Способ и набор для обнаружения днк бактерии заболевания лаймского боррелиоза-borrelia burgdorferi
Владельцы патента RU 2289627:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет ГОУ ВПО СибГМУ (RU)
Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ для обнаружения ДНК возбудителя Лаймского боррелиоза человека в периферической крови, культуре клеток и клещах. Способ предусматривает выделение ДНК из биологического материала, синтез праймеров, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров и оценку полученных результатов. При этом используют праймеры BBsl4.F/BBsl4.R 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', к участку гена, кодирующего 16S рРНК. Способ является высокоспецифичным, чувствительным, но более простым. Кроме того, предложен набор для осуществления этого способа. Предложенная группа изобретений может быть использована в медицине и молекулярной биологии. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл.
Изобретение относится к молекулярной биологии, генетической инженерии, медицине: гематологии, медицинской диагностике и эпидемиологии, конкретно к способу и набору для обнаружения ДНК бактерии инфекционных заболеваний Лаймского боррелиоза в периферической крови, культуре клеток и клещах, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях, региональных, областных службах санэпиднадзора и на предприятиях биологической промышленности.
В последнее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) широко используется для диагностики вирусных и бактериальных заболеваний человека и индикации их возбудителей, в частности индикации Borrelia burgdorferi (1).
Наиболее близким способом и набором для обнаружения ДНК бактерии является способ и набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi методом ПЦР (2). Способ осуществляют следующим образом: фрагмент ДНК размером 840 пар нуклеотидов (п.н.), выделенный из консервативной области генома Borrelia burgdorferi, частично секвенирован и на основании этой последовательности отобраны шесть праймеров, позволяющие амплифицировать специфические фрагменты ДНК. Для идентификации этих продуктов методом молекулярной гибридизации в качестве ДНК-зондов использованы дополнительно синтезированный олигонуклеотид, а также рекомбинантная плазмида, содержащая данный фрагмент.
Набор содержит положительный контроль (рекомбинантную плазмиду), отрицательный контроль, 6 праймеров, растворитель и масло для ПЦР, термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов.
Недостатками данного способа и набора является, то, что проведение ПЦР с шестью праймерами сложно и увеличивает стоимость анализа, не дает возможности обнаруживать все геновиды, относящиеся к бактерии Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi, применяется только для экспериментальных исследований для обнаружения ДНК бактерии Лаймского боррелиоза Borrelia burgdorferi и только в культуре клеток.
Задачей предлагаемого изобретения является создание высокоспецифичного, чувствительного, но более простого и быстрого способа и соответствующего набора для обнаружения ДНК бактерии Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi в пробах периферической крови человека, культуре клеток и клещах с использованием двух праймеров, позволяющего осуществлять визуальную оценку возбудителей в анализируемом материале и обнаруживать все геновиды, относящиеся к Borrelia burgdorferi sensu lato.
Поставленная задача достигается способом для обнаружения ДНК бактерии Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi в пробах периферической крови человека, культуре клеток и клещах, при котором для постановки ПЦР выбраны и синтезированы два праймера ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGGGATATT-3′, 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы, с температурой отжига от 51 до 52 градусов C в течение 10-30 сек с числом циклов амплификации от 35-42 и набором, включающим пластиковые пробирки, содержащие: праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R-5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы; термостабильный фермент Tag-полимеразу; 5-кратный буфер для реакции; смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов; положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, отрицательный контроль и масло для ПЦР.
Сущность изобретений.
Способ обнаружения ДНК возбудителя Borrelia burgdorferi производят следующим образом
Выделение ДНК из биологического материала
Выделение проводят по стандартной методике с использованием протеиназы К, экстракции фенолом-хлороформом и последующим осаждением ДНК этанолом (3)
Образцы (пробы периферической крови человека, культура клеток и клещи)гомогенизируют в 5-6 объемах буфера А (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ NaCl, 3 мМ МgCl2) и центрифугируют при 2500g в течение 10 мин при 4°С. Осадок 2 раза промывают буфером А, затем ресуспендируют в буфере В (10 мМ ЭДТА, 100 млМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl рН 8,5. 0,5% SDS, 200 мкг/мл протеиназа К) и инкубируют 2 ч при температуре 37°С. После стандартной экстракции фенолом и хлороформом ДНК осаждают этанолом и растворяют в воде до концентрации 0,5 мкг/мл.
