавивируса Лангата. Способ предусматривает множественное инфицирование линии клеток вирусом, сбор вирусной суспензии на ранней стадии культивирования и выделение вируса. Предложены также клон, полученный таким способом, инфекционная РНК, транскрибированная из клона, единичная доза иммуногенного состава, содержащая такую РНК, и способ вызывания защитного иммунитета. Изобретение может быть использовано в вирусологии и медицине. 10 н. и 12 з.п. ф-лы, 6 ил., 11 табл.

 

Настоящее изобретение относится к области вирусологии. Описанные здесь варианты выполнения включают в себя клоны кДНК клещевого флавивируса Лангата.

Существующий уровень техники

В роде флавивирусов семейства Flaviviridae существует более 60 переносимых членистоногими антигенно родственных вирусов с положительной спиралью РНК, многие из которых являются важными патогенами человека. Антигенно-родственный вирусный комплекс клещевого энцефалита семейства флавивирусов включает в себя вирус клещевого энцефалита (ВКЭ, ранее называвшийся вирусом русского весенне-летнего энцефалита), вирус болезни Кьясанурского леса, вирус Лангата, вирус болезни Лупинга, вирус Негиши, вирус омской геморрагической лихорадки и вирус Повассана (Calisher С.Н., Karabatsos N., Dalrymple J.M., Shope R.E., Porterfield J., Westaway E.G. and Brant W.E. (1989) Antigenic relationships between flaviviruses are determined by cross-neutralization test with polyclonal antisera. J. Gen. Virol., 70, 27-43; Monath Т.P. and Heinz F.X. (1996) Flaviviruses. In "Fields Virology." (B.N.Fields, D.M.Knipe & P.M.Howley, Eds.), 3^rd ed., pp.961-1035. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia & New York). Эти вирусы распространены по большей части Северного полушария и за исключением вируса Лангата вызывают у человека заболевания различной тяжести, смертность от которых может достигать от 20 до 30%. Клещевой энцефалит остается актуальной проблемой общественного здравоохранения в Восточной Европе и России, где ежегодно диагностируется 9000-12000 случаев заболевания. Значительное увеличение смертности отмечалось в 1956 и 1964 годах, когда было поражено от 4500 до 4600 человек на каждые 100000 жителей (Gaidamovich S.Y. (1995) Tick-borne flavivirus infections. In "Exotic Viral Infections". (J.S. Porterfield, Ed.) pp.203-221. Chapman & Hall, London).

Флавивирусы клещевого энцефалита имеют общие гликопротеиновые эпитопы, которые часто вызывают перекрестную сопротивляемость вирусов группы. Приблизительно три десятилетия назад эти свойства антигенной перекрестной реакционности и последующее обнаружение вирулентного полиморфизма привели к предположению, что успешная иммунизация возможна с помощью живого, природно ослабленного клещевого флавивируса (Il'enko V.I., Smorodincev A.A., Prozorova I.N. and Platonov V.G. (1968) Experience in the study of a live vaccine made from the TP21 strain of Malayan Langat virus. Bull. W.H.O. 39, 425-431; Price W.H., Thind I.S., Teasdall R.D. and O'Leary W. (1970) Vaccination of human volunteers against Russian spring-summer (RSS) virus complex with attenuated Langat E5 virus. Bull. W.H.O. 42, 89-94; Mayer V., Orolin D., Pogady J., Starek M., Kubistova K., Gajdo-Sova E. and Buran I. (1976) Experimental live tick-borne encephalitis vaccine (Langat E5"14" virus clone): volunteers 1 and 2 years after single-dose immunization. Acta virol., 20, 215-225). Стимулом к такому подходу стало выделение из клещей вируса в Малайзии, а именно вируса Лангата (LGT), штамм TP21, который, как казалось, не ассоциировался с заболеванием человека в естественных условиях (Gordon Smith С.E. (1956) A virus resembling Russian spring-summer encephalitis virus from an Ixodid in Malaya. Nature (London) 178, 581-582). Иммунизация животных и людей-добровольцев с помощью LGT вызывала высокий уровень нейтрализующих вирус антител к различным членам комплекса ВКЭ, таким как вирус Повассана, вирус болезни Кьясанурского леса и ВКЭ (Price W.Н., Thind I.S., Teasdall R.D. and o'Leary W. (1970) Vaccination of human volunteers against Russian spring-summer (RSS) virus complex with attenuated Langat E5 virus. Bull. W.H.O. 42, 89-94; Price H.W. and Thind I.S. (1973) Immunization of mice against Russian spring-summer virus complex and monkeys against Powas-san virus with attenuated Langat E5 vims. Am. J. Trop.Med. Hyg. 22, 100-108). Тем не менее, ТР21 проявлял нейровирулентность и нейроинвазивность ("периферийную вирулентность") при тестировании на мышах, и потому считался слишком опасным для использования в качестве вакцины-кандидата (Gordon Smith С.Е. (1956) A virus resembling Russian spring-summer encephalitis virus from an Ixodid in Malaya. Nature (London) 178, 581-582; Thind I.S. and Price W.H. (1966a) A chick embryo attenuated strain (TP21 E5) of Langat virus. I. Virulence of the virus for mice and monkeys. Am. J. Epidemiol., 84, 193-213; Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-bome flavivirus dengue-type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 1746-1751). Несмотря на прямую нейровирулентность, измеренную посредством внутрицеребральной инокуляции, наблюдавшуюся для вируса Лангата TP21, его периферийная вирулентность (нейроинвазивность) была значительно меньше, чем у очень вирулентных дальневосточных штаммов ВКЭ, который приводит к заболеваемости у людей со смертностью от 20% до 30%. Несколько штаммов LGT, частично ослабленных для мышей и обезьян, были изолированы и изучались в США, России и Чехословакии (Nathanson N., Thind I.S., О'Leary W. and Price W.H. (1968) Histological studies of the monkey neurovirulence of group В arboviruses. IV. Evaluation of an attenuated strain (E5) of Langat virus. Am. J. Epidemiol. 88,103-112; Price W.H., Thind I.S., Teasdall R.D. and o'Leary W. (1970) Vaccination of human volunteers against Russian spring-summer (RSS) vims complex with attenuated Langat E5 vims. Bull. W.H.O. 42, 89-94; Mayer V., Orolin D., Pogady J., Starek M, Kubistova K., Gajdo-Sova E. and Buran I. (1976) Experimental live tick-borne encephalitis vaccine (Langat E5"14" virus clone): volunteers 1 and 2 years after single-dose immunization. Acta virol, 20, 215-225; Smorodincev A.A. arid Dubov A.V. (1986) Live vaccines against tick-borne encephalitis. In "Tick-Borne Encephalitis and Its Vaccine Prophylaxis", (A.A.Smorodincev, ed.), pp.190-211. Meditsina, Leningrad). Один из таких штаммов, называемый штаммом Еланцева, активно изучался на более чем 600 000 вакцин в России в качестве экспериментальной живой вакцины против ВКЭ в начале 1970-х годов (Smorodincev A.A. and Dubov A.V. (1986) Live vaccines against tick-borne encephalitis. In "Tick-Borne Encephalitis and Its Vaccine Prophylaxis", (A.A.Smorodincev, ed.), pp.190-211. Meditsina, Leningrad). Исследования были прекращены, когда стало понятно, что вакцинация была связана с очень низкой частотностью энцефалита, приблизительно один случай на 20000 иммунизации. Тем не менее этот опыт подтвердил первоначальную точку зрения, что LGT является сильно ослабленным и явно наиболее неопасным членом клещевого флавивирусного комплекса.

Вскоре после этого более ослабленный мутант LGT, названный штаммом E5, был отобран путем 42 переносов в эмбрионных куриных яйцах. LGT E5 проявляет меньшую вирулентность для мышей и обезьян, чем его ТР21-родитель. Позже исследование продемонстрировало, что E5 проявляет меньшую нейровирулентность у мышей, чем его ТР21-родитель (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue-type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 1746-1751). Также в отличие от своего ТР21-родителя Е5 проявлял очень малую нейроинвазивность, и она обнаруживалась только у малой части мышей, инокулированных периферийно с помощью наибольшего возможного количества вируса. Перед тем как рассматривать этот более ослабленный Е5-мутант LGT в качестве потенциального кандидата на использование при профилактике тяжелого заболевания человека, вызываемого определенными членами группы клещевых флавивирусов, в интересах безопасности ученые должны снизить или устранить последние следы вирулентности LGT TP21 и Е5 для мышей посредством стратегии, которая успешно использовалась в прошлом для ослабления вируса Денге, а именно внесения сайто-специфических мутаций в инфекционную полномерную кДНК вируса. Таким образом, существует потребность в клонах полномерной кДНК вируса Лангата.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Конструирование полномерной кДНК генома LGT TP21. (А). Сборка полномерной кДНК TP21 в плазмиде выполнялась с помощью сегментов кДНК, которые клонировались, а их последовательности определялись, как описано ранее (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue-type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 1746-1751) или выделялись длинной ПЦР. (Б). Конструирование полномерной кДНК единственной длинной ПЦР. (В). Сборка полномерной кДНК из двух сегментов кДНК генома, которые выделялись из низкотитрированного вирусного препарата (3,8х10³ БОЕ/мл). Положения сайтов расщепления NotI, Kpnl, Apal, Nsil, и EcoRV в кДНК показаны на А и В пунктирными линиями. Сплошные линии показывают фрагменты кДНК ПЦР или клонированные фрагменты генома TP21. Короткие горизонтальные стрелки указывают положение промотера SP6 или положение праймера; вертикальная сплошная стрелка указывает последующие шаги в стратегии клонирования. Числа на концах фрагментов кДНК LGT представляют положения первого и последнего нуклеотидов генома соответственно. НТ-нумерация выделена из результатов ОТ-ПЦР-последовательности генома ТР21 (Таблица 1). Замечание: Соединение фрагментов BgIII и BamHI в плазмиде р51 или р624-3 устранило сайты расщепления BgIII и BamHI.

Фиг.2. Анализ ПЦР-усиленной кДНК из генома ТР21 с помощью гелевого электрофореза с 0,7% агарозы. ОТ-ПЦР-продукты синтезировались с помощью РНК вируса ТР231, который изолировался из низкотитрированного вируса (дорожка 1; титр 3,8×10³ БОЕ/мл на клетках Веро) или высокотитрированного вируса (дорожка 2, титр 2,4×10⁹ БОЕ/мл на той же клеточной линии). ПЦР выполнялась с помощью олиго 1444 и 1445 в качестве праймеров при условиях, описанных в Примерах, и 10 л реакционной смеси загружались на гель. Фрагменты длиной приблизительно 11 кб (полоса А) представляют завершенную или почти завершенную полномерную геномную кДНК. Она изолировалась из геля и использовалась для транскрипции РНК, которые затем использовались для трансфецирования клеток Веро в культуре. Последовательность более коротких фрагментов длиной приблизительно 4 кб (полоса Б) определялась после извлечения из геля. Маркеры молекулярного веса показаны на дорожке М. Ближайший к вершине маркер соответствует 11 кб.

Фиг.3. Тест на нейроинвазивность двух инфекционных производных от кДНК клонов LGT TP21 на мышах SCID. Сравнение смертности после внутрибрюшинной (ВБ) инокуляции 10² БОЕ клона 636 или 656 со смертностью от неклонированного родительского вируса TP21 и его более ослабленного производного Е5. Ранее описанные химеры TP21/DEN4 и E5/DEN4, инфекционные для нормальных мышей, служили в качестве контроля, который был полностью ослаблен для мышей SCID. С этой целью химеры инокулировались ВБ с большей дозой (то есть 10⁵ БОЕ).

Фиг.4. Конструирование полномерной кДНК генома LGT E5. (А). Сборка полномерной кДНК E5 в плазмиде выполнялась с помощью рТР21-636, который клонировался, а последовательность определялась, как описано ранее, и SfiI(133)-AgeI(9737)-фрагмента, который выделялся путем длинной ПЦР. (Б). Конструкция и положение делеций в 3'-NCR генома E5. Положение сайта расщепления NotI, SfiI, AgeI, AfIII, Kpnl и EcoRV в кДНК показано на (А) и (Б) пунктирными линиями. Сплошные линии показывают фрагменты кДНК ПЦР, производные от генома E5. Короткие горизонтальные стрелки указывают положение промотера SP6 или положение праймера; сплошные вертикальные стрелки указывают последующие шаги в стратегии клонирования. Числа на концах фрагментов кДНК LGT представляют положения первого и последнего нуклеотидов генома соответственно. Нумерация нуклеотидов (нт) ведется по результатам ОТ-ПЦР-последовательности генома E5 (номер доступа GenBank AF253420). Показано положение введенной делеций в 3'-NCR, простирающейся от нт 10379 до положения, указанного над заштрихованными прямоугольниками.

Фиг.5. Последовательность 3'-NCR-соединений делеционных мутантных геномов кДНК. Жирными буквами отмечена нуклеотидная последовательность LGT E5. Сайт расщепления AflII, который использовался для вырабатывания делеций, и кодон ТАА-стоп указаны подчеркиванием. Показаны размер делеций, ее положение и соответствующий плазмидный конструкт.

Фиг.6. Анализ роста родительского E5 и его рекомбинантых производных вирусов в клетках LLCMK₂ (а) обезьяны и в клетках Веро (б). Клетки были инфицированы указанным вирусом при MOI 0,01 с последующей адсорбцией вируса в течение 1 часа, инокулят удалялся и добавлялась свежая среда. Вирус в культурной среде собирался в указанные моменты времени, и его титр определялся путем фокус-формирующего теста на соответствующих клетках, как описано в Примерах.

Краткое описание таблиц

Таблица 1. Различия между геномными последовательностями штаммов LGT ТР21 и Е5, определенные путем анализа последовательности фрагментов вирусного генома, изначально клонированного в Е. coli или тестированного непосредственно после выделения посредством ОТ-ПЦР.

Таблица 2. Вариация последовательности, появившаяся в ходе извлечения инфекционного LGT TP21 из кДНК плазмида.

Таблица 3. Нейроинвазивность родительских штаммов LGT и производных из кДНК вирусных клонов LGT TP21 для взрослых швейцарских мышей.

Таблица А. Мутации, полученные при адаптировании восстановленных в клетках москита химер TP21/DEN4 и E5/DEN4 к эффективному росту в обезьяньих клетках Веро.

Таблица Б. Нейроинвазивность выросших в клетках Веро химер LGT/DEN4, использовавшихся для иммунизации.

Таблица В. Внутрибрюшинная (ВБ) иммунизация разведенных родственным спариванием мышей с помощью низкой дозы химеры Лангата TP21/DEN4(vac) защищает от последующего проверочного ВБ заражения с помощью сильно вирулентного штамма Абсеттарова ВКЭ.

Таблица Г. Внутрибрюшинная (ВБ) иммунизация швейцарских мышей с помощью химер Лангата (LGT)/DEN4 защищает от последующего проверочного ВБ заражения с помощью сильно вирулентного штамма Софьина ВКЭ.

Таблица I. Изменения в согласованной последовательности Е5, появившиеся в ходе клонирования, изъятия Е5 из полномерной кДНК и переноса в обезьяньи клетки Веро или в клеточную культуру фибробластов эмбриона цыпленка (ФЭЦ).

Таблица II. Родословная и снижение нейроинвазивности вируса Лангата (LGT) в ходе переноса в яйца и последующего восстановления из полномерной кДНК и делеции нт320 из ее 3'-некодирующего участка.

Таблица III. Некодирующие или кодирующие изменения в вирусе, восстановленном из мозга умирающих мышей через 14 или 28 дней после ВБ инокуляции с помощью Е5 или рекомбинантного производного из кДНК Е5 (клон Е5-651 или клон Е5-3'-320).

Таблица IV. Реакция на антитела и защитная эффективность штаммов вируса LGT для швейцарских мышей.

Сущность изобретения

Инфекционные клоны кДНК клещевого флавивируса Лангата, отличные от их родителя в плане периферической нейровирулентности.

Штамм клещевого флавивируса Лангата ТР21 (LGT TP21), полученный из клещей, является естественным образом ослабленным для людей, но сохраняет показательную нейровирулентность и периферическую вирулентность ("нейроинвазивность") для мышей. Ранее из LGT TP21 был выделен менее вирулентный для мышей мутантный штамм Е5. Многочисленные попытки приготовить инфекционную полномерную кДНК ТР21 из фрагментов кДНК, клонированных в Е. coli, были одинаково безуспешными. Более информативная последовательность, чем последовательность, полученная из этих клонированных фрагментов кДНК и подобных фрагментов кДНК Е5, была выделена из фрагментов ОТ-ПЦР, которые не были клонированы в Е. coli. Сравнение ОТ-ПЦР-согласованной последовательности ТР21 и Е5 выявило только 7 аминокислотных различий, которые могут отвечать за наблюдаемое различие в вирулентности данных штаммов для мышей. Одиннадцать независимых инфекционных клонов кДНК ТР21 восстанавливались с помощью двух перекрывающихся длинных ОТ-ПЦР-фрагментов. Важно, что низкотитрированный вирус, используемый для приготовления кДНК в качестве шаблона для ПЦР, был собран на ранней стадии цикла роста для минимизации частоты делеционных мутантов, которые накапливаются на поздних стадиях инфекции. 4 проанализированных изъятых клона проявили клон-специфическое минимальное расхождение от согласованной последовательности, но это ограниченное варьирование было связано с уменьшенной периферической вирулентностью для иммунокомпетентных мышей: Генетическое манипулирование этими клонами упростит ослабление вирулентности LGT и ускорит разработку безопасной и эффективной вакцины против клещевого флавивируса, которая защитит от вирусов сильно вирулентного вирусного комплекса клещевого энцефалита.