Синтез праймеров
Синтез олигонуклеотидов проводят традиционным фосфоамитидным методом (4). Например на синтезаторе ДНК ASM-800 фирмы "БИОССЕТ".
Проведение ПЦР
ПЦР проводят по стандартной методике с использованием двух праймеров: ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы, отобранных по нижеописанной методике. Отжиг праймеров производят при температуре 51-52°С в течение 10-30 сек при числе циклов амплификации, равных 35-42.
Детекция ДНК
Детекцию проводят в 2% агарозном геле с использованием ТВЕ - буфера (5,4 г Трис, 2,75 г борной кислоты, 0,46 г ЭДТА, dH2O до 1 л, рН 8.3) с бромистым этидием (2 мкл/100 мл буфера). В лунку геля под буфер вносят по 10 мкл амплификата (5). Электрофорез проводят при напряжении 20 V/см в течение 10 мин. Визуализацию результатов проводят на видеосистеме, например на BIOTEST-D (г.Москва).
Обоснование преимущества выбора праймеров
В качестве уникальной последовательности для диагностики В.burgdorferi sensu lato был выбран ген rrs, кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы. Был проведен анализ следующих ДНК-последовательностей (табл.1), полученных в базе данных Genome Net - DNA Database национального института генетики (Kyoto, Japan).
Подбор праймеров проводили с использованием программы Primer Premier - V.5 (Premier Biosoft Intеrnationа1). Для участка U03396 (ген rrs, GenBank) было подобрано несколько пар праймеров (табл.2). Специфические праймеры для В.burgdorferi получены в результате дизайна последовательности 16S рРНК и спейсерного участка 16S рРНК - 23S рРНК.
Оценку специфичности праймеров для 16S рРНК проводили методом множественного сравнения последовательностей, используя программное обеспечение, например BLAST, для оптимальной оценки видоспецифичности и Clastal W для оценки полиморфизмов в сравниваемых последовательностях.
Оптимальной парой праймеров (с учетом их термодинамических характеристик) были выбраны праймеры ВВsl1.F/ВВsl1.R и ВВsl4.F/ВВsl4.R (табл.3).
Праймеры ВВsl1.F/ВВsl1.R расположены на участке гена rrs, кодирущего 16S рРНК, и инициирует амплификацию продукта 537 п.н. Праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R расположены на спейсерном участке 16S-23S и инициируют амплификацию продукта 688 п.н. (фиг.1).
Данные праймеры не образуют вторичных структур (шпилек) и димеров, что увеличивает эффективность их связывания с матричной ДНК. Однако праймер ВВsl1.F имеет участки фальшь-праймирования, но без образования продуктов.
Праймер ВВsl1.R. также имеет участок фальшь-праймирования с образованием продуктов. Однако энергия ΔG, которая образуется при комплементарном взаимодействии, ниже критической (ΔGk=-9). Праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R могут образовывать нестабильные кросс-димеры.
Обоснование подбора условий для проведения ПЦР
Оптимизацию температуры амплификации проводили экспериментально, при сохранении всех условий постановки ПЦР, температуру отжига праймеров изменяли от 45°С до 57°С.
При температуре отжига праймеров 45°С происходила амплификация ДНК всех исследованных штаммов Borrelia, ДНК микроорганизмов других таксономических групп при данных условиях не амплифицировались. При повышении температуры выше 56°С продукты ПЦР в геле не обнаруживаются. Оптимальное соотношение количества специфических и неспецифических продуктов амплификации ДНК бактерии В.burgdorferi установлено при температуре отжига праймеров 52°С для пары праймеров ВВsl1.F/ВВsl1.R и 51°С для ВВsl4.F/ВВsl4.R!
При использовании режима активного регулирования температуры был выявлен следующий диапазон температур: время денатурации и элонгации составило от 10 до 30 сек, оптимальное 15 сек, время отжига праймеров от 10 до 30 сек., эффективное число циклов - 35-42.