Химерические вирусы Лангата/Денге защищают мышей от гетерологического контрольного заражения сильно вирулентными штаммами вируса клещевого энцефалита.

Вирус Лангата (LGT), клещевой флавивирус, является естественным образом ослабленным для людей, но он очень вирулентен для мышей SCID.

Напротив, жизнеспособные рекомбинантные химеры LGT (гены preM и Е) и вирус Денге типа 4 (все остальные последовательности), восстановленные в клеточной культуре москита, были полностью ослаблены для мышей SCID, но все равно способны обеспечивать защиту от LGT. Для преобразования этих химер в кандидаты в вакцины мы адаптировали их для эффективной репликации в обезьяньих клетках Веро, удовлетворительном субстрате для человеческих вакцин. Адаптированные химеры оставались полностью ослабленными для мышей SCID и, что важно, обеспечивали защиту иммунокомпетентных мышей от вируса клещевого энцефалита, наиболее вирулентного из клещевых флавивирусов.

Инфекционный клон кДНК ослабленного клещевого флавивируса Лангата (штамм Е5) и сконструированный из него 3'-делеционный мутант проявляют уменьшенную нейроинвазивность для иммунодефицитных мышей (SCID).

Сорок пять лет назад естественным образом ослабленный клещевой флавивирус Лангата (LGT), штамм ТР21, восстанавливался из клещей в Малайзии. После этого он тестировался в качестве живой ослабленной вакцины для вирулентных вирусов клещевого энцефалита. В масштабном клиническом исследовании его ослабленность была подтверждена, но были свидетельства низкого уровня остаточной вирулентности. Тридцать пять лет назад было достигнуто дополнительное ослабление LGT TP21 путем множественных переносов в яйца для получения мутантного Е5. Для изучения генетических детерминантов дополнительного ослабления, проявленного Е5, и для получения возможности манипулировать геномом данного вируса в целях разработки удовлетворительной живой ослабленной клещевой флавивирусной вакцины мы восстановили инфекционный вирус Е5 из клона полномерной кДНК. Рекомбинантный вирус Е5 (клон 651), восстановленный из инфекционного клона полномерной кДНК, был более ослабленным для иммунодефицитных мышей, чем его биологически полученный родитель Е5. Увеличение ослабленности было связано с тремя аминокислотными замещениями, два из которых расположены в структурном белке Е, а одно - в неструктурном белке NS4B. После этого еще большая степень ослабленности была достигнута путем создания жизнеспособной делеции нуклеотида 320 в 3'-некодирующем участке инфекционной полномерной кДНК Е5. Этот делеционный мутант не был цитопатическим в обезьяньих клетках Веро и реплицировался в более низкий титр, чем его родитель Е5-651. Вдобавок, 3'-делеционный мутант Е5 был менее нейроинвазионным для мышей SCID, чем его родитель Е5-651. Важно, что было доказано, что делеционный мутант в 119750 раз менее нейроинвазионен для мышей SCID, чем его предок, LGT штамм TP21. Несмотря на сильный уровень ослабленности, 3'-делеционный мутант Е5 оставался сильно иммуногенным, и ВБ инокуляция 10 БОЕ вызывала полную защиту швейцарских мышей при последующем контрольном заражении с помощью 2000 ВБ LD₅₀ естественного LGT TP21.

Подробное описание изобретения

Инфекционные клоны кДНК клещевого флавивируса Лангата, отличные от своего родителя по периферической нейровирулентности.

Согласованные последовательности генома TP21 и Е5. Полная нуклеотидная последовательность генома некультивированного вируса LGT (штамм TP21) и его более ослабленного производного, штамма Е5, восстановленных после множественных переносов в ткань эмбриона цыпленка, определялась ранее из фрагментов кДНК, клонированных в Е. coli (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Первоначальные попытки приготовить инфекционные клоны полномерной кДНК LGT TP21 из этих фрагментов кДНК, производных из РНК высокотитрированной вирусной суспензии TP21, были одинаково безуспешными (Фиг.1, часть А). Двенадцать стабильных отдельных полномерных кДНК были собраны в плазмидах, но РНК, транскрибированные из этих клонов кДНК, не являлись инфекционными для культуры обезьяньих клеток Веро или клеточной культуры LLCMK₂ по неизвестным в то время причинам. Возможно, это являлось результатом спонтанных мутаций в геноме LGT, которые происходили в ходе амплификации вируса в клетках Веро или в ходе амплификации клонов полномерной кДНК в бактериальном векторе.

По этой причине было решено заново исследовать последовательность генома LGT путем прямого определения последовательности ОТ-ПЦР-фрагментов кДНК без предварительного клонирования в бактериях. Четыре перекрывающихся фрагмента кДНК, представляющие полномерный геном вируса TP21 или Е5, были получены с помощью высокоточной ПЦР, и определялась последовательность этих перерывающихся фрагментов. Последовательность каждого вируса была определена дважды, один раз с помощью фрагментов, которые были выделены из вирусной суспензии с титром 3,8×10³ БОЕ/мл (TP21) или 1,2×10⁴ БОЕ/мл (Е5), и один раз с помощью фрагментов, которые были выделены из вирусной суспензии, которая была собрана на один день позже с титром 2,2×10⁶ БОЕ/мл (TP21) или 4,0×10⁶ БОЕ/мл (Е5). Было обнаружено, что согласованные последовательности геномов обоих штаммов LGT отличаются от ранее опубликованных последовательностей, определенных по фрагментам кДНК, клонированным в Е. coli (Таблица 1). И геном ТР21, и геном Е5 имели длину 10943 нуклеотида (нт) и содержали 5'-некодирующий участок в 130 нт и 3'-некодирующий участок в 568 нт.Последовательность 5'-терминалов обоих штаммов LGT была идентичной. То же самое относится к 3'-терминалам. Предполагалось, что согласованные последовательности ТР21 и Е5, выделенные путем ОТ-ПЦР, являются более информативными для идентификации штамм-специфических мутаций, которые могут отвечать за различия биологических характеристик, чем последовательности, выделенные из фрагментов ДНК, клонированных в Е. coli.

Существует 12 нуклеотидных отличий в согласованной последовательности двух штаммов LGT (TP21 и Е5), из которых 7 дают аминокислотное замещение в оболочечном структурном белке Е или неструктурном белке NS3 или NS5 (Таблица 1). Среди семи аминокислотных изменений в согласованной последовательности ОТ-ПЦР ТР21 и Е5 четыре аминокислотных отличия (Asn₃₈₉ - Asp в Е, Asn₂₂ - Ser, Phe₂₄₈ - Туr и Phe₃₁₇ - Leu в NS3) также наблюдались ранее, когда фрагменты кДНК TP21 и Е5 были клонированы в Е. coli (Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavi virus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Три дополнительных аминокислотных замещения (Phe₁₁₉ - Val в белке Е и Ser₄₂₂ - Thr и Arg₅₄₂ - Lys в белке NS5) были идентифицированы в согласованной последовательности, определенной по ОТ-ПЦР-фрагментам TP21 и Е5. Шесть других аминокислотных различий, которые ранее были обнаружены в последовательности клонированных фрагментов TP21 и Е5 (Pletnev, A. G. and Men, R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751), не были найдены в согласованных последовательностях ОТ-ПЦР. Несколько большая вариативность, наблюдавшаяся для клонированной кДНК, вероятно, отражает бактериальный отбор в процессе клонирования и/или гетерогенность последовательности в вирусных РНК, которые использовались для клонирования кДНК в Е. coli.

Инфекционная полномерная кДНК ТР21. Не придя к успеху в сборке инфекционных кДНК генома ТР21 в бактериях (фиг.1, часть А), мы попытались обойти трудности, связанные с клонированным кДНК в бактериальном векторе, посредством приготовления инфекционной полномерной кДНК с помощью длинной ПЦР. Мы также исследовали возможность того, что спонтанные мутации в геноме LGT могут быть большими для вируса, достигшего высокого титра в ходе расширенного роста в клеточной культуре. Полномерная кДНК вируса ТР21 была получена (фиг.1, часть Б и фиг.2), когда была выполнена высокоточная ПЦР с помощью положительно-чувствительного праймера, содержащего промотер SР6-полимеразы непосредственно над первыми 22 нуклеотидами последовательности LGT, и отрицательно-чувствительного праймера, который был комплементарен для нуклеотидов 10921-10943 3'-терминала LGT. Последний праймер содержал сайт расщепления EcoRV непосредственно после последовательности 3'-конца. Как показано на фиг.2, доминантный продукт ПЦР 1А (дорожка 1, полоса А), выделенный из низкотитрированного вируса (3,8×10³ БОЕ/мл), имел длину приблизительно 11 кб. Напротив, продукт ПЦР 2А (дорожка 2, полоса А), выделенный из высокотитрированного вируса (2,4×10⁹ БОЕ/мл), содержал очень мало полномерной кДНК, в то время как главный продукт был значительно короче, приблизительно 4 кб (дорожка 2, полоса Б). Анализ последовательности показал, что этот фрагмент (дорожка 1 или 2, полоса Б) представлял усеченный геном LGT на протяжении от нт 1 до нт 3779, который был присоединен к последним 23 нуклеотидам 3'-конца генома, присутствующего в отрицательно-чувствительном праймере (олиго 1445), который использовался для ОТ и ПЦР. Следует отметить, что последние семь нуклеотидов на 3'-конце олиго 1445 также были комплементарны для последовательности генома LGT в нуклеотидных позициях 3780-3786. Возможно, более короткие продукты (дорожка 1 или 2, полоса Б) были получены путем связывания праймера с данным альтернативным сайтом на вирусном геноме во время амплификации посредством ОТ-ПЦР, а не с измененной последовательностью 3'-терминала, с выбором по высокой множественности переноса.

Фрагменты кДНК ОТ-ПЦР приблизительно полной длины (полоса А, дорожка 1 или 2; фиг.2) расщеплялись с помощью EcoRV, и транскрипты РНК из этих шаблонов тестировались на инфекционность в клетках Веро. Свидетельства инфекции в клетках Веро были обнаружены с помощью иммунофлюоресцентного теста (ИФТ) на 12 день с помощью специфических для LGT антител. В этот момент 80-90% клеток, трансфецированных РНК из ПЦР-продукта 1А, были положительными, в то время как только несколько ИФТ-положительных клеток наблюдалось при использовании транскриптов РНК из ПЦР-продукта 2А. Это показывает, что инфекционная кДНК восстанавливалась наиболее эффективно, если в качестве источника полномерной кДНК генома использовалась низкотитрированная вирусная суспензия. Это, вероятно, отражает изменение в геноме вирусной РНК, которое появляется с большей частотой во время более длительного периода вирусной репликации, требуемой для достижения высокого титра. По этой причине вирусная РНК из низкотитрированной вирусной суспензии ТР21, собранная через два дня после инфицирования, использовалась для конструирования полномерной кДНК ТР21.

Восстановление вирусов LGT из клонированной кДНК и их характеризация. Два перекрывающихся фрагмента кДНК (фиг.1, часть В) были приготовлены посредством длинной ПЦР с помощью ОТ-продукта, выделенного из РНК низкотитрированного вирусного материала ТР21 (3,8×10³ БОЕ/мл). ПЦР-продукт (приблизительно 6,1 кб), представляющий 3'-участок генома, был клонирован в бактериальном векторе р5'-2 (NotI, XhoI, AHindIII) в два шага, как описано в Примерах и проиллюстрировано на фиг.1 (часть В). Результирующий клон р624-3, содержавший нуклеотиды LGT от 4539 до конца генома, был выбран на основе ограниченного ферментного анализа. После этого оставшаяся 5'-последовательность генома ТР21 (приблизительно 4,8 кб) вместе с промотером SP6, присутствующим на 5'-конце непосредственно над последовательностью LGT, была выработана путем длинной ПЦР и лигирована в NotI и ApaI-расщепленный плазмид р624-3. Клонирование данного конструкта в Е.coli дало двадцать восемь стабильных клонов полномерной кДНК LGT TP21. Однако наблюдался некоторый полиморфизм среди стабильных полномерных кДНК LGT по отношению к схеме расщепления рестриктного фермента. Последовательность из четырех плазмидов (рТР21-636, рТР21-649, рТР21-656 и рТР21-689) была проанализирована, и было обнаружено, что она очень близко соответствует согласованной последовательности ТР21.

Перед получением избыточных транскриптов шаблон плазмидной ДНК был линеаризован в сайте расщепления EcoRV, который представлен тремя нуклеотидами ниже 3'-конца последовательности LGT TP21. Вследствие этого РНК-транскрипты содержали три дополнительных нуклеотида GAU на 3'-терминале, а также дополнительный остаток G на 5'-терминале. Полномерная РНК, выработанная SР6-полимеразой из 28 различных плазмидов, была протестирована на инфекционность путем трансфецирования в клетки ВНК хомяка или в обезьяньи клетки Веро или в клетки LLCMK₂. Одиннадцать отдельных клонов кДНК LGT TP21 были инфекционными. Свидетельства вирусной инфекции были обнаружены путем ИФТ с помощью LGT-специфической гипериммунной мышиной асцитической жидкости (ГМАЖ) в 80-100% трансфецированных клеток в день 5. Дополнительные свидетельства того, что восстановленные вирусы являлись LGT, были получены путем сравнения LGT-специфических белков, которые вырабатывались родительским кДНК-вирусом TP21 или его кДНК-вирусом-предком в инфицированных клетках ВНК, Веро или LLCMK₂, что было продемонстрировано тестом иммунопреципитации с помощью LGT-специфической ГМАЖ или моноклональных антител. Специфические инфекционности РНК-транскриптов, которые были выделены из трех различных клонов кДНК, находились в диапазоне от 8×10³ до 2×10⁵ БОЕ/мкг.Это было значительно ниже, чем инфекционность РНК вириона TP21, которая составляла 4×10⁶ БОЕ/мкг при измерении на клетках Веро при таких же экспериментальных условиях. Штамм-препараты изъятых клонов TP21 были получены путем переноса вируса в клетках Веро и сбора всплывшей среды инфицированных культур. Вирусный титр четырех изъятых клонов TP21: ТР21-636, ТР21-649, ТР21-656 и ТР21-689 (обозначаемых 636, 649, 656 и 689), измеренный посредством бляшкового теста на клетках LLCMK₂, варьировался от 1,2×10⁷ до 2,4×10⁸ БОЕ/мл через 7 дней после инфицирования.

Изъятые производные от кДНК клоны LGT давали характеристические бляшки LGT TP21 диаметром 3,5 мм на клетках LLCMK₂ через 7 дней после инфицирования, кроме вируса 649, который давал маленькие бляшки со средним диаметром 0,8 мм. Репликация вируса была дополнительно проанализирована путем отслеживания вирусного титра на 0,1, 2, 3, 4 и 5 день после инфицирования клеток Веро. Не наблюдалось значительных различий между ростом восстановленных клонов LGT и их родительского вируса.

Анализ нуклеотидной последовательности восстановленных вирусов. Четыре вируса, восстановленные из трансфекции клеток Веро (то есть клоны 636, 649, 656 и 689) были амплифицированы путем дополнительного переноса в клетках Веро, и РНК вириона использовалась для ОТ-ПЦР. Последующее определение последовательности полного генома изъятого вируса выполнялось с помощью четырех перекрывающихся ПЦР-фрагментов без предварительного клонирования в Е. coli. Мутации в таких РНК-вирусах, как LGT, могут аккумулироваться в процессе ОТ-ПЦР, бактериального клонирования генома кДНК и/или в процессе адаптации и распространения вируса в клеточной культуре. Чтобы лучше понять источник генетической вариативности вновь восстановленных вирусов LGT: (i) анализ последовательности 5'-половины генома (нуклеотиды 1-5300) для каждого изъятого вируса выполнялся дважды в независимых экспериментах, в которых был выращен вирус, вирусная РНК изолировалась и подвергалась ОТ-ПЦР; последовательность 3'-половины вирусного генома определялась подобным же образом, но только один раз; и (ii) также определялась нуклеотидная последовательность вирусной вставки в каждый из четырех плазмидов, из которых были выделены инфекционные РНК-транскрипты.

Анализ четырех выбранных инфекционных клонов ТР21 выявил шесть отличий аминокислотной последовательности от согласованной последовательности Е5, ранее определенной путем ОТ-ПЦР ее геномных фрагментов (Таблица 1). Эти отличия наблюдались в позициях: 119 и 389 в Е; 22, 248 и 317 в NS3 и 542 в NS5. Таким образом, четыре изъятых клона содержали согласованную последовательность ТР21 в 6 из 7 позиций, в которых ТР21 отличается от своего производного Е5. Каждый инфекционный клон содержал Thr в позиции 422 в NS5 подобно Е5, вместо остатка Ser в NS5 ТР21 (Таблица I).

Существовали три сохраненные нуклеотидные изменения, идентифицированные в 3'-половине генома каждого из данных четырех восстановленных вирусов, не показанные в Таблице 1. Во-первых, изменение А₁₀₄₃₆→G появлялось в 3'-некодирующем участке, а два остальных изменения были обнаружены в генах неструктурного белка NS3 (A₅₂₅₇→G) и NS5 (G₉₇₃₄→A), которые вызывали замещение Thr₂₅₄→Ala в белке NS3 и замещение Asp₆₉₁→Asn в белке NS5. Нуклеотидные остатки G₅₃₅₇, А₉₇₃₄ и G₁₀₄₃₆, присутствующие в геноме восстановленных вирусов, были найдены также в плазмидной ДНК, из которой был выделен каждый из этих вирусов, и в промежуточном конструкте, плазмиде р624-3. Это предполагает, что данные изменения появились в процессе клонирования в Е. coli и являлись преимущественными для амплификации плазмидов, содержащих LGT-последовательности, либо эти отличия могут отражать "квазивиды" вируса с положительной спиралью РНК. В поддержку последнего объяснения следует заметить, что нуклеотидная вариативность G/A в позиции 9734 или позиции 10436 наблюдалась в согласованной последовательности генома ОТ-ПЦР ТР21, выделенном из высокотитрированного вирусного материала.

Анализ последовательности показал также наличие нескольких дополнительных уникальных отличий от согласованной последовательности ТР21 в 5'-половине генома каждого из 4 изъятых клонов (Таблица 2). Четырнадцать из восемнадцати нуклеотидных отличий от согласованной последовательности ТР21 присутствовали также в плазмидной ДНК, из которой были выделены эти 4 клона. Это является свидетельством того, что клоны являются производными кДНК. Из всех наблюдавшихся 18 нуклеотидных отличий между согласованной последовательностью ТР21 и последовательностями четырех изъятых вирусных геномов 10 давали аминокислотное замещение в структурном белке preM или Е или в неструктурном белке NS2A или NS2B. По меньшей мере три нуклеотидных изменения (C₄₂₉₉→U в клонах 636 и 689; A₅₉₀→G и C₄₄₂₉→U в клоне 656, подчеркнуты в Таблице 2) появлялись в процессе РНК-транскрипции и трансфецирования клеток Веро или распространения вируса в клеточной культуре, поскольку эти мутации не были представлены в шаблонах плазмидной ДНК, из которых были выделены эти вирусы.

Клон 636 содержал три нуклеотидных отличия от согласованной последовательности ТР21, только два из которых приводили к аминокислотным замещениям. Замещение His₄₃₈ на Туr, расположенное около трансмембранного участка оболочечного белка Е, появлялось в позиции, которая является сильно защищенной среди москитных и клещевых флавивирусов (Pletnev A.G., Yamshchikov V.F. and Blinov V.М. (1990) Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus. Virology 174, 250-263; Gritsun Т.S., Holmes E.C. and Gould E.A. (1995) Analysis of flavivirus envelope proteins reveals variable domains that reflect their antigenicity and may determine their pathogenesis. Virus Research 35, 307-321). Еще одно аминокислотное изменение Ala₃₂→Val в неструктурном белке NS2B было также представлено в значительной пропорции вирионов клона 689.

Клон 649 отличался от родительского вируса ТР21 в большей степени, нежели прочие вирусы, поскольку его вирусный геном содержал 7 нуклеотидных отличий (Таблица 2). Три из этих мутаций были скрытыми, в то время как остальные четыре вызывали аминокислотное замещение в белке NS2A или NS2B. Возможно, эти уникальные мутации отвечали за 4-кратное уменьшение размера бляшки клона 649 на клетках LLCMK₂ по сравнению с родительским ТР21 и другими изъятыми вирусами. Интересно, что клоны 649 и 689 имели три общих нуклеотидных изменения в позициях 2230, 3001 и 3599. Одна из этих мутаций вызывала замену Рго29 в N-терминальном участке белка NS2A на остаток Ser, который сохраняется среди вирусов комплекса ВКЭ (Pletnev A.G., Yamshchikov V.F. and Blinov V.М. (1990) Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis vims. Virology 174, 250-263).

Аминокислотное замещение в структурном белке preM (Met₃₈→Val) и Е (Asp₃₀₈→Ala), а также две скрытые мутации были выявлены в клоне 656. Поскольку трехмерная структура и функция N-терминальной части белка preM неизвестны, роль изменения Met₃₈→Val в белке preM трудно оценить. Замещение Asp→Ala в позиции 308 появлялось в домене III белка Е, который предположительно играет роль в нейровирулентности клещевых и москитных флавивирусов для мышей (78, 2711-2722). Ранее также отмечалось, что вирус болезни Лупинга, флавивирус комплекса ВКЭ, проявляет уменьшенную нейроинвазивность для мышей после одного аминокислотного замещения Asp→Asn в белке Е в позиции 308 (Jiang W.R., Lowe A., Higgs S., Reid H. and Gould E.A. (1993) Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neurovirulence. J. Gen. Virol., 74, 931-935). Таким образом, клон 656 LGT может предлагать еще одну возможность исследования воздействия мутации (Asp→Ala) в позиции 308 в Е на нейроинвазивность для мышей.

Оценка кДНК-производных вирусов на мышах. Мыши использовались в качестве экспериментальной модели для сравнения восстановленных клонов LGT и их родительского вируса в отношении уровня нейроинвазивности, то есть способности вируса распространяться из периферийного сайта в центральную нервную систему и вызывать энцефалит. Сначала взрослые аутбридинговые швейцарские мыши инъецировались внутрибрюшинно (ВБ) с помощью 10⁴ или 10⁶ БОЕ каждого вируса, и записывалась смертность в течение 28 дней (Таблица 3). Ранее было показано, что некультивированный LGT штамм ТР21 вирулентен для швейцарских мышей в возрасте 3 недель с внутрибрюшинной LD₅₀, равной 10^3,7 БОЕ (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Два клона, вирусы 649 и 689, проявили меньшую периферическую вирулентность, чем их родитель LGT TP21, поскольку только у 12,5% или 40% соответственно взрослых мышей, инокулированных ВБ с помощью 200 LD₅₀ (10⁶ БОЕ), развились симптомы энцефалита, и они умерли. Смерть не происходила при инокулировании мышей с помощью 10⁴ БОЕ вируса 649. Эти два вируса имели только одно общее аминокислотное изменение Рго29 в Ser в белке NS2A, которое может быть связано с уменьшенной периферической нейровирулентностью данных изъятых вирусов для нормальных мышей. Два оставшихся изъятых клона, вирусы 636 и 656, вместе с ослабленным штаммом Е5 LGT, были еще более ослаблены, чем родительский LGT TP21, в отношении нейроинвазивности. Это показывает, что данные клоны и LGT E5 были по меньшей мере в 200 раз менее нейроинвазивными для нормальных иммунокомпетентных мышей, чем их родитель LGT TP21.

В более раннем исследовании (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751) ослабленный штамм E5, выделенный из TP21, проявил периферическую нейровирулентность для взрослых мышей только тогда, когда количество инокулированного вируса возрастало до 10⁷ БОЕ или когда для измерения нейроинвазивности использовалась более чувствительная тестовая система, такая, как мыши SCID. Для оценки нейроинвазивности более ослабленных изъятых вирусов (клоны 636 и 656) мыши SCID, которые по меньшей мере в 10⁶ раз более чувствительны, чем нормальные мыши, при обнаружении периферической нейровирулентности, инокулировались ВБ с помощью 10² БОЕ (Фиг.3) (Pletnev, A. G. and Men, R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Клон 636 не проявил отличий в нейроинвазивности от своего родителя ТР21 для мышей SCID. Клон 656 также убил всех инокулированных мышей за период наблюдений, но время выживания увеличивалось по меньшей мере вдвое. Последняя 656-инокулированная мышь умерла на 34 день после инфицирования, что на 21 день позже, чем последняя смерть среди ТР21-инокулированных мышей. Данная задержка смерти предполагает, что клон 656 реплицируется и распространяется медленнее в иммунодефицитных мышах. По этой причине данный клон изучался более подробно. Его LD₅₀ была оценена путем инокулирования групп по 5 мышей SCID ВБ с помощью 1, 10 или 100 БОЕ. Полученное таким образом оценочное значение LD₅₀ равнялось 40 БОЕ. Таким образом, клон 656 был в 10⁴ раз менее нейроинвазионным, чем ТР21 (оценочная LD₅₀ для мышей SCID равна 0,004 БОЕ), и в 6,6×10² раз менее патогенным, чем Е5, ослабленное производное ТР21 (оценочная LD₅₀ для мышей SCID равна 0,06 БОЕ) (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Тем не менее уровень ослабленности клона 656 был значительно ниже, чем уровень ослабленности, достигаемый химерическими вирусами LGT/Денге (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751), а также химерами ВКЭ/DEN4 (Pletnev A.G., Bray М., Higgins J. and Lai C.-J. (1992) Construction and characterization of tick-borne encephalitis/dengue type 4 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10532-10536; Pletnev A.G., Bray M. and Lai C.-J. (1993) Chimeric tick-bome encephalitis and dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice. J.Virol., 67, 4956-4963) (Dr. J.Higgins, USAMRIID, личное общение). Отсутствие обнаруживаемой нейроинвазивности химер TP21/DEN4 и E5/DEN4 для мышей SCID было подтверждено, когда мыши, инокулированные ВБ дозой 10⁵ БОЕ, выжили в течение периода наблюдений (фиг.3).

Анализ последовательности полученных с помощью ОТ-ПЦР фрагментов кДНК генома некультивированного штамма LGT TP21 и его ослабленного производного, штамма Е5, позволил идентифицировать мутации, которые могут отвечать за отличия в периферической нейровирулентности этих штаммов для мышей и обезьян, а также отличия в скорости роста в клетках HeLa (Thind and Price, 1966a и 1966b; Nathanson et al., 1968; Price and Thind, 1973). Было идентифицировано только 7 аминокислотных отличий в согласованных последовательностях полипротеинов данных штаммов (Таблица 1); четыре из этих изменений наблюдались ранее, когда фрагменты кДНК обоих штаммов LGT были клонированы в Е. coli (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Только два из семи аминокислотных отличий (Phe₁₁₉ в Val и Asn₃₈₉ в Asp) были расположены в структурном белке Е. Мутация Asn₃₈₉ в Asp была расположена на латеральной поверхности домена III белка Е и соответствовала сайту, мутация в котором предположительно ослабляет ВКЭ или вирус энцефалита долины Мюррей для мышей (Rey F.A., Heinz F.X., Mandl С., Kunz С.and Harrison S.С.(1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature 375, 291-298; Monath Т.P. and Heinz F.X. (1996) Flaviviruses. In "Fields Virology". (B.N. Fields, D.M.Knipe & P.N.Howley, Eds.), 3rd ed., pp.961-1035. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia & New York.; McMinn P.C. (1997) The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses, J. Gen. Virol., 78, 2711-2722).

Идентификация одной или нескольких мутаций, отвечающих за увеличенную ослабленность штамма LGT E5 по сравнению с его родителем, штаммом LGT TP21, теперь может быть достигнута с помощью обратной генетики. Наш успех при изъятии LGT TP21 из вирусной кДНК позволит исследовать молекулярную основу наблюдаемого различия нейроинвазивности LGT TP21 и производного его переноса в тканевую культуру, LGT E5, для мышей и обезьян (Thind I.S. and Price W.H. (1966a) A chick embryo attenuated strain (TP21 E5) of Langat virus. I. Virulence of the virus for mice and monkeys. Am. J. Epidemiol., 84, 193-213; Thind I.S. and Price W.H. (1966b) A chick embryo attenuated strain (TP21 E5) of Langat virus. II. Stability after passage in various laboratory animals and tissue culture. Am. J. Epidemiol., 84, 214-224; Nathanson N., Thind I.S., O'Leary W. and Price W.H. (1968) Histological studies of the monkey neurovirulence of group В arboviruses. IV. Evaluation of an attenuated strain (E5) of Langat virus. Am. J. Epidemiol. 88, 103-112). Изначально делались попытки сконструировать инфекционные клоны полномерной кДНК TP21 из фрагментов кДНК, которые ранее были клонированы в Е. coli с целью анализа последовательности. У РНК-транскриптов клонов полномерной кДНК, сконструированных из этих сегментов ДНК, постоянно отсутствовала инфекционность. Неспособность этих полномерных кДНК служить в качестве шаблонов для инфекционной РНК, вероятно, была проявлением отклонения от согласованной последовательности, которому способствовал высокий титр вируса, использованного для клонирования кДНК в Е. coli, и сама процедура клонирования в данной бактерии. Это объяснение согласуется с 18 нуклеотидными отличиями (Таблица 1), которые были идентифицированы между последовательностью клонированных фрагментов кДНК генома ТР21, выделенного из высокотитрированного вирусного материала, и согласованной последовательностью ОТ-ПЦР-фрагментов ТР21, которые не были предварительно клонированы в Е. coli, и которые были выделены из низкотитрированной вирусной суспензии, которая была собрана на ранней стадии своей многоциклической кривой роста. Чтобы минимизировать частотность спонтанных мутаций во время приготовления вируса, низкотитрированная суспензия вируса ТР21 использовалась для конструирования генома полномерной кДНК из длинных ОТ-ПЦР-фрагментов. Успех при вырабатывании инфекционной РНК из полномерной кДНК генома ТР21 был достигнут при использовании этой стратегии. Изъятие вируса было значительно более эффективным при использовании низкотитрированного вируса (3,8×10³ БОЕ/мл) для приготовления полномерной кДНК путем длинной ПЦР, чем при использовании в этих целях высокотитрированного вируса (2,4×10⁹ БОЕ/мл). После этого, когда полномерная кДНК, выделенная из низкотитрированной суспензии ТР21, была сконструирована из двух длинных перекрывающихся ОТ-ПЦР-фрагментов и клонирована в Е. coli, РНК-транскрипты из 11 из 28 стабильных клонов кДНК являлись инфекционными в обезьяньей клеточной культуре.

Три нуклеотидных изменения (С₄₂₉₉ в U в клонах 636 и 689; А₅₉₀ в G и С₄₄₂₉ в U в клоне 656) были идентифицированы, когда последовательность четырех из изъятых вирусов была сравнена с последовательностью плазмидных ДНК, из которых были восстановлены эти четыре вируса. Предположительно эти 4 изменения стали результатом мутаций, которые произошли во время изъятия инфекционного вируса из плазмидной ДНК. Остальные 14 нуклеотидных отличий от согласованной последовательности ТР21, идентифицированные в изъятых вирусах, присутствовали также в плазмидной ДНК, из которой были выделены 4 клона (Таблица 2). Это означает, что данные мутации произошли раньше, то есть до или во время сборки ОТ-ПЦР-фрагментов в плазмидную полномерную кДНК, возможно, еще во время спонтанного развития полиморфизма последовательности в вирусной суспензии ("квазивидов"), использованного для ОТ-ПЦР-амплификации.

Следует отметить, что шесть из семи аминокислот согласованной последовательности, которые отличают LGT TP21 от его производного Е5, сохранялись в каждом из изъятых клонов TP21 (Таблица 1), в то время как седьмая ТР21/Е5 вариантная аминокислота (Lys₅₄₂ в NS5), сохраненная в каждом из клонов, была аминокислотой из Е5.

Четыре изъятых вируса содержали согласованную последовательность ТР21/Е5 (то есть последовательность, общую для обоих вирусов. Таблица 1) за тем исключением, что каждый из четырех клонов имел три нуклеотидных замены (А₅₃₅₇ на G, G₉₇₃₄ на А и А₁₀₄₃₆ на G), которые также были представлены в плазмиде р624-3 и его производных, то есть клонах полномерной кДНК, из которых были восстановлены вирусы. Возможно, эти изменения в каждом из восстановленных вирусов отвечают за уменьшенную периферическую нейровирулентность, наблюдавшуюся у швейцарских мышей, по сравнению с родительским вирусом ТР21. Клоны 649 и 689 вызывали энцефалит и смерть у нормальных мышей, которые инокулировались ВБ, только при использовании большой дозы, 10⁶ БОЕ (Таблица 3). Интересно, что и вирус 649, и вирус 689 не отличались от вируса ТР21 по аминокислотной последовательности их структурных белков (Таблицы 1 и 2), но эти изъятые вирусы обладали одной общей заменой Pro₂₉ на Ser в неструктурном белке NS2A. Наличие мутаций в структурных белках клонов 636 и 656 было связано с несколько большим уменьшением нейроинвазивности для нормальных мышей. У обоих этих изъятых вирусов отсутствовала обнаруживаемая нейровирулентность, когда иммунокомпетентные мыши инокулировались ВБ с помощью 10⁶ БОЕ. Напротив, при инокулировании мышей SCID ВБ клон 636, который содержал мутацию His₄₃₈ в Туr в белке Е и Ala₃₂ в Val в белке NS2B, не отличался от своего родителя ТР21 по нейроинвазивности для мышей SCID; оба вируса были сильно нейроинвазионными. Таким образом, данные две мутации в клоне 636 снижали нейроинвазивность для нормальных мышей, но не полностью устраняли это свойство при тестировании на высокочувствительных мышах SCID. В ходе предшествующего исследования наблюдалось, что мыши SCID в 10⁶-10⁷ раз более чувствительны, чем нормальные мыши, при обнаружении нейроинвазивности (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,1746-1751).