Аналитические характеристики
Аналитическая чувствительность ПЦР была определена методом лимитирующих разведений ДНК бактерии Borrelia burgdorferi, выделенной из культуры. В результате проведенной оценки установлено, что праймеры используемых в данном исследовании ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы, обладают высокой аналитической чувствительностью на уровне 20 геномных эквивалентов в каждой ПЦР реакции (фиг.2; Табл.4).
Предварительная оценка аналитической специфичности используемых праймеров с помощью on-line сервера BLAST (blastn) показала отсутствие гомологии выбранной последовательности с другими видами микроорганизмов, при уровне значимости Е=10. (фиг.2).
В результате, амплификация с праймерами ВВsl4.F/ВВsl4.R (спейсерный участок 16S-23S рРНК) во всех случаях давала отрицательные результаты. В то время, как использование пары ВВsl1.F/ВВsl1.R (16S рРНК) приводило в 40% случаев к слабоположительным результатам с Preponema palidum, что послужило основанием не использовать эту пару праймеров в дальнейшем тестировании.
Набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi включает пластиковые пробирки, содержащие термостабильный фермент Tag-полимеразу, 5-кратный буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклео-тидтрифосфатов, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена флагелина бактерии, масло для ПЦР и праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы.
Предлагаемый набор укомплектован 5 пластиковыми пробирками.
Набор предназначен для выявления ДНК бактерии Borrelia burgdorferi в культуре клеток, сыворотке крови или клеще методом полимеразной цепной реакцией с визуальной индикацией полученного ампликона ДНК гель-электрофорезом в агарозе и может быть использован в клинических и эпидемиологических исследованиях. Набор рассчитан на проведение 110 анализов, включая положительный и отрицательный контроли.
Набор работает следующим образом.
Проведение ПЦР
1. Готовят пробирки для проведения амплификации, пронумеровав их и расположив соответствующим образом в штативе. Готовят две пробирки для контролей: одну для отрицательного и одну для положительного контроля.
2. Готовят смесь компонентов для амплификации из расчета на одну пробу: термостабильный фермент Tag-полимеразу, 5-кратный буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов и праймеры ВВsl4.F/ВВsl4.R - 5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3', 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3', кодирующий 16S рРНК, который является компонентом рибосомы.
3. Смесь перемешивают пипетированием и добавляют по 15 мкл в каждую пробирку для амплификации.
4. Вносят по одной капле масла для ПЦР в каждую пробирку, используя пипетку с наконечником до 1 мл.
5. Вносят по 10 мкл выделенной из клинического образца ДНК в соответствующую пробирку для проведения амплификации с помощью индивидуального наконечника с фильтром. Вносят в пробирку, помеченную как положительный контроль, 10 мкл контрольной ДНК, а в пробирку, помеченную как отрицательный контроль, 10 мкл отрицательного контрольного образца.
6. Пробирки закрывают и центрифугируют в течение 5 сек при 3 тыс. об/мин.
7. Переносят пробирки в программируемый термостат (амплификатор), прогревают при 95°С в течение 5 мин и проводят амплификацию по следующей программе (Табл.5).
Анализ результатов диагностики
1. Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР проводят методом горизонтального гель-электрофореза в 2% агарозе.
2. В положительном контрольном образце для Borrelia burgdorferi выявляют полосу размером 500 нуклеотидных пар.
3. В отрицательном контрольном образце полоса, соответствующая фрагментам генома данных инфекций, должна отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации набора.
В анализируемых пробах отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии возбудителя в пробе; наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю, свидетельствует о наличии данного возбудителя в пробе. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного светофильтра.
Таким образом, предлагаемый способ и набор обладают новизной: установлены видоспецифические сайты генома бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi в области гена, кодирующего 16S рРНК (rrs); оптимальная температура отжига: время денатурации и элонгации составило от 10 до 30 сек, оптимальное 15 сек, время отжига для пары праймеров 16S рРНК от 10 до 30 сек при температуре отжига 51-52°С, число циклов амплификации 35-42, что позволяет достичь высокого уровня чувствительности с помощью двух праймеров вместо шести, используемых в стандартной ПЦР, сократить время выявления ДНК бактерий, в течение 2 часов обнаружить до 10 фемтограмм ДНК бактерии Borrelia burgdorferi или 20 частиц в 1 мл инфекционного материала, включая пробы крови и клещей.