У мышей SCID клон 656 (LD₅₀ равна 40 БОЕ) был в 10⁴ раз менее нейроинвазионным по сравнению с родительским вирусом ТР21 (LD₅₀ равна 0,004 БОЕ). Однако, когда мыши SCID инокулировались ВБ с помощью 10² БОЕ (2,5 LD₅₀) клона 656, среднее время выживания мышей увеличивалось вдвое. Ослабление клона 656, вероятно, является результатом уникальных мутаций в структурных белках (Met₃₈→Val в ргеМ и Asp₃₀₈→Ala в белке Е). Роль каждого из этих замещений в ослаблении нейроинвазивности LGT подразумевается. Интересно, что ослабление другого клещевого флавивируса, вируса болезни Лупинга, было связано с одной аминокислотной мутацией в белке Е в позиции 308 (Asp→Asn) или 310 (Ser→Pro) (Jiang W.R., Lowe A., Higgs S., Reid H. and Gould E. A. (1993) Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neurovirulence. J. Gen. Virol., 74, 931-935). Вдобавок, мутации белка Е, которые были расположены в позиции 308 или рядом с ней и которые оказывали воздействие на вирулентность москитных флавивирусов, наблюдались также в вирусе желтой лихорадки и вирусе японского энцефалита (Schlesinger J.J., Chapman S., Nestorowicz A., Rice С.R., Ginocchio Т.Е. and Chambers Т.J. (1996) Replication of yellow fever virus in the mouse central nervous system: Comparison of neuroadapted and non-neuroadapted virus and partial sequence analysis of the neuroadapted strain. J. Gen. Virol., 77, 1277-1285; Ni H. and Barrett A.D.T. (1998) Attenuation of Japanese encephalitis virus by selection of its mouse brain membrane receptor escape variants. Virology 241, 30-36; McMinn P.C. (1997) The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses. J. Gen. Virol., 78, 2711-2722). Эти открытия в сочетании с наблюдением ослабления клона 656 поддерживают гипотезу, что этот сайт играет важную роль в вирулентности.

Мы также попытались достичь большей ослабленности LGT путем конструирования двух мутантов клона 656. Перенос мутации His₄₃₈→Tyr из клона 636 в последовательность белка Е клона 656 для замены его соответствующей последовательности ухудшил инфекционность полученной химеры. Было инициировано инфицирование химерическим вирусом 656/636 в 100%-РНК-трансфецированных обезьяньих клетках, но инфекция не развивалась до стадии созревания и высвобождения инфекционного вируса. Транскрипты РНК из еще одного конструкта, содержавшего мутацию Pro₂₉→Ser в гене NS2A клона 649, а остальную последовательность, взятую у клона 656, вырабатывали жизнеспособный вирус в клетках LLCMK₂. Исследования на швейцарских мышах показали, что этот химерический мутант, подобно своему родительскому вирусу 656, не вызывал смерти или энцефалита при инокулировании нормальных мышей ВБ при помощи дозы 10⁶ БОЕ. Эти два вируса также не отличались при тестировании на мышах SCID; оба приводили к летальному энцефалиту после длительного инокуляционного периода. Это указывает на то, что нейроинвазивность для мышей SCID не была снижена при комбинировании мутаций из клона 656 и мутации в белке NS2A из клона 649 в одном вирусе.

Наконец, 4 восстановленных вируса проявляли спектр периферической нейровирулентности у мышей, вероятно, за счет различной схемы мутаций, идентифицированных путем анализа последовательностей геномов изъятых вирусов. Два изъятых вируса (649 и 689) проявляли умеренно меньшую нейроинвазивность для иммунокомпетентных взрослых швейцарских мышей, чем их родитель ТР21, в то время как два остальных клона (636 и 656) проявляли нейроинвазивность только для мышей SCID. Вирус 656 сохранял нейроинвазивность для мышей SCID, но казался ослабленным для этих иммунодефицитных мышей по сравнению со своим родителем ТР21 или штаммом Е5 (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Ослабленный штамм Е5 сначала выбирался из штамма ТР21 посредством многочисленных переносов в клеточной культуре эмбриона цыпленка в качестве потенциальной живой вирусной вакцины-кандидата для защиты от заболеваний, вызываемых членами комплекса ВКЭ (Price W.H., Thind I.S., Teasdall R.D. and O'Leary W. (1970) Vaccination of human volunteers against Russian spring-summer (RSS) virus complex with attenuated Langat E5 virus. Bull. W.H.O. 42, 89-94). E5 проявил сниженную нейровирулентность для обезьян, которая была ниже, чем нейровирулентность вакцинного штамма 17D вируса желтой лихорадки (Nathanson N., Thind I.S., O'Leary W. and Price W.H. (1968) Histological studies of the monkey neurovirulence of group В arboviruses. IV. Evaluation of an attenuated strain (E5) of Langat virus. Am. J. Epidemiol. 88, 103-112). Доступность инфекционной кДНК клона 656 обеспечивает основу для дальнейших исследований, разработанных для удаления оставшихся следов нейроинвазивности для иммунодефицитных мышей, что было достигнуто ранее путем конструирования химерических вирусов Лангата/Денге (Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-bome flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751).

Доступность инфекционной полномерной кДНК вируса Лангата позволяет нам ослабить вирус Лангата путем введения сайт-специфических ослабляющих мутаций. Этот результат позволяет нам конструировать ослабленные мутанты, которые оцениваются с точки зрения ослабленности и иммуногенности на взрослых добровольцах. Данный успех ведет к разработке удовлетворительно ослабленных живых вирусных вакцин для использования при предотвращении важного клещевого флавивирусного заболевания.

Химерические вирусы Лангата/Денге защищают мышей от гетерологического контрольного заражения с помощью сильно вирулентных штаммов вируса клещевого энцефалита.

Характеризация перенесенных в клетки Веро химер LGT/DEN4. Два жизнеспособных химерических вируса, содержащие гены preM и Е некультивированного штамма ТР21 LGT или его более ослабленного производного, штамма Е5 LGT, а остаток последовательности, выделенный из DEN4, были восстановлены после трансфецирования москитных клеток С6/36 с помощью транскриптов РНК полной длины химерического генома полномерной кДНК; однако инфекционный вирус не мог быть восстановлен после трансфецирования обезьяньих клеток (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Следует отметить, что первые из этих клеток считаются непригодными для приготовления человеческих вакцин. Изначально и у химеры TP21/DEN4, и у химеры E5/DEN4, восстановленных в москитных клетках, была значительно снижена эффективность вирусной репликации и образования бляшки в обезьяньих клетках по сравнению с родительским вирусом ТР21 или Е5, а также с родительским DEN4. Тем не менее было возможно адаптировать химерические вирусы для эффективного роста в сертифицированных клетках Веро (питательная среда ВОЗ, 143 перенос; Novavax, Inc., Rockville, MD), пригодных для использования при производстве человеческих вакцин. Это выполнялось путем инокулирования клеток Веро с помощью вируса TP21/DEN4 или E5/DEN4 со множественностью инфекции (МИ) 1 или 5 и сбора вирусных бляшек от 2 до 4,5 мм, которые развивались через 10 дней инкубации при 37°С.Эти бляшковые изоляты затем подвергались четырем переносам из бляшки в бляшку в клетках Веро в ходе успешной попытки выбрать вирус, который растет до более высокого титра и вырабатывает бляшки более эффективно. Материал питательной среды выделенных в культуре клеток Веро вирусов TP21/DEN4 или E5/DEN4 приготавливался путем переноса четырежды перенесенного в бляшке вируса в клетках Веро.

Адаптированные в клетках Веро вакцины-кандидаты (обозначаемые "вак") TP21/DEN4(вак) и E5/DEN4(вак) затем сравнивались друг с другом и со своими родительскими вирусами в отношении нейроинвазивности для мышей, морфологии бляшки и максимальной продуктивности в обезьяньих и москитных клетках. Титр, достигнутый адаптированными в клетках Веро химерами TP21/DEN4(BaK) и Е5/ОЕМ4(вак), был равен 4,6×10⁶ БОЕ/мл и 3×10⁶ БОЕ/мл в клетках Веро и 1×10⁶ БОЕ/мл и 1×10⁶ БОЕ/мл в москитных клетках С6/3 соответственно, что указывает на достижение паритета.

Увеличенное цитопатическое воздействие адаптированных в клетках Веро химер в клетках Веро предполагает, что мутации в диапазоне хозяев в вирусном геноме были выбраны в ходе адаптации и распространения данных вирусов в обезьяньих клетках. С этой целью частичная последовательность обоих химерических вирусных геномов была определена посредством ОТ-ПЦР-анализа РНК, экстрагированной из очищенных вирионов, для проверки их химерической структуры и идентификации мутаций, которые могут играть роль в адаптации в клетках Веро. Пары праймеров (олиго 239 и олиго 442; см. в (Pletnev A.G., Bray M. and Lai C.-J. (1993). Chimeric tick-borne encephalitis and dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice. J. Virol. 67, 4956-4963)), амплифицирующих геном DEN4 от нуклеотида 18 до нуклеотида 2832, использовались для выработки ПЦР-продуктов. Нуклеотидная последовательность 5'-некодирующего участка, генов структурного белка и гена NS1 неструктурного белка каждого выделенного в клетках Веро химерического генома, в том числе соединений С/preM и E/NS1, определялась и сравнивалась с опубликованной последовательностью соответствующего выделенного в культуре москитных клеток химерического вирусного генома (Таблица A) (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Было идентифицированы только три аминокислотных отличия, которые были расположены в последовательности белков preM и Е химеры ТР21/DЕN4(вак), которая была перенесена 5 раз в клетках Веро с последующим восстановлением в москитных клетках С6/36. При подобном сравнении было только 8 нуклеотидных отличий в последовательности адаптированной в клетках Веро химеры Е5/DЕN4(вак), 6 из которых вырабатывали аминокислотное замещение и были расположены в оболочечном структурном белке (Е). Одинаковые аминокислотные замещения в Е в позиции 296 (Lys на Gln) и в позиции 310 (Thr на Ala) были задокументированы в двух химерах. Эти общие мутации могут играть роль в изменении клеточного тропизма.

Изменение в нуклеотидной позиции 1437 генома Е5/DЕN4(вак) приводит к аминокислотному замещению Thr₁₅₁на Ile в потенциальном сайте гликозилирования белка Е. Иммунопреципитация вирусных белков Е из лизатов клеток Веро, инфицированных с помощью либо родительского вируса LGT, либо его химерического вируса, показала различие в гелевой миграции белка Е родительского вируса Е5 и химерического вируса Е5/DEN4(вак). Белок Е химеры E5/DEN4 мигрировал несколько быстрее, чем белок Е вируса Е5. Вероятно, это отражает потерю одного из трех потенциальных N-связанных сайтов гликозилирования в белке Е. Напротив, мобильность геля гликопротеина Е ТР21 и его химерического вируса TP21/DEN4(вак) не отличались.

Нейроинвазивность для мышей. В предшествующем исследовании LGT ТР21, инокулированный ВБ, был лишь умеренно ослаблен для иммунокомпетентных мышей (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Напротив, LGT E5 (производное TP21 путем переноса в яйце), TP21/DEN4 и E5/DEN4 были полностью ослаблены при инокулировании нормальных мышей по внутрибрюшинному маршруту. Однако родительские вирусы LGT, инокулированные ВБ, проявили очень высокий уровень вирулентности для мышей SCID; ВБ LD₅₀ составляла 4×10^-3 БОЕ для TP21 и 6×10^-2 БОЕ для E5 (Таблица Б) (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Важно, что этот высокий уровень вирулентности штаммов LGT для мышей SCID был полностью удален, когда TP21 или E5 использовался для конструирования жизнеспособной химеры LGT/DEN4. В предшествующем исследовании ВБ LD₅₀ для мышей SCID для двух химер, "изъятых" и распространявшихся в москитных клетках, составляла >10⁷ БОЕ (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). В настоящем исследовании подобный анализ выполнялся для адаптированных в клетках Веро химер для определения того, сохранялся ли данный уровень ослабленности для мышей SCID после того, как химеры были адаптированы к сертифицированным клеткам Веро, которые сертифицированы для использования в приготовлении человеческой вакцины.

Швейцарские мыши трехнедельного возраста и иммунодефицитные (SCID) мыши (С. В.-17 ICRVscid/scid; Taconic Farms, Germantown, NY) использовались для оценивания вирулентности (Таблица Б). При дозе 10⁵ БОЕ, доставленной ВБ, родительский TP21 вызывал 100% смертность у швейцарских мышей, в то время как LGT E5, химера TP21/DEN4(вак) и химера Е5/DЕN4(вак) не смогли вызвать фатального заболевания при инокулировании ВБ с дозой 10⁵ или 5×10⁵ БОЕ. Вдобавок, полное ослабление обоих химерических вирусов наблюдалось при инокулировании мышей SCID ВБ. Несмотря на то, что вирус ТР21 или E5 давал 100% смертности при ВБ инокулировании мышей SCID с помощью 10² БОЕ, при инокулировании мышей SCID ВБ с помощью 5×10⁵ БОЕ любой из химер LGT/DEN4 не наблюдалось ни смертности, ни заболеваемости. Это показывает, что адаптированные в клетках Веро вирусы, как и их выращенные в москитных клетках родители, были значительно ослаблены для мышей при данных условиях.

Для определения того, были ли восприимчивы мыши SCID, выжившие в течение 7 недель после ВБ инокуляции с помощью любой химеры LGT/DEN4, к контрольному заражению родительским ТР21, выжившие инокулировались ВБ с помощью 10² БОЕ ТР21. Как и ожидалось, все эти мыши умерли на 10-13 день после инокулирования. Также мы не смогли восстановить инфекционный вирус или обнаружить вирусную РНК путем ПЦР через 50 дней после ВБ инокулирования с помощью любой сильно ослабленной химеры. Таким образом, мы не смогли обнаружить свидетельств устойчивой инфекции.

Защита от контрольного заражения вирулентным ВКЭ. Исследования, содержавшие контрольное заражение ВКЭ, были выполнены в лаборатории 4-го уровня биологической безопасности в Институте Полиомиелита и Вирусного Энцефалита имени Чумакова, Московская область, Россия, или в Медицинском Исследовательском Институте Инфекционных Заболеваний Армии США, Форт Детрик, Мэрилэнд, США, в соответствии с процедурами, описанными в Руководстве по Использованию Лабораторных Животных (Национальный Институт Здравоохранения, 1996).

Защита, вызванная иммунизацией с помощью дозы 600 БОЕ химеры TP21/DEN4 (Таблица В).

В первом эксперименте инбридинговые мыши СВА в возрасте шести недель (14-20 г) в группах по 9 или 10 особей были инокулированы ВБ с помощью 600 БОЕ ТР21/DЕN4(вак) один или два раза с интервалом 29 дней между инокуляциями. Иммунизированные и неиммунизированные (контрольные) мыши подвергались контрольному заражению ВБ на 26 или 55 день с помощью 320 БОЕ (32LD₅₀) сильно нейроинвазивного штамма Абсеттарова ВКЭ, вируса европейского подтипа (Ecker M., Allison S. L., Meixner T. and Heinz F. X. (1999). Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. J. Gen. Virol. 80, 179-185). ВБ LD₅₀ этого штамма для мышей СВА весом 14-20 г оценивалась в 10 БОЕ. Мыши, иммунизированные с помощью одной дозы 600 БОЕ химерической вакцины, были защищены только частично (60%) от 32LD₅₀ вирулентного штамма ВКЭ, в то время как две инокуляции дозой 600 БОЕ химеры давали полную защиту от гетерологического контрольного заражения ВКЭ. Напротив, все 19 контрольных мышей СВА развили клинические признаки, согласующиеся с летальной инфекцией ВКЭ, и умерли при контрольном заражении с помощью ВКЭ.

Во время второго эксперимента использовался подобный же протокол для исследования химеры TP21/DEN4 на мышах BALB/c. Самки мышей BALB/c в возрасте четырех недель (10-14 г) в группах по 5 или 10 особей инокулировались ВБ с помощью 600 БОЕ химеры TP21/DEN4(вак) один или несколько раз с интервалом от 26 до 66 дней между инокуляциями (Таблица В).

Мыши подвергались контрольному заражению ВБ в упомянутое время с помощью дозы 320LD₅₀ штамма Абсеттарова ВКЭ, для которого ВБ LD₅₀ для мышей BALB/c весом 10-14 г оценивалась в 1 БОЕ. В данном эксперименте, так же как и в первом эксперименте, неиммунизированные мыши, служившие в качестве контрольных, были того же возраста, что и иммунизированные мыши, для устранения эффекта связанной с возрастом сопротивляемости мышей к ВКЭ. Все 40 неиммунизированных мышей, подвергнутых контрольному заражению ВКЭ, умерли с клиническими признаками летальной инфекции ВКЭ. Мыши BALB/c, инокулированные с помощью одной дозы химеры ТР21/DЕN4(вак), были слабо защищены от ВКЭ по сравнению с мышами СВА. Однако защитная эффективность повышалась при инокулировании двух или трех доз химерического вакцинного штамма. Полная защита от контрольного заражения ВКЭ достигалась при инокулировании вакцины-кандидата 4 раза за 127-дневный период.

Защита, вызванная инокулированием дозы 10⁵ БОЕ вакцины-кандидата LGT/DEN4 (Таблица Г).

Аутбридинговые самки швейцарских мышей в возрасте трех недель (7-9 г) были инокулированы по ВБ маршруту с помощью: (i) 10² БОЕ вируса LGT ТР21, вируса LGT E5 или производного от кДНК вируса LGT TP21 (обозначен 656), или (ii) 10⁵ БОЕ TP21/DEN4(вак), Е5/DЕN4(вак) или DEN4. Когда вакцина-кандидат вводилась дважды, вторая инокуляция производилась с интервалом 22 дня. Через 18 дней после второй иммунизации всем мышам делалось кровопускание для измерения уровня сывороточных нейтрализующих антител к вирусу LGT TP21, а шесть дней спустя мыши подвергались контрольному заражению ВБ с помощью 100LD₅₀ сильно вирулентного штамма Софьина ВКЭ, дальневосточный подтип (Clarke D.Н. (1964). Further studies on antigenic relationships among the viruses of the group В tick-borne complex. Bull. World Health Organ. 31, 45-56). 50%-ная смертельная доза штамма Софьина для мышей в возрасте 8 недель ранее была определена как 0,5 БОЕ (Schmaljohn С., Vanderzanden L., Bray M., Custer D., Meyer В., Li D., Rossi C., Fuller D., Fuller J., Haynes J. and Huggins, J. (1997). Naked DNA vaccines expressing the preM and E genes of Russian spring summer encephalitis virus and Central European encephalitis virus protect mice from homologous and heterologous challenge. J. Virol. 71, 9563-9569).

Предшествующие исследования на мышах продемонстрировали жесткую корреляцию между уровнем сывороточных нейтрализующих антител к клещевому флавивирусу, вызванным иммунизацией, и сопротивляемостью контрольному заражению гомологичным вирусом или другими тесно связанными вирусами этой группы (Monath Т.Р. and Heinz F.X. (1996). Flaviviruses. In "Fields Virology." (B.N. Fields, D.M. Knipe & P.M.Howley, Eds.), 3rd. ed., pp.961-1035. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia/New York.; Price H.W. and Thind I.S. (1973). Immunization of mice against Russian spring-summer virus complex and monkeys against Powassan virus with attenuated Langat E5 virus. Am. J. Trop.Med. Hyg. 22, 100-108; Schmaljohn С., Vanderzanden L., Bray M., Custer D., Meyer В., Li D., Rossi C., Fuller D., Fuller J., Haynes J. and Huggins J. (1997). Naked DNA vaccines expressing the preM and E genes of Russian spring summer encephalitis virus and Central European encephalitis virus protect mice from homologous and heterologous challenge. J. Virol. 71, 9563-9569). Эти более ранние исследования установили, что существует тесная антигенная связь между ВКЭ и LGT. Также на 85-88% гомологичны последовательности структурных белков preM и Е этих флавивирусов (Mandl С.W., lacono-Connors L., Wallner G., Hoizmann H., Kunz C. and Heinz F.X. (1991). Sequence of the genes encoding the structural proteins of the low-virulence tick-borne flaviviruses Langat TP21 and Yelantsev. Virology 185, 891-895). Таким образом, мы не были удивлены, наблюдая, что уровень нейтрализующих антител, измеренный для вируса LGT TP21, проявил корреляцию с защитной иммунностью в отношении ВКЭ. В данном эксперименте специфичная для вируса LGT иммунная реакция мышей была измерена путем определения титра сывороточных LGT TP21 нейтрализующих антител, вызванного химерической вакциной-кандидатом или ее родительским вирусом LGT. Отдельные образцы сыворотки анализировались путем теста нейтрализации 50% фокусного снижения (Okuno Y., Fukunaga Т., Tadano M., Okamoto Y., Ohnishi T and Takagi M. (1985). Rapid focus reduction neutralization test of Japanese encephalitis virus in microtiter system. Arch. Virol. 86,129-135; Ishimine Т., Tadano M., Fukunaga T. and Okuno Y. (1987). An improved micromethod for infectivity assays and neutralization test of dengue viruses. Biken Journal 30, 39-44) с помощью вируса TP21 (Таблица Г). Мыши, однократно инокулированные с помощью 10² БОЕ вируса TP21, TP21 (656) или Е5, либо дважды с помощью 10⁵ БОЕ химеры TP21/DEN4(вак), выработали высокий уровень нейтрализующих антител к LGT TP21. Напротив, мыши, инокулированные ВБ с помощью 10⁵ БОЕ DEN4, не смогли выработать нейтрализующие TP21 антитела. Мыши, иммунизированные либо однократно с помощью любого химерического вируса, либо дважды с помощью химеры Е5/DЕN4(вак), также развили умеренный уровень сывороточных нейтрализующих антител к TP21, который был ниже наблюдавшегося ранее (Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-home flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751), когда для иммунизации аутбридинговых швейцарских мышей использовались химерические вирусы, выделенные в культуре москитных клеток.

Мыши, ранее инокулированные с помощью низкой дозы Е5 или ТР21, были полностью защищены от последующего контрольного заражения ВКЭ, в то время как мыши, ранее инокулированные с помощью DEN4, как и неиммунизированные мыши, не были защищены вообще. Это означает, что защита возникала за счет обширной иммунной реакции на LGT. Даже очень низкая доза живого вируса LGT (в том числе кДНК-производного вируса ТР21) была высокоэффективной при предотвращении заболевания, вызванного антигенном, родственным ВКЭ. Мыши также приобретали сопротивляемость к последующему летальному контрольному заражению штаммом дальневосточного подтипа ВКЭ после иммунизации с помощью химерических вирусов. TP21/DEN4(вак) представляется более иммуногенным по сравнению с E5/DEN4(вак), поскольку мыши, инокулированные с помощью двух доз первого, были полностью защищены от контрольного заражения ВКЭ. Напротив, только 67% мышей, инокулированных с помощью двух доз химеры E5/DEN4(вак), пережили летальное контрольное заражение ВКЭ. Ясно, что родительские вирусы LGT были более иммуногенными и защищающими, чем их DEN4-химеры. Однако можно было достичь большей безопасности и эквивалентной защитной эффективности при введении химеры TP21/DEN4(вак) в режиме двух доз.

Согласуясь с тесным антигенным родством LGT и ВКЭ, наши исследования с помощью химерических вирусных вакцин-кандидатов на мышах показали высокую степень перекрестной защиты между LGT и ВКЭ европейского подтипа (штамм Абсеттарова) или ВКЭ дальневосточного подтипа (штамм Софьина). Таким образом, LGT-белки ргеМ и Е химер представляют эффективные защитные антигены, способные вызывать значительную сопротивляемость к гетерологическому контрольному заражению сильно вирулентным ВКЭ. Обнадеживающие результаты поддерживают безопасность, иммуногенность и защитную эффективность вакцинных штаммов-кандидатов для мышей в качестве модельной системы.

Инфекционный клон кДНК ослабленного клещевого флавивируса Лангата (штамм Е5) и 3'-делеционный мутант, сконструированный из него, проявляют уменьшенную нейроинвазивность для иммунодефицитных мышей.

Конструирование клона полномерной кДНК Е5 и восстановление вируса из клеток, трансфецированных с помощью РНК-транскриптов полной длины. Ранее нам удалось сконструировать стабильные клоны полномерной кДНК LGT TP21, из которых инфекционная РНК может быть транскрибирована in vitro. Один из этих клонов полномерной кДНК, плазмид рТР21-636, был использован для создания полномерной кДНК генома Е5 путем замены почти всего генома TP21 на соответствующую последовательность штамма Е5. Полная нуклеотидная последовательность некультивированного вирусного генома LGT (штамм TP21) и его более ослабленного производного, штамма Е5, была определена ранее по фрагментам кДНК, полученным путем ОТ-ПЦР (номера доступа GenBank AF253419 и AF253420). Оба генома TP21 и Е5 имели длину 10943 нуклеотида (нт) и содержали 5'-некодирующий участок (НКУ) длиной 130 нт и 3'-НКУ длиной 568 нт, которые полностью сохранялись. Двенадцать различий в геномной последовательности штаммов TP21 и Е5 были расположены между нуклеотидными позициями 1325 и 9288. Этот участок совместно с обрамляющими сохраненными последовательностями (нуклеотиды 133-1324 и нуклеотиды 9289-9739) в инфекционной кДНК клонированного генома полной длины TP21 являлись мишенями для замещения соответствующей последовательностью Е5 (фиг.4А). Фрагмент кДНК почти полной длины (приблизительно 10,5 кб) генома Е5 был приготовлен посредством высокоточной длинной ПЦР с помощью ОТ-продукта, выделенного из вирусной РНК, извлеченной из слаботитрированного вирусного материала Е5 (1,2×10⁴ БОЕ/мл). Низкотитрированный вирус, собранный рано в ходе цикла роста, был использован для приготовления кДНК в качестве шаблона для ПЦР для минимизации присутствия мутантов с обширными 3'-делециями или перекомпонованными геномами, которые аккумулируются на поздней стадии инфекции, как описано ранее. Сохранение 132 нуклеотидов 5' и 1205 нуклеотидов 3' в ТР21 и Е5 позволило нам клонировать ПЦР-продукт генома Е5, охватывающий нуклеотиды 133-9737, в вектор рТР21-636, замещающий соответствующую последовательность ТР21. Шесть стабильных клонов полномерной кДНК Е5 были идентифицированы посредством схемы расщепления ограничивающего фермента. Частичная последовательность этих плазмидов (рЕ5) была проанализирована, и было обнаружено, что она содержит Е5-специфичные последовательности, которые отличают Е5 от его родителя ТР21.

Перед получением избыточных транскриптов шаблон плазмидной ДНК был линеаризован с помощью EcoRV, сайт расщепления которого представлен тремя нуклеотидами ниже 3'-конца последовательности LGT E5. Полномерная РНК, выработанная полимеразой SP6 из шести различных плазмидов, была протестирована на инфекционность путем трансфецирования фибробластных клеток эмбриона цыпленка (ФЭЦ) или обезьяньих клеток Веро. Только один клон кДНК E5 (рЕ5-651) был инфекционным для обеих клеточных линий, в то время как остальные клоны не были жизнеспособными. Свидетельства вирусной инфекции были обнаружены путем ИФТ с помощью LGT-специфического HMAF. Все трансфецированные клетки Веро и 20-30% ФЭЦ-трансфецированных клеток являлись положительными на 5 день. Препараты изъятого клона Е5 были получены путем переноса вируса от одного до двенадцати раз в клеточной линии, использованной для изъятия и сбора всплывшей среды инфицированных культур. После одного или двенадцати переносов в клетках Веро или ФЭЦ вирус анализировался с точки зрения отклонения последовательности от его биологически выделенного родителя Е5.

Генетическая вариативность вируса Е5-651 в ходе конструирования, восстановления и переноса в клеточной культуре. Полная последовательность вирусного генома Е5-651, изъятого из кДНК в клетках Веро или ФЭЦ, была определена посредством анализа перекрывающихся ОТ-ПЦР-фрагментов кДНК, выделенных непосредственно из вирусной РНК, и сравнивалась с согласованной последовательностью его родительского вируса Е5, а также с нуклеотидной последовательностью вирусной вставки в плазмид рЕ5-651, из которой были выделены инфекционный РНК-транскрипты (Таблица I). Изъятый клон Е5-651 содержал согласованную последовательность Е5 в 12 позициях, в которых некультивированный родительский ТР21 отличался от своего производного Е5. Анализ плазмидной ДНК обнаружил восемь отличий нуклеотидной последовательности от согласованной последовательности Е5, из которых три приводили к аминокислотному замещению в оболочечном структурном белке Е (Glu₁₄₉→Gly и Glu₂₉₁→Gly) и неструктурном белке NS4B (Ala₁₈₃→Val).

Последовательность первого переноса выросшего в клетках Веро клона Е5-651 не отличалась от последовательности плазмидной кДНК, в то время как после 12 переносов в клетках Веро флуктуация между (i) Ser₁₇ и Asn и (ii) Gln₃₈₃ и Lys была обнаружена в NS2B и NS3 соответственно. Е5-651, изъятый и однократно перенесенный в клетках ФЭЦ, отличался от последовательности плазмидной ДНК в двух нуклеотидных позициях в Е; одно из изменений приводило к флуктуации между С и U в нуклеотидной позиции 1151 в Е и флуктуации между Gly₁₄₉ и Arg в нуклеотидной позиции 1415 в Е. Когда выделенный из клеточной культуры ФЭЦ вирус был перенесен в клетках ФЭЦ 11 дополнительных раз, только U (нт 1151) или А (нт 1415) были выбраны из флуктуационной смеси. Вдобавок, было обнаружено 4 прочих замещения, два из которых давали изменение кодирования (Таблица I). Напротив, только две позиции 4254 (G/A) и 5744 (С/А) в геномной последовательности варьировались после 12 переносов вируса Е5-651 в клетках Веро. Поскольку частота геномных изменений Е5-651 в клетках ФЭЦ была больше, чем в клетках Веро, вирус Е5-651, выделенный из культуры клеток Веро, был выбран на основании его очевидно большей стабильности для анализа нейроинвазивности для мышей. Перед оцениванием вирулентности вируса на мышах вирус E5-65I был подвергнут побляшковой очистке для минимизации накопления спонтанных мутаций, которые могут происходить во время амплификации вируса в клетках Веро.

Эффективность бляшкообразования и очистка клона Е5 в клеточной культуре. Фенотип бляшки изъятого вируса E5-65I, восстановленного из клеток Веро и перенесенного однократно в этих клетках, был исследован с помощью обезьяньих клеток LLCMK₂ и Веро. Изъятый выделенный из культуры клеток Веро вирус E5-65I давал маленькие прозрачные бляшки диаметром 1,5 мм на клетках LLCMK₂ через 7 дней после инфицирования (Таблица II). Напротив, данный вирус давал еще меньшие (<0,1 мм) еле заметные бляшки в клетках Веро. Для сравнения родительский вирус Е5, выросший в клетках Веро, давал большие бляшки (5,0-5,2 мм) и на клетках Веро, и на клетках LLCMK₂. Клон Е5-651, изъятый из клеток ФЭЦ и выросший в этих клетках, проявлял такие же размер и морфологию бляшек в двух обезьяньих клеточных культурах, что и вирус, выделенный из клеток Веро.

Отдельные бляшки размером 1,5 мм Е5-651 собирались с клеток LLCMK₂, инфицированных выделенным из культуры клеток Веро вирусом, а затем подвергались трем дополнительным побляшковым переносам в клетках LLCMK₂. Материал бляшкового очищенного изолята вируса Е5-651 был приготовлен с последующей дополнительной амплификацией в клетках Веро. Различие бляшкового фенотипа вируса Е5-651 в клетках Веро и LLCMK₂ не изменяло последующего побляшкового выбора в клетках LLCMK₂ и амплификации в культуре клеток Веро. В дополнение, бляшковый очищенный изолят не отличался последовательностью от своего изъятого вируса Е5-651.

Оценка кДНК-производного вируса Е5 на мышах. Ранее было показано, что некультивированный штамм ТР21 вирулентен для швейцарских мышей в возрасте 3 недель с внутрибрюшинной LD₅₀, равной 5×10³ БОЕ (Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad; Sci. USA, 95, 1746-1751). Напротив, ослабленный производный от ТР21 штамм Е5 проявлял нейроинвазивность у взрослых мышей только тогда, когда количество инокулированного вируса увеличивалось до 10⁷-10⁸ БОЕ. В более раннем исследовании было показано, что мыши SCID по меньшей мере в 10⁶-10⁸ раз более чувствительны, чем нормальные мыши, для обнаружения периферической нейровирулентности штаммов вируса Лангата. По этой причине мыши BCID в возрасте 3 недель в группах по 5 особей инокулировались ВБ десятичными разбавлениями Е5-651 или 1 БОЕ родительского штамма Е5, LD₅₀ которого ранее была определена равной 0,06 БОЕ (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). 105 БОЕ химеры ТР21/DЕN4(вак) также оценивались ВБ на мышах SCID в качестве отрицательного контроля, поскольку предшествующее исследование показало, что у нее отсутствовали какие-либо свидетельства нейроинвазивности (ВБ LD₅₀>10⁷ БОЕ) (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Родительский вирус Е5 вызвал 100% смертность между 9 и 13 днями после ВБ инокулирования с помощью 1 БОЕ, в то время как 10⁵ БОЕ химерического вируса не смогли вызвать фатального заболевания за период 7 недель. Тем не менее 2 из 5 мышей умерли через 28 или 33 дня после ВБ инокуляции с помощью десятичных разбавлений клона Е5-651, LD₅₀ которого была определена равной 20,4 БОЕ (21,0 БОЕ в повторном эксперименте). Таким образом, клон Е5-651 был в 5,1×10³ раз менее нейроинвазивен, чем штамм ТР21, оценочная LD₅₀ которого для мышей SCID равна 0,004 БОЕ, и в 3,4×10² раза менее вирулентен, чем его непосредственный родительский вирус Е5, который имел оценочную LD₅₀ для мышей SCID, равную 0,06 БОЕ (Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,1746-1751).