Источники информации
1.Yigong Ge, J Bacteriol, Мау 1998, р.2418-2425, Vol.180, No.9.
2. Dionysios Liveris, Journal of Clinical Microbiology, March 1999, р.565-569, Vol.37, No.3.
3. Манниатис Т., 1984.
4. Grossman L., 1987.
5. Остерман Л.А., 1981.
| Таблица 1 | |||||
| Название микроорганизма | Регистрационный номер (Genbank) | Ген | Штамм | Дата открытия | Размер гена (пн) |
| Gb_ba:Bbrnaopr | U03396 | Rrs (16S rRNA) | В31 | 10/93 | 11955 |
| Gb_ba:Вbu44938 | U44938 | Rrs (16S rRNA) | 5МТ | 5/96 | 1,533 |
| Gb_ba:Bor16rg | L39080 | rrs (16S rRNA) | 9МТ | 3/95 | 1,533 |
| Gb_ba:Вbu44939 | U44939 | rrs(16S rRNA) | 917Y | 5/96 | 1,533 |
| Gb_ba:Bb16s297 | Х85204 | rrs(16S rRNA) | 297 | 5/95 | 1,488 |
| Gb_ba:Borrrd | L36160 | rrs(16S rRNA) | 934U | 9/94 | 1,536 |
| Gb_ba:Воr16rga | L39081 | rrs(16S rRNA) | 935Т | 3/95 | 1,542 |
| Gb_ba:Borrrdq | М64309 | rrs(16S rRNA) | 1352 | 4/92 | 1,481 |
| Gb_ba:Borrrd | М64310 | rrs (16S rRNA) | 20004 | 4/92 | 1,480 |
| Gb_ba:Вb16srrna | Х57404 | rrs(16S rRNA) | В31 | 3/92 | 1,465 |
| Gb_ba:Borssrna | М59293 | rrs(16S rRNA) | В31 | 4/92 | 1,480 |
| Gb_ba:Borrnaca | М89935 | rrs(16S rRNA) | СА2-87 | 1/93 | 1,291 |
| Gb_ba:Вb16sdk7 | Х85195 | rrs(16S rRNA) | DК7 | 5/95 | 1,488 |
| Gb_ba:Вb16sdk29 | Х85202 | rrs(16S rRNA) | DК29 | 5/95 | 1,488 |
| Gb_ba:Вb16sdunk | Х85201 | rrs(16S rRNA) | DUNKIRK | 5/95 | 1,488 |
| Gb_ba:Вbu28501 | U28501 | rrs(16S rRNA) | ESP-1 | 7/95 | 1,488 |
| Gb_ba:Воrrr16sa | М60967 | rrs(16S rRNA) | G2 | 4/92 | 1,483 |
| Gb_ba:Borrnail | М89936 | rrs(16S rRNA) | Illinois 1 | 1/93 | 1,291 |
| Gb_ba:Вb16skipp | Х85196 | rrs(16S rRNA) | KIPP | 5/95 | 1,488 |
| Gb_ba:Вb16slipz | Х85203 | rrs(16S rRNA) | LIPITZ | 5/95 | 1,488 |
| Gb_ba:Воrrr16sc | М60969 | rrs(16S rRNA) | Sh-2-82 | 4/92 | 1,476 |
| Gb_ba:Borrnavs | М89938 | rrs(16S rRNA) | VS219 | 1/93 | 1,350 |
| Gb_ba:Borrgda | L40596 | Rrs(16S rRNA) | 3/95 | 1,492 |
| Таблица 2 | ||||||
| Праймер | Локус | Нуклеотидная последовательность | ||||
| ВВsl1.F | 19-44 п.н. | 5'-CAGACAACAGAAGGGAATTTAAATG-3' | ||||
| ВВsl1.R | 532-556 п.н. | 5'-CAAGTGATGTATTAGCATCAACTG-3' | ||||
| ВВsl2.F | 87-111 п.н. | 5'-TTGTTAGCAGGAGTATGCAATATC-3' | ||||
| ВВsl2.R | 408-429 п.н. | 5'-GGGCTTGTAAGCTCTTTAACT-3' | ||||
| ВВsl3.F | 128-149 п.н. | 5'-GCTGCTGGCATGGGGGTTTCT-3' | ||||
| ВВsl3.R | 729-754 п.н. | 5'-CAATAGCATACTCAGTAGTACTATT-3' | ||||
| ВВsl4.F | 1224-1248 п.н. | 5'-AAAGAATACATTAAGTGCGATATT-3' | ||||
| ВВsl4.R | 1888-1912 п.н. | 5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3' | ||||
| Таблица 3 | ||||||
| Праймер | Ген | Длина | Секвенс-номер | GC % | Tm (оС) | Та Ppt (оС) |