Конструирование 3'-НКУ делеционных мутантов и восстановление вируса. В попытке увеличить уровень ослабленности клона Е5-651 для мышей SCID в его кДНК-геном было введено несколько стратегических мутаций. С точки зрения разработки ослабленной живой флавивирусной вакцины любые ослабляющие мутации, вводимые в вакцинный вирус-кандидат, должны быть генетически стабильными и не способными вызывать значительное ослабление иммуногенности и защитной эффективности. Недавние исследования с несколькими флавивирусами предполагают, что этим требованиям удовлетворяют 3'-НКУ делении (Men R., Bray M., Clark D., Chanock R.M. and Lai C.-J. (1996). Dengue type 4 virus mutants containing deletions in the 3' noncoding region of the RNA genome: analysis of growth restriction in cell culture and altered viremia pattern and immunogenicity in rhesus monkeys. J. Virol. 70, 3930-3937; Mandl С.W., Holzmann H., Meixner Т., Rauscher S., Stadler P.F., Allison S.L. and Heinz F.X. (1998). Spontaneous and engineered deletions in the 3' noncoding region of tick-borne encephalitis virus: construction of highly attenuated mutants of a flavivirus. J. Virol. 72, 2132-2140). 3'-НКУ генома РНК энцефалитных флавивирусов имеет длину, варьирующуюся от 393 до 800 нт, из которых только последние приблизительно 340 нуклеотидов (ядерный элемент) сохраняются в большей степени, чем участок между стоп-кодоном открытого фрейма считывания и ядерным элементом (Dobrikova E. Yu. and Pletnev A.G. (1995). A full-size DNA copy of the tick-borne encephalitis virus genome. Part I. Analysis of noncoding 5'- and 3'-regions. Bioorganic Chemistry 21, 528-534; Mandl С.W., Holzmann H., Meixner Т., Rauscher S., Stadler P.F., Allison S.L. and Heinz F.X. (1998). Spontaneous and engineered deletions in the 3' noncoding region of tick-borne encephalitis virus: construction of highly attenuated mutants of a flavivirus. J. Virol. 72, 2132-2140). Недавние исследования ВКЭ обеспечили свидетельства того, что 3'-НКУ-делеция может снизить вирулентность без потери жизнеспособности, если делеция охватывает участок от стоп-кодона вирусного глико-протеина до начала ядерного элемента (Mandl С.W., Holzmann H., Meixner Т., Rauscher S., Stadler P.F., Allison S.L. and Heinz F.X. (1998). Spontaneous and engineered deletions in the 3' noncoding region of tick-borne encephalitis virus: construction of highly attenuated mutants of a flavivirus. J. Virol. 72, 2132-2140).

Мы вводили делеции, которые начинаются с пятого нуклеотида после стоп-кодона ТАА длинного открытого фрейма считывания и продолжаются до целевых нуклеотидов, обозначенных на фиг.4 (Б и В). Все мутантные конструкты содержали 3 или 5 дополнительных нуклеотидов, которые создавали сайт AflII расщепления рестриктивного фермента на месте делеции (фиг.4 В). Конечные мутантные плазмиды рЕ5-3'-320, рЕ5-3'-374, рЕ5-3'-449 и рЕ5-3'-471 содержали делецию длиной 320, 374, 449 или 471 нт соответственно.

Клетки Веро трансфецировались с помощью геномных РНК-транскриптов полной длины, приготовленных из полномерной кДНК 3'-НКУ-делеционных мутантов, описанных выше. Только РНК мутанта Е5-3'-320 дали жизнеспособный вирус. Эти результаты согласовывались с результатами, наблюдавшимися для 3'-НКУ-делеционных мутантов ВКЭ (Mandl С.W., Holzmann H., Meixner Т., Rauscher S., Stadler P.F., Allison S. L. and Heinz F.X. (1998). Spontaneous and engineered deletions in the 3' noncoding region of tick-borne encephalitis virus: construction of highly attenuated mutants of a flavivirus. J. Virol. 72, 2132-2140). Распространение делеции в ядерный элемент 3' конца генома ВКЭ или LGT исключает жизнеспособность вируса. Наиболее длинная делеция ВКЭ, совместимая с жизнеспособностью, сохраняет последние 222 нуклеотида 3'-конца. 3'-НКУ изъятого вируса Е5-3'-320 сохраняет последние 244 нуклеотида его генома.

Характеризация изъятого 3'-НКУ-делеционного мутанта. Изъятый Е5-3'-320 отличался от клона Е5-651 в отношении морфологии бляшки в обезьяньих клетках. 3'-НКУ-делеционный мутант не смог произвести видимых бляшек на клетках Веро, клеточном субстрате, в котором вирус был восстановлен (Таблица II). Мутант дал бляшки на клетках LLCMK₂, но они были очень маленькими, менее 0,2 мм. Такие отдельные бляшки были собраны и затем подвергнуты трем побляшковым переносам в клеточной линии LLCMK₂. Наконец, была приготовлена суспензия вируса Е5-3'-320 путем дополнительной амплификации в клетках Веро. Полная геномная последовательность мутанта Е5-3'-320 была определена и сравнена с последовательностью клона Е5-651. Единственным обнаруженным отличием являлась 3'-НКУ делеция мутанта Е5-3'-320.

Эффективность репликации родительского Е5, рекомбинантного Е5-651 и его 3'-НКУ-делеционного мутанта исследовалась с помощью клеток LLCMK₂ или Веро, инокулированных со множественностью инфекции (МИ), равной 0,01 (фиг.6). В клетках Веро рост Е5-3'-320 был в 10⁴ раз меньшим, чем рост его родителя Е5-651 или самого родительского Е5. Делеционный мутант также рос менее хорошо в клетках LLCMK₂, но ограничение было лишь в 9-50 раз (фиг.6 и Таблица II).

Нейроинвазивность 3'-НКУ-делеционного мутанта для мышей SCID. Нейроинвазивность Е5-651 и его делеционного мутанта Е5-3'-320 была оценена на мышах SCID в группах по 5 особей, инокулированных ВБ десятичными разбавлениями вируса. Рекомбинантный 3'-НКУ-делеционный мутант был менее вирулентным для мышей SCID, чем его непосредственный родитель Е5-651. Оцененная ВБ LD₅₀ для Е5-3'-320 составляла 479 БОЕ по сравнению с 20,4 БОЕ для Е5-651. В целом клонированные вирусы Е5-651 и Е5-3'-320 были соответственно в 5100 и 119750 раз менее нейроинвазивными, чем их некультивированный предок, вирус LGT TP21.

Характеризация вируса, восстановленного из мозга умирающих мышей SCID, инокулированных ВБ с помощью Е5 или его рекомбинантных производных. Смерть мышей, инокулированных ВБ с помощью Е5-651 или Е5-3'-320, происходила в два раза позже по сравнению с мышами, инокулированными их биологически выделенным родителем Е5 (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Эта задержка согласуется с увеличением ослабленности рекомбинантных вирусов, измеренной по ВБ LD₅₀ у мышей SCID. В попытке объяснить наблюдавшуюся существенную задержку начала энцефалита мы определили последовательность полного генома мозговых изолятов и сравнили эту последовательность с последовательностью вируса, который инокулировался ВБ (Таблица III). Мозговые изоляты отличались от вируса, использовавшегося для инициирования инфекции максимум тремя кодирующими изменениями в Е, NS1, NS2B, NS3, NS4B или NS5. Три мозговых изолята содержали три кодирующих изменения, в то время как остальные два вируса отличались от инокулированного вируса только в одной аминокислотной позиции. Два мозговых изолята, взятых у мышей SCID, инокулированных ВБ с помощью 4,9 LD₅₀ или 49 LD₅₀ рекомбинантного вируса Е5-651, имели два общих кодирующих изменения, одно в нт 1571 [G→A (Ala₂₀₁→Thr) или G→G/A (Ala₂₀₁→Ala/Thr)], а другое - в нт 5794 [G→U (Glu₃₉₉→Asp) или G→G/U (Glu₃₉₉→Glu/Asp)]. Все остальные 7 кодирующих изменений являлись уникальными, то есть не содержались в других изолятах.

В первоначальной попытке прояснить эту ситуацию изолят Е5-651 из мышиного мозга, содержавший уникальное аминокислотное замещение (His₁₃₀→Tyr) в Е (Таблица III), был однократно перенесен в клетках Веро, а затем тестировался на 5 мышах SCID путем ВБ инокулирования 1 или 10 БОЕ. Все инокулированные мыши умерли в ходе 14-дневного периода наблюдений. Вдобавок, изолят вируса Е5-3'-320 из мышиного мозга, содержавший уникальное аминокислотное замещение (Gly₁₄₉→Glu) в Е (Таблица III) и который был также однократно перенесен в клетках Веро, являлся летальным для 100 или 80% мышей SCID, инокулированных ВБ с помощью 1000 или 100 БОЕ соответственно. Эти открытия предполагают, что наблюдаемые спонтанные мутации в нейроинвазивных изолятах рекомбинантных Е5-651 и Е5-3'-320 отвечают за увеличенную нейроинвазивность данных мутантов для иммунодефицитных мышей.

Иммуногенность и защитная эффективность родительского Е5 и его рекомбинантных вирусов Е5-651 и Е5-3'-320. Самки аутбридинговых швейцарских мышей в возрасте трех недель (7-9 г) инокулировались ВБ с помощью десятичных разбавлений родительского Е5 или выделенных из его кДНК вирусов Е5-651 или Е5-3'-320 (Таблица IV). Через двадцать два дня после инокуляции иммунизированным и неиммунизированным (контрольным) мышам делали кровопускание для измерения титра сывороточных нейтрализующих антител к LGT TP21. Все иммунизированные мыши были сероконверсивными. Мыши, иммунизированные ВБ с помощью 10 БОЕ родительского вируса или одного из его рекомбинантов, развили титр нейтрализующих антител к LGT TP21 от умеренного до сильного. Однако иммунизация с помощью 10 или 100-кратно большего количества вируса увеличивала достигаемый титр нейтрализующих антител к TP21. У швейцарских мышей не было значительной разницы в наибольшем значении титра сывороточных антител, вызванном родительским Е5 или любым из его рекомбинантных производных.

На 23 день после иммунизации мыши подвергались контрольному заражению ВБ с помощью 2000 ВБ LD₅₀ некультивированного штамма TP21 LGT. Мыши, иммунизированные с помощью 10 БОЕ Е5 или Е5-651 или Е5-3'-320, были полностью защищены от летального контрольного заражения TP21, в то время как ни одна из контрольных мышей не пережила контрольное заражение. Следует отметить, что более ослабленный мутант (Е5-3'-320), который проявил ограниченный рост в клеточной культуре и значительное снижение нейроинвазивности для мышей SCED, был способен вызывать полный защитный иммунитет у иммунокомпетентных мышей при столь низкой дозе иммунизации. Эти данные обеспечивают основу для предположения, что 3'-делеционный мутант Е5 может рассматриваться в качестве вакцинного штамма-кандидата, который предусматривается в качестве автономной вакцины. Альтернативно, данный мутант может обеспечивать основу для дальнейшего изменения с целью получения живой вирусной вакцины для использования при предотвращении заболевания, вызванного антигенно-родственными клещевыми флавивирусами.

ПРИМЕРЫ

Инфекционные клоны кДНК клещевого флавивируса Лангата, отличающиеся от своего родителя периферической нейровирулентностью.

Три различных способа было использовано для конструирования клонов полномерной кДНК LGT TP21. Данные способы использовали следующие молекулярно-биологические методы.

Клетки и вирусные препараты. Обезьяньи клетки Веро, LLCMK₂ и ВНК были куплены у American Type Culture Collection. Клетки выращивались в MEM с 1% глутамина, 10% сыворотки бычьего плода, 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл фунгизона при 37°С и 5% СО₂. Вирусный материал некультивированного штамма TP21 вируса Лангата (LGT), его более ослабленного мутанта Е5 и их химер TP21/DEN4 и E5/DEN4 были приготовлены в клетках Веро, как описано ранее (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerizarion with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Некультивированный штамм ТР21 LGT доступен в Rockefeller Foundation Collection (Gordon Smith С.Е. (1956) A virus resembling Russian spring-summer encephalitis virus from an Ixodid in Malaya. Nature (London) 178, 581-582). LGT E5 доступен в Медицинском Исследовательском Институте Инфекционных Заболеваний Армии США (Thind I.S. and Price W.H. (1966a) A chick embryo attenuated strain (TP21 E5) of Langat virus. I. Virulence of the virus for mice and monkeys. Am. J. Epidemiol., 84, 193-213).

Клетки Веро в колбах с тканевой культурой объемом 150 куб. см были инфицированы вирусом TP21 или E5 с множественностью инфекции, равной 0,01. После адсорбирования при 37°С в течение 1 часа вирусный инокулят удалялся и добавлялась свежая среда. Содержимое одной колбы собиралось на 1, 2 или 5 день после вирусного инфицирования, и вирусный титр определялся путем исследования бляшки на клетках Веро, которые окрашивались нейтральным красным для визуализации бляшек через 7 дней после инфекции. Титр этих трех вирусных материалов составлял 3,8×10³, 2,2×10⁶ и 2,4×10⁹ БОЕ/мл для TP21 и 1,2×10⁴, 4×10⁶ и 1,2×10⁹ БОЕ/мл для E5.

Обратная транскрипция. Вирус во всплывшей части клеточной культурной среды был осажен с помощью 8% полиэтиленгликоля 8000 (US Biochemical Corp., Cleveland, ОН) и 0,4 моль NaCl в течение ночи при 4°С и собирался центрифугированием. Общая РНК экстагировалась из вирионов с помощью реагента TRI (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, ОН). Обратная транскрипция (ОТ) выполнялась с помощью системы предварительной амплификации SuperScript II (Life Technologies, Rockville, MD) и (i) олигонуклеотида (олиго) (1445) 5'-GCCTGCGGAGGGTACCGATATCAGCGGGTGTTTTTCCG AGACACG (Посл. №3), который является комплементарным к LGT-последовательности на ее 3'-терминале, то есть на нуклеотидах 10921-10943, и содержит сайт EcoRV и Kpnl непосредственно после последовательности 3'-конца LGT, или (ii) олиго (1087) 5'-CTATGGCCAGGTGGAAAGCCGC (Посл. №4), которая комплементарна к последовательности LGT в позициях нуклеотидов 7256-7277. Последний олиго использовался для упрощения транскрипции 5'-конца генома. Перед обратной транскрипцией 5-10 мкг РНК и 100 нг праймера инкубировались при 70°С в течение 5 минут, а затем охлаждались на льду. Реакционные смеси ОТ содержали эту термоденатурированную РНК и ингредиенты из набора Superscript II (Life Technologies, Rockville, MD) и 200 ед обратной транскриптазы в конечном объеме 100 мкл. Реакционные смеси инкубировались при 42°С в течение 2 часов, а затем замораживались и использовались в качестве шаблона для выработки двуспиральной ДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) для конструирования и клонирования кДНК ТР21 в Е. coli или для анализа последовательности выделенного с помощью ОТ-ПЦР вирусного генома.

ПЦР. Стандартная смесь ПЦР, использованная для получения двуспиральной кДНК, содержала 0,5 мкмоль каждой праймерной пары, 200 нг плазмидной ДНК или 5-10 мкл ОТ-продукта в качестве шаблона, 400 мкмоль dNTP, 1×буфер и 5 ед Takara LA Taq ДНК-полимеразы (ПЦР-набор Takara LA, PanVera Co., Madison, WI) в общем реакционном объеме 100 мкл. Реакционная смесь предварительно нагревалась до 94°С в течение 2 минут, а затем подвергалась 30 циклам, находясь в каждом цикле при 98°С в течение 20 сек и при 68°С в течение 15 минут.

Анализ последовательности вирусного генома. Полная последовательность (i) генома ТР21, (ii) генома его более ослабленного производного штамма Е5 и (iii) вируса ТР21, восстановленного из кДНК, определялась путем анализа последовательности 4 перекрывающихся ОТ-ПЦР-фрагментов кДНК, которые были напрямую выделены из вирусной РНК. Олиго 1445 или 1087 использовался в качестве праймера для получения первой спирали кДНК путем обратной транскрипции, как описано выше. Выполнялась ПЦР для амплификации четырех перекрывающихся фрагментов генома: А (нт 1-4192), Б (нт 3491-7277), В (нт 6131-9669) и Г (нт 8857-10943) с помощью подходящих праймеров и набора для ПЦР Takara LA. Праймеры для ПЦР и анализа последовательности были разработаны с помощью ранее опубликованной последовательности штамма LGT TP21 (номера доступа GenBank M86650 и М73835) (Mandl С.W, lacono-Connors L., Wallner G, Hoizmann H., Kunz С.and Heinz F.X. (1991). Sequence of the genes encoding the structural proteins of the low-virulence tick-borne flaviviruses Langat TP21 and Yelantsev. Virology 185, 891-895; lacono-Connors L. С.and Schmaljohn C. S. (1992) Cloning and sequence analysis of the genes encoding the nonstructural proteins of Langat virus and comparative analysis with other flaviviruses. Virology 188, 875-880; Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). ПЦР-продукты очищались в агарозном геле и изолировались с помощью набора Quiagen для гелевого экстрагирования (Valencia, CA). Последовательность ОТ-ПЦР-фрагментов определялась с помощью BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems/ABI Prism, Foster City, CA) и генетического анализатора модели 310.

Для определения последовательности 3'- и 5'-конца вирусного генома, РНК из изъятого вируса или из родительского вируса TP21 или Е5 обрабатывалась пирофосфатазой табачной кислоты (Epicentre Technol. Co., Madison, WI) для расщепления концевой структуры. Затем 5'- и 3'-терминалы вирусной РНК соединялись с помощью Т4 РНК-лигазы (New England Biolabs, Beverly, МА). Олиго 979 (комплементарный для последовательности LGT в позициях 1149-1167 нт) использовался для выработки первой спирали кДНК посредством ОТ. Двуспиральный фрагмент кДНК, содержащий соединение 5'- и 3'-концов генома, был амплифицирован путем ПЦР с помощью праймерной пары олиго 916, положительно-чувствительного праймера, содержащего нуклеотиды 10349-10382 последовательности LGT, и олиго 907, отрицательно-чувствительного праймера, комплементарного для нуклеотидов 955-983. Затем определялась последовательность конечного ПЦР-продукта длиной 1578 нт.

ПРИМЕР 1

Способ 1: Субклонированные фрагменты генома ТР21 из высокотитрированного вирусного препарата

Данный способ использовал четыре перекрывающихся фрагмента кДНК (фиг.1, часть А), ранее клонированных в Е. coli, для использования при определении полной нуклеотидной последовательности генома LGT TP21 (Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). Эти плазмидные клоны, а именно р5 (нуклеотиды LGT 1-983), р44 (нуклеотиды 930-4828), р66 (нуклеотиды 4539-6571) и р76 (нуклеотиды 6525-10943), были выделены из библиотеки кДНК LGT из высокотитрированной вирусной суспензии, 1,8×10⁹ БОЕ/мл. Фрагмент р5 ДНК был амплифицирован посредством ПЦР с помощью чувствительного праймера (олиго 1444) 5'-GAAGGTGGTCTTTGCGGCCGCATCATACACATACGATTTAGGTGACACT

ATAGAGATTTTCTTGCGCGTGCATGC (Посл. №1), который содержал сайт NotI и промотер SP6 непосредственно выше нуклеотидов 1-22 5'-конца генома, в то время как отрицательно-чувствительный праймер (олиго 907) 5'-GGGTGCATCTCGACGCGTAGGCCGGTACC (Посл. №2) был комплементарным для нуклеотидов 955-983 LGT и содержал сайт расщепления KpnI. Продукт ПЦР поглощался NotI и KpnI и связывался с подобным же образом поглощаемым р44. Получающийся большой субгеномный клон (р49), представляющий геном ТР21 начиная с его 5'-терминала до нт 4828 и содержащий уникальный сайт расщепления Apal в позиции 4801, полностью подвергался определению последовательности. Сайты расщепления EcoRV и KpnI были внедрены в кДНК ТР21 непосредственно ниже 3'-конца генома в ходе конструирования плазмида р76. Фрагменты кДНК LGT из р66 и р76 соединялись, формируя больший клон кДНК путем лигирования с помощью уникального рестриктного сайта NsiI (позиция 6551 генома LGT) и сайта PvuI вектора. Определялась последовательность получающегося клона р77, содержащего 3'-половину генома (от нт 4539 до 3'-конца генома плюс сайты EcoRV и KpnI), и затем использовалась для сборки конечного плазмидного конструкта. Конструирование полномерной кДНК ТР21 завершалось лигированием плазмида р77, который поглощался с помощью NotI и Apal, и NotI-ApaI-фрагмента р49. Десять стабильных отдельных клонов полномерной кДНК были идентифицированы после трансфецирования штамма BD1528 Е. coli с помощью лигационной смеси. Скрининг плазмидов показал, что эти стабильные клоны проявляли ожидаемую рестриктную схему при тестировании с помощью EcoRI, PstI HSalL

В дополнение к этому, отдельное множество клонов полномерной кДНК приготавливалось с помощью плазмидной кДНК, обозначенной р76 (нуклеотиды 6525-10943), связанной с длинным ПЦР-фрагментом кДНК, который содержал 5'-терминальные нуклеотиды (нуклеотиды 1-6571) и перекрывал р76 (фиг.1, часть А). Самые длинные клоны кДНК, полученные таким способом путем лигирования, были клонированы в Е. coli. Было восстановлено два стабильных клона полномерной кДНК.

Перед транскрипцией РНК каждый из двенадцати плазмидов pFL-TP21, выбранных из-за очевидной длины генома, поглощались EcoRV и осаждались с помощью этанола после фенол-хлороформного экстрагирования белков.

ПРИМЕР 2

Способ 2: Длинная ОТ-ПЦР кДНК вирусного генома. Данный способ использовал длинную ОТ-ПЦР в рамках отдельной попытки выделить кДНК с длиной вирусного генома. Две различных вирусных суспензии были использованы в качестве источника вирусных кДНК; одна суспензия, собранная на 2 день, имела низкий титр (3,8×10³ БОЕ/мл), в то время как другая суспензия, собранная на 5 день, имела высокий титр (2,4×10⁹ БОЕ/мл). Смесь ПЦР содержала праймеры (олиго 14444 и 1445), 10 мкл ОТ-продукта в качестве шаблона и ингредиенты ПЦР-набора Takara LA (Pan Vera Co., Madison, WI), в том числе 5 ед ДНК-полимеразы. ПЦР-продукты длиной приблизительно 11 кб отделялись от ДНК более низкого молекулярного веса путем электрофореза (фиг.2) в агарозном геле и изолировались из геля с помощью набора Qiagen для гелевого экстрагирования (Venio, The Netherlands). Перед использованием в качестве шаблона для транскрипции РНК ПЦР-продукт поглощался EcoRV и очищался посредством феноло-хлороформного экстрагирования. Транскрипты РНК (приблизительно 1 мкг) этих кДНК затем были трансфецированы в культуру клеток Веро, которая затем исследовалась для выявления свидетельств инфекции путем иммунофлюоресценции.

ПРИМЕР 3

Способ 3: Конструирование клонов полномерной кДНК из двух перекрывающихся ПЦР-фрагментов, выделенных из слабо титрированного вируса.

Данный способ использовал два перекрывающихся фрагмента кДНК, которые содержали полную последовательность ТР21 (фиг.1, часть В). Эти фрагменты были выделены из вирусной суспензии с низким титром (3,8×10³ БОЕ/мл). Для 5'-половины генома LGT ПЦР-продукт вырабатывался с помощью чувствительного праймера (олиго 1444), содержавшего сайт NotI, промотера SP6 и нуклеотидов 1-22 последовательности LGT, и отрицательно-чувствительного праймера (олиго 1023) 5'-CCCAGGGTTGCAAGCCCCAGG (Посл. №5), который был комплементарным для нуклеотидов 6637-6657 LGT. ПЦР использовалась для получения 3'-половины генома LGT с помощью положительно-чувствительного праймера (олиго 971) 5'-TTGCACCTGACTGAACTGGAG (Посл. №6), который был комплементарным для нуклеотидов 4451-4471 LGT, и олиго 1445 в качестве отрицательно-чувствительного праймера.

Сначала конструировался геном полномерной кДНК путем соединения этих двух ПЦР-фрагментов с помощью сайтов расщепления NotI и KpnI вектора p2A(XhoI) (Bray M. and Lai C.-J. (1991) Construction of intertypic chimeric viruses by substitution of structural protein genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10342-10346) и уникального сайта ApaI, который представлен в обоих ОТ-ПЦР-фрагментах (фиг.1). Однако эта стратегия приготовления полномерной кДНК не удалась, поскольку клоны были нестабильными в Е. coli. После этого два длинных фрагмента были собраны в стабильную полномерную кДНК в ходе двухшаговой процедуры клонирования.

На первом шаге ПЦР-продукт, представляющий 3'-половину генома (нуклеотиды 4451-10943), был клонирован в Е. coli с помощью плазмида р51 в качестве вектора. Плазмид р51 был создан посредством вставления небольшого BamHI-PstI-фрагмента (нуклеотиды 4539-5349) кДНК ТР21, который был получен путем ПЦР с помощью подходящих праймеров, в уникальный сайт BglII и PstI вектора p5'-2(NotI, Xhol, ΔHindIII) (Cahour A., Pletnev A.G., Vazeille-Falcoz M., Rosen L. and Lai C.-J. (1995) Growth-restricted dengue virus containing deletions in the 5' noncoding region of the RNA genome. Virology 207, 68-76). В дополнение к этому, плазмид р51 содержал сайт расщепления NotI, промотер SP6 и первые 88 нуклеотидов генома вируса Денге тип 4. Он использовался в качестве вектора, поскольку обладал уникальным сайтом расщепления ApaI. ПЦР-продукт (нуклеотиды 4451-10943 LGT) поглощался с помощью ApaI и KpnI, а затем клонировался в поглощенный ApaI-BamHI участок вектора р51 вместе с KpnI-BamHI-фрагментом, выделенным из р5'-2A(XhoI). После преобразования бактерий лигирующей смесью клон (р624-3), содержащий нуклеотиды LGT от 4539 до 3'-конца генома, выбирался на основании своей рестриктной схемы.

На втором шаге ПЦР-продукт, представляющий 5'-половину генома (нуклеотиды 1-6657), поглощался NotI и ApaI, а затем клонировался в р624-3, вырабатывая клоны полномерной кДНК рТР21. Двадцать восемь отдельных клонов кДНК LGT TP21 были стабильными в плазмидном векторе при распространении в штамме BD1528 Е. coli. Однако наблюдался некоторый полиморфизм среди стабильных полномерных кДНК LGT в отношении схемы поглощения рестриктного фермента. Были достоверно установлены вирусные последовательности четырех плазмидов, которые служили в качестве шаблонов для инфекционных РНК-транскриптов. Эти четыре плазмида были обозначены рТР21-636, рТР21-649, рТР21-656 и рТР21-689, и соответствующие цифры использовались при обозначении изъятого вируса.

ПРИМЕР 4

Транскрипция РНК, трансфецирование и восстановление вируса. Каждый из 28 стабильных плазмидов рТР21, содержащий полномерной кДНК ТР21, полученный в соответствии со способом 3 (фиг.1), был линеаризован с помощью EcoRV, экстрагирован с помощью фенол-хлороформа и осажден этанолом. Для синтеза РНК in vitro транскрипционная реакционная смесь содержала 5 мкг линеаризованной ДНК; 1 ммоль концевого аналога m7G(5')ppp(5')G (New England Biolabs, Beverly, MA); 0,5 ммоль АТФ, ЦТФ и УТФ; 10 ммоль ДТТ; 1×полимеразный буфер; 100 ед ингибитора РНазы; 50 ед SР6РНК-полимеразы (Promega, Madison, WI) в объеме 100 мкл. Реакционная смесь инкубировалась при 37°С в течение 1 часа, и затем шаблон ДНК поглощался 3 ед RQ1ДНазы (Promega, Madison, WI) в течение 10 минут при 37°С. Типичный выход РНК составлял приблизительно 10 мкг, как было определено с помощью агарозно-гелевого электрофорезного анализа.

Транскрипты РНК LGT-конструктов полной длины использовались для трансфецирования субсливающихся монослоев обезьяньих клеток Веро или LLCMK₂ или клеток ВНК хомяка в присутствии трансфекционного реагента LipofectAmine (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) или DOTAP (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN), как было описано ранее (Pletnev A.G., Bray M. and Lai C.-J. (1993) Chimeric tick-borne encephalitis and dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice. J. ViroL, 67, 4956-4963). На 5 день, а потом на 10, 15 и 20 день клетки были разделены и перенесены. Клеточные культуры в сдвижных камерах исследовались в каждом из этих случаев путем ИФТ на наличие белков LGT с помощью LGT-специфической мышиной антисыворотки или LGT-специфической HMAF. Когда 80-100% клеток были положительными по результатам ИФТ, содержимое инфицированных колб Т-75 собиралось, замораживалось и впоследствии использовалось для характеризации выделенного из кДНК вируса LGT. Данные рекомбинантные вирусы LGT были дважды амплифицированы в обезьяньих клетках Веро, после чего вирусная РНК изолировалась и обратно транскрибировалась для амплификации кДНК и анализа последовательности. Процедуры, использованные для исследования бляшек, анализа репликации в клеточной культуре и радиоиммунопреципитации вирус-специфичных белков, были описаны ранее (Pletnev A.G., Bray M., Higgins J. and Lai C.-J. (1992) Construction and characterization of tick-borne encephalitis/dengue type 4 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10532-10536; Pletnev A.G., Bray M. and Lai C.-J. (1993) Chimeric tick-borne encephalitis and dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice. J. ViroL, 67, 4956-4963).

ПРИМЕР 5

Оценка выделенных из кДНК вирусов на мышах

Периферическая нейровирулентность ("нейроинвазивность") родительского и клонированного вирусов ТР21 оценивалась на аутбридинговых швейцарских мышах в возрасте 3 недель, которые инокулировались по ВБ маршруту в группах по 5 особей с помощью 10⁴ или 10⁶ БОЕ вируса и наблюдались в течение 28 дней с целью обнаружить фатальный или нефатальный энцефалит. Значительно более чувствительный тест нейроинвазивности вируса LGT, использующий иммунодефицитных (SCID) мышей, также был выполнен для анализа этого важного фенотипа вирулентности (Pletnev A.G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mos-quito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751).

В данном тесте самки мышей С. В.-17 Icr/scid/scid в возрасте 3 недель (Taconic Farm, Germantown, NY) в группах по пять особей инокулировались ВБ с помощью (i) 10² БОЕ родительского ТР21, или Е5, или ТР21, выделенного из кДНК, либо (ii) 10⁵ БОЕ химерического вируса TP21/DEN4 или E5/DEN4, либо (iii) десятичных разбавлений изъятого рекомбинантного вируса в диапазоне от 1 до 10² БОЕ. Эти мыши наблюдались с целью определения смертности в течение 7 недель.

Инфекционный клон кДНК ослабленного клещевого флавивируса Лангата (штамм Е5) и 3'-делеционный мутант, сконструированный из него, проявляют уменьшенную нейроинвазивность для иммунодефицитных мышей.

Клетки и вирусные препараты. Сертифицированные клетки Веро (материал ВОЗ, 143 перенос) были получены в Novavax Inc. (Rockville, MD). Первичные клетки фибробластов эмбриона цыпленка (ФЭЦ) были любезно предоставлены доктором Линдой Уайатт (NIAID, NIH, Bethesda, MD). Обезьяньи клетки LLCMK₂ были куплены в American Type Culture Collection. Клетки выращивались в MEM с 1% глутамина, 10% сыворотки бычьего плода, 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл фунгизона при 37°С и 5% CO₂. Вирусный материал некультивированного штамма ТР21 LGT и его более ослабленных мутантов Е5 были приготовлены в клетках Веро, как было описано ранее.

Обратная транскрипция и ПЦР. Эти процедуры выполнялись, как было описано ранее.

Анализ последовательности вирусного генома. Полная последовательность генома (i) E5, (ii) E5, восстановленного из кДНК, и (iii) E5 или его производных, изолированных из мозга умирающих мышей на 14 или 28 день после инфицирования, была определена путем анализа последовательности 4 перекрывающихся ОТ-ПЦР-фрагментов кДНК, которые были выделены непосредственно из вирусной РНК. Олиго 1445 использовался в качестве праймера для получения первой спирали кДНК посредством обратной транскрипции, как описано выше. ПЦР выполнялась для амплифицирования четырех перекрывающихся фрагментов генома: А (нт 1-4192), Б (нт 3491-7277), В (нт 6131-9669) и Г (нт 8857-10943) с помощью подходящих праймеров и набора Takara LA для ПЦР. Праймеры для ПЦР и анализа последовательности были разработаны с помощью ранее опубликованной последовательности LGT (номер доступа GenBank AF253419 и AF253420). ПЦР-продукты были очищены в агарозном геле и изолированы с помощью набора гелевого экстрагирования Qiagen. Последовательность ОТ-ПЦР-фрагментов была определена с помощью BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PE Applied Biosystems/ABI Prism, Foster City, CA) и генетического анализатора модели 310.

ПРИМЕР 6

Способ I: Конструирование полномерной кДНК LGT E5.

(Фиг.4А). Длинный ОТ-ПЦР-фрагмент кДНК генома E5 и плазмид рТР21-636, содержащий инфекционную полномерную кДНК LGT TP21, использовались для этих целей. Плазмид рТР21-636 поглощался SffI и AgeI, сайты которых были уникальными в данном векторе. кДНК почти полной длины (приблизительно 10,5 кб) генома E5 была получена (фиг.4А) путем высокоточной ПЦР с помощью положительно-чувствительного праймера 1484, содержавшего первые 23 нуклеотида последовательности LGT, и отрицательно-чувствительного праймера 1107, который был комплементарным для нуклеотидов 10439-10460 3'-терминала LGT. Данный ОТ-ПЦР-фрагмент был выделен из суспензии вируса E5 со низким титром (1,2×10⁴ БОЕ/мл). ПЦР-продукт (нуклеотиды 1-10460 LGT E5) поглощался SfiI и Agel, а затем клонировался в часть SfiI(133)-AgeI(9737) вектора рТР21-636 (номера нуклеотидов указывают первое основание последовательности сайта распознавания и соответствуют последовательности полной длины генома LGT), содержавший сайт расщепления NotI, промотер SP6 и первые 133 нуклеотида и нуклеотиды 9737-10943 генома LGT TP21, которые полностью сохранены в Е5. Существовали также сайты расщепления EcoRV и KpnI, которые были внедрены в кДНК LGT непосредственно ниже 3'-конца генома (фиг.4). Получившиеся клоны рЕ5, содержавшие LGT E5, были идентифицированы путем рестриктного ферментного анализа и анализа последовательности геномных участков, на которых отличались геномы TP21 и E5. Шесть отдельных клонов полномерной кДНК E5 (плазмиды рЕ5) были стабильными в плазмидном векторе при распространении в Е. coli. Была определена полная вирусная последовательность одного из этих шести плазмидов; этот плазмид был обозначен рЕ5-651, и соответствующий номер был использован для обозначения изъятого вируса.