| ВВsl1.F | rrs | 25 | 19 | 52,6 | 55,1 | |
| ВВsl1.R | rrs | 24 | 532 | 60,0 | 61,3 | |
| Продукт 1 | 537 | 45,4 | 87,7 | 53,0 | ||
| ВВsl4.F | rrs | 24 | 1224 | 54,5 | 59,5 | |
| ВВзl4.R | rrs | 24 | 1888 | 50,0 | 61,9 | |
| Продукт 2 | 688 | 34,5 | 83,3 | 51,1 |
| Таблица 4 | ||||||
| Исследуемый штамм | Праймер B.Bsl1.F/B.Bsl1.R ГЭ в пробе | Праймер B.Bsl4.F/B.Bsl4.R ГЭ в пробе | ||||
| В.В.s.s. В31 | 120 | 150 | ||||
| В.afzelii | 600 | 300 | ||||
| В.В.s.s.Taldom №17 | 600 | 300 | ||||
| Таблица 5 | ||||||
| Амплификаторы с регулированием по матрице: типа "MiniCicler" | Амплификаторы с активным регулированием (по пробиркам): типа "Терцик", "Omn-Е" | |||||
| Температура | Время | Циклов | Температура | Время | Циклов | |
| 1 | 95° | 5 мин | 1 | 95° | 5 мин | 1 |
| 2 | 95° | 1 мин | 40 | 95° | 30 с | 40 |
| 52° | 1 мин | 52° | 30 с | |||
| 72° | 1 мин | 72° | 30 с | |||
| 3 | 72° | 1 мин | 1 | 72° | 1 мин | 1 |
| 4 | 10° | Хране-е | 10° | Хране-е |
1. Способ обнаружения ДНК бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi, включающий выделение ДНК из биологического материала, синтез праймеров, постановку полимеразной цепной реакции с использованием синтезированных праймеров и оценку проведения реакции гель-электрофорезом в 2%-ном агарозе, отличающийся тем, что при постановке полимеразной цепной реакции используют для обнаружения ДНК бактерий в культуре клеток, пробах периферической крови человека и клещах два праймера: BBs14.F/BBs14.R
5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3',
5'-CAATCCACTTAATTTTTGTGTTAT-3',
к участку гена, кодирующего 16S рРНК, который является компонентом рибосомы, отжиг праймеров производят при температуре 51-52°С в течение 10-30 с, а число циклов амплификации равно 35-42, при этом отсутствие полосы строго на уровне соответствующего контроля свидетельствует об отсутствии возбудителя в пробе, а наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю, свидетельствует о наличии данного возбудителя в пробе.
2. Набор для обнаружения ДНК бактерии заболевания Лаймского боррелиоза - Borrelia burgdorferi, включающий термостабильный фермент Tag-полимеразу, буфер для постановки реакции, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительный контроль - рекомбинантную плазмиду, содержащую фрагмент гена флагелина бактерии, и масло для полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что он содержит праймеры: BBs14.F/BBs14.R-5'-AAGAATACATTAAGTGCGATATT-3',5'-CAATCCACTTAATTTTTGTCTTAT-3', кодирующий 16S pPHK, который является компонентом рибосомы и 5-кратный буфер для постановки реакции.