ПРИМЕР 7

Способ II: Введение делеций в полномерную кДНК LGT E5.

(Фиг.4Б и 4 В). Для введения делеций в 3'-НКУ генома E5 выработанные путем ПЦР субфрагменты между сайтом AgeI (нт 9737) и сайтом KpnI на 3'-конце были клонированы в векторе р624-3, который содержит эти уникальные сайты расщепления. Уникальный сайт AflII (нт 10379) был введен ниже ТАА-стоп-кодона в 3'-НКУ генома Е5-651 (Фиг.4Б и 4 В). Первый ПЦР-амплифицированный фрагмент был получен с помощью плазмида рЕ5-651 в качестве шаблона и положительно-чувствительного праймера (олиго 1013), содержащего нуклеотиды 9603-9623 генома LGT, и отрицательно-чувствительного праймера (олиго 1638) 5'-TTGGACTCCTTGCTTAAGGCTTTAAAATATTGAGCTCTC (Посл. №7) (жирным шрифтом выделена последовательность сайта AflII, стоп-антикодон подчеркнут). Этот ПЦР-фрагмент был поглощен AgeI и AflII. Четыре делеции ниже сайта AflII длиной 320, 374, 449 или 471 нуклеотидов были введены путем ПЦР с помощью отрицательно-чувствительного праймера (олиго 1445), содержащего комплементарную последовательность последних 23 нуклеотидов на 3'-терминале LGT и сайт EcoRV и KpnI и положительно-чувствительный праймер (олиго 1640, 1641, 1642 или 1643), содержащий целевую делеционную последовательность и находящийся сбоку от нее сайт AflII. Последовательности этих мутагенных праймеров были следующими: для делеции длиной 320 нт между нуклеотидами 10379-10700, олиго 1640, 5'-ACTGGGCGTTATCTTAAGGCCCCAGGGGGGAAACCCCTG (Посл. №8); для делеции длиной 374 нт между нуклеотидами 10379-10754, олиго 1641 Б 5'-GGATATTTCCTCCTTAAGATACCAAATGTCCCCTCGTCA (Посл. №9); для делеции длиной 449 нт между нуклеотидами 10379-10829, олиго 1642, 5'-CCCCTCGTCAGACTTAAGGGGGGGCGGTTCTTGTTCTCC (Посл. №10); для делеции длиной 471 нт между нуклеотидами 10379-10851, олиго 1643, 5'-ACGGACGTGCGCCTTAAGAAACTTTGTGAGACCCCTTGC (Посл. №11). ПЦР-фрагменты поглощались AflII и Kpnl, а затем клонировались в AgeI-KpnI-поглощенный участок вектора р624-3 совместно с AgeI-AflII-фрагментом, выделенным из первой ПЦР, как описано выше. После преобразования бактерий с помощью лигационных смесей клоны (р624-3'-320, р624-3'-374 р624-3'-449 и р624-3'-471), содержавшие целевые делеции в 3'-НКУ генома, были идентифицированы путем анализа последовательности. Конструирование клонов полномерной кДНК Е5 с делециями в 3'-НКУ генома выполнялось путем лигирования плазмида р624-3'-320, р624-3'-374 р624-3'-449 или р624-3'-471, который был поглощен NotI и AgeI, и NotI-AgeI-фрагмента рЕ5-651. Стабильные отдельные клоны полномерной кДНК Е5 (рЕ5-3'-320, рЕ5-3'-374 рЕ5-3'-449 и рЕ5-3'-471), содержавшие делецию длиной 320, 374, 449 или 471 нуклеотидов на 3'-НКУ генома, идентифицировались путем анализа последовательности.

ПРИМЕР 8

Транскрипция РНК, трансфецирование и восстановление вируса. Каждый из стабильных плазмидов рЕ5, содержащих полномерную кДНК LGT (фиг.4), линеаризовывался с помощью EcoRV, экстрагировался фенол-хлороформом и осажден этанолом. Для синтеза РНК in vitro транскрипционная реакционная смесь содержала 5 мкг линеаризованной ДНК; 1 ммоль концевого аналога m7G(5')ppp(5')G (New England Biolabs, Beverly, MA); 0,5 ммоль АТФ, ЦТФ и УТФ; 10 ммоль ДТТ; 1(полимеразный буфер; 100 ед ингибитора РНазы; 50 ед SP6 РНК-полимеразы (Promega, Madison, WI) в объеме 100 мкл. Реакционная смесь инкубировалась при 37°С в течение 1 часа, и затем шаблон ДНК поглощался 3 ед RQ1 ДНазы (Promega, Madison, WI) в течение 10 минут при 37°С. Типичный выход РНК составлял приблизительно 10 мкг, как было определено с помощью агарозно-гелевого электрофорезного анализа.

Транскрипты полномерной РНК LGT-конструктов использовались для трансфецирования субсливающихся монослоев клеток ФЭЦ или обезьяньих клеток Веро в присутствии трансфекционного реагента LipofectAmine (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). На 5 день, а потом на 10, 15 и 20 день клетки были разделены и перенесены. Клеточные культуры в сдвижных камерах исследовались в каждом из этих случаев путем ИФТ на наличие белков LGT с помощью LGT-специфичной мышиной антисыворотки или LGT-специфичной HMAF. Когда 80-100% клеток были положительными по результатам ИФТ, содержимое инфицированных колб Т-75 собиралось, замораживалось и впоследствии использовалось для характеризации выделенного из кДНК вируса LGT. Данные рекомбинантные вирусы LGT были только один раз амплифицированы в обезьяньих клетках Веро, после чего вирусная РНК изолировалась и обратно транскрибировалась для амплификации кДНК и анализа последовательности. Подобным же образом была определена последовательность выделенного из клеток Веро или выделенного из клеток ФЭЦ клона Е5-651 после 11 дополнительных переносов в соответствующей клеточной линии или после побляшковой очистки на клетках LLCMK₂ и одной амплификации на клетках Веро.

Процедуры, использованные для исследования бляшек и анализа репликации в клеточной культуре, были описаны ранее (Pletnev A.G., Вгау М., Higgins J. and Lai C.-J. (1992) Construction and characterization of tick-borne encephalitis/dengue type 4 viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10532-10536; Pletnev A.G., Bray M. and Lai C.-J. (1993) Chimeric tick-borne encephalitis and dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice. J. ViroL, 67, 4956-4963). Также параллельно с исследованием бляшек использовался иммуноокрашивающий фокус-образующий тест (Ishimine Т., Tadano M., Fukunaga Т. and Okuno Y. (1987). An improved micromethod for infectivity assays and neutralization test of dengue viruses. Biken Journal 30, 39-44) для определения вирусного титра, поскольку рекомбинантные вирусы не дают отчетливых бляшек в клетках Веро. Последовательное десятикратное разбавление вирусной суспензии в MEM, содержащей 2% термодезактивированной сыворотки бычьего плода (СБП), инокулировалось (0,2 мл) в дублированные ячейки 6-ячеечных или 24-ячеечных пластин клеточной культуры, содержащих монослой клеток Веро или LLCMK₂. После 1 часа адсорбирования при 37°С инокулят удалялся, и клетки в 6-ячеечных пластинах накрывались агаром и окрашивались для выявления бляшек с помощью нейтрального красного спустя 7 дней. Клетки в 24-ячеечных пластинах покрывались MEM, содержащей 2% СБП, 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл фунгизона и 1% трагакантовой резины (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) и инкубировались в течение 4 дней при 37°С и 5% СО₂. Среда удалялась, и клеточные монослои фиксировались в течение 30 минут метиловым спиртом и дважды промывались с помощью ФБС. Клетки в ячейках последовательно обрабатывались разбавленными 1:1000 LGT-специфическими мышиными антителами и пероксидазно-маркированным полимером, конъюгированным с антимышиными иммуноглобулинами (Dako Co., Carpinteria, CA), разбавленным 1:10 в ФБС. Связанные с антителами фокусы инфекционных клеток были проявлены с помощью 0,01% Н₂О₂ и 0,04% 1,3'-диаминобензидина (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО) в ФБС и подсчитаны, и вирусный титр был выражен в фокус-образующих единицах на миллилитр (ФОЕ/мл).

ПРИМЕР 9

Оценка выделенных из кДНК вирусов на мышах.

В предшествующем исследовании наблюдалось, что иммунодефицитные (SCID) мыши были в 10⁷-10⁸ раз более чувствительными для обнаружения нейроинвазивности, чем аутбридинговые швейцарские мыши (Pletnev A. G. and Men R. (1998) Attenuation of the Langat tick-borne flavivirus by chimerization with mosquito-borne flavivirus dengue type 4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1746-1751). По этой причине мыши SCID были использованы для исследования нейроинвазивности выделенного из кДНК LGT-вируса Е5 и его 3'-НКУ-делеционного мутанта. В данном исследовании самки мышей С. В.-17 Icr/scid/scid в возрасте 3 недель (Naconic Farms, Germantown, NY) в группах по пять особей инокулировались ВБ с помощью десятичных разбавлений выделенного из кДНК Е5 (клон 651) и его 3'-делеционного мутанта. Эти мыши наблюдались для определения смертности в течение 7 недель.

Кровь, печень и мозг умирающих мышей, проявлявших признаки прогрессирующего энцефалита, собирались, и 10% тканевая суспензия в MEM приготавливалась, замораживалась и позже использовалась для изолирования вируса и анализа последовательности. Вирусный титр в этих тканевых суспензиях определялся путем исследования бляшек или фокус-образующего теста с помощью монослоев клеток Веро или LLCMK₂. 100 мкл 10% тканевой суспензии использовалось для изолирования РНК, обратной транскрипции, амплификации кДНК посредством ПЦР и для анализа последовательности восстановленного вируса, как описано выше. Также изолят вируса Е5-651 или Е5-3'-320 из мышиного мозга был амплифицирован в клетках Веро и оценивался на мышах SCID в возрасте 3 недель в группах по 5 особей, которые были инокулированы ВБ с помощью десятичных разбавлений вируса.

Иммуногенность родительского вируса Е5 и рекомбинантных вирусов Е5-651 или Е5-3'-320 была оценена на самках швейцарских мышей в возрасте 3 недель, которые были инокулированы ВБ с помощью 10, 10², 10³ или 10⁴ БОЕ. На 33 день после инокуляции мышам пускали кровь для оценки антительной реакции, на следующий день проводили контрольное заражение с помощью 2000 ВБ LD₅₀ вируса ТР21 и наблюдали дополнительно еще 4 недели.

Для определения нейтрализующих вирус LGT антительных титров 10-кратно разбавленная сыворотка была термодезактивирована в течение 30 минут при 56°С. Последовательные двукратные разбавления сыворотки (начиная с сыворотки, разбавленной 1:10) смешивались с равным объемом вирусной суспензии ТР21, содержащей приблизительно 100 ФОЕ. Смесь инкубировалась в течение 30 минут при 37°С, и 0,1 мл добавлялось в дублирующиеся ячейки клеток LLCMK₂ в 24-ячеечной пластине. После 1 часа адсорбирования при 37°С инокулят удалялся, а клетки покрывались MEM, содержащей 2% СБП, 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл фунгизона и 1% трагакантовой резины, и титрировались на наличие инфекционного вируса с помощью фокус-образующего теста, как описано выше. Антительным титром являлось наибольшее разбавление антитела, которое уменьшало образование фокуса на 50% по сравнению с сывороткой, собранной у неиммунизированной мыши.

ПРИМЕР 10

Возбуждение иммунной реакции у субъекта, которому введено некоторое количество вируса Лангата.

Было установлено, что человекообразные приматы, но не другие животные, сразу инфицируются флавивирусом по периферийному маршруту (Simmons et al., Phipp. J. Sci. 44:1-247, 1931, и Rosen, Am. J. Trop.Med. Hyg. 7:406-410, 1958). Инфекция у обезьян представляет собой ближайшую к людям экспериментальную систему флавивирусной инфекции. Реакция резус-макак на флавивирусную инфекцию подобна реакции людей в том, что наблюдается виремия в течение 4-6 дней, хотя низшие приматы не развивают клинических флавивирусных симптомов. Цели изучения флавивирусов на обезьянах: (1) оценить иммуногенность различных вакцин-кандидатов; (2) оценить инфекционность и вирулентность (фенотип ослабления) живых флавивирусных вакцин-кандидатов, измеренные по продолжительности виремии в днях и по пиковому вирусному титру в БОЕ/мл; и (3) оценить защитную эффективность вышеупомянутых вакцин по отношению к контрольному заражению флавивирусом.

(1) Инокулирование: Каждый резус-макак инокулировался с помощью в общем 2×10⁵-2×10⁷ БОЕ вируса, разбавленных минимальной необходимой средой Игла/0,25% альбумина человеческой сыворотки. Обычно животным под анестезией давалось две подкожных дозы.

(2) Сбор крови: После инокулирования вируса образцы крови объемом 3,0 мл брались ежедневно в течение двух недель, объемом 5,0 мл - через 3 недели, 4 недели, 6 недель и 8 недель.

(3) Контрольное заражение флавивирусом: если контрольное заражение вирусом рассматривалось как подходящее для оценки защитной эффективности, обезьяны инокулировались неослабленным вирусом при 10²-10⁵ БОЕ/дозу в объеме 0,5 мл подкожно в области плеча.

(4) Лабораторные исследования: Образцы сыворотки использовались для определения: (а) продолжительности виремии путем прямого вирусного бляшкового теста; (б) титра флавивирус-специфических антител путем радио-иммунопреципитации и ELISA; и (в) титра нейтрализующих антител путем теста нейтрализации бляшкового уменьшения, причем все тесты известны специалистам в области разработки вакцин.

Хотя настоящее изобретение описано с некоторыми подробностями в целях ясности и понимания, специалист поймет, что различные изменения формы и подробностей могут быть внесены без отхода от объема изобретения. Все чертежи, таблицы и листинги, а также патенты, заявки и публикации, процитированные выше, явным образом и полностью включены сюда посредством ссылки.

1. Способ изготовления стабильного клона полномерной кДНК клещевого флавивируса Лангата, включающий множественное инфицирование линии клеток вирусом, сбор вирусной суспензии на ранней стадии культивирования, выделение вируса, при этом вирусный титр флавивирусной суспензии составляет приблизительно 3,8·10³ БОЕ для минимизирования частотности делеционных мутантов, которые аккумулируются на поздних стадиях инфекции, и проведение обратной транскрипции.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что ранняя стадия включает 1-5 дни культивирования.

3. Клон инфекционной полномерной кДНК клещевого флавивируса Лангата, полученный способом по п.1.

4. Клон по п.3, в котором упомянутый вирус Лангата является штаммом ТР21 вируса Лангата.

5. Клон по п.3, в котором упомянутый вирус Лангата является штаммом Е5 вируса Лангата.

6. Клон по п.3, содержащий далее мутации из клона ТР21-636, как описано в таблице 2.

7. Клон по п.3, содержащий далее мутации из клона ТР21-649, как описано в таблице 2.

8. Клон по п.3, содержащий далее мутации из клона ТР21-656, как описано в таблице 2.

9. Клон по п.3, содержащий далее мутации из клона ТР21-689, как описано в таблице 2.

10. Клон по п.3, содержащий далее мутации из клона Е5-651, как описано в таблице 2.

11. Клон по п.3, содержащий далее мутации из клона Е5-3'-320, при этом упомянутый клон имеет делецию, проходящую от nt 10379 до 10700 штамма Е5 Лангата.

12. Клон по п.3, содержащий, по меньшей мере, одну уменьшающую вирулентность мутацию, возникшую спонтанно или разработанную генетически.

13. Клон по п.3, внедренный в вектор.

14. Клон по п.13, в котором упомянутый вектор является плазмидой.

15. Способ получения преобразованной прокариотической клетки хозяина, стабильно трансформируемой с помощью клона, полученного по п.3.

16. Инфекционная РНК полной длины, транскрибированная из стабильного клона полномерной кДНК клещевого флавивируса Лангата, полученного по п.3.

17. Способ получения инфицированной эукариотической клетки хозяина, включающий трансфицирование эукариотической клетки с помощью РНК по п.16.

18. Способ получения вируса, включающий трансфицирование эукариотической клетки РНК по п.16 и последующее восстановление вируса.

19. Единичная доза иммуногенного состава, содержащего эффективное количество вируса с РНК по п.16.

20. Способ вызывания иммунной реакции, включающий введение вакцинируемому единичной дозы, приготовленной в соответствии с п.19.

21. Единичная доза вакцины, содержащая эффективное количество вируса с РНК по п.16.

22. Способ вызывания защитного иммунитета, включающий введение вакцинируемому единичной дозы, приготовленной в соответствии с п.21.