Способ биологической ремедиации нефтезагрязненных почв

Изобретение относится к биотехнологии, ремедиации загрязненных земель и предназначено для восстановления почв, загрязненных сырой нефтью и нефтепродуктами. Способ заключается в том, что почву обрабатывают сухим бакпрепаратом с наполнителем, в котором в качестве микроорганизмов используют штамм Pseudomonas fluorescens КО (ВНИИСХМ Д-619) и штамм Pseudomonas aeruginosa КОА-3 (ВНИИСХМ Д-609), а в качестве наполнителя используют отходы бурого угля. После обработки почвы ее засевают семенами смеси бобовых и злаковых культур, предварительно обработанных сухим регулятором роста растений, в качестве которого берут бакпрепараты на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 (ВНИИСХМ В-35 Д), Bacillus megaterium КС-1 (ВНИИСХМ В-135 Д). Применение изобретения позволяет достичь устойчивого травостоя на почве после разложения нефтепродуктов. 1 з.п. ф-лы, 6 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, ремедиации загрязненных земель и предназначено для восстановления почв, загрязненных сырой нефтью и нефтепродуктами.

Известен способ очистки почвы от нефти и нефтепродуктов, предусматривающий обработку очищаемой почвы от нефти и нефтепродуктов микроорганизмами Rhodococcum erythropolis АС-1339 Д с питательной средой. Перед внесением микроорганизмов с питательной средой в очищаемую почву вносят высокомолекулярные кислоты (ВМК), обладающие ростстимулирующим действием, полученные путем окисления керогена сланцев в водно-щелочных средах (патент РФ №2160718).

Недостатком известного способа является применение дорогостоящих ВМК, полученных путем окисления керогена сланцев в водно-щелочной среде.

Наиболее близким по техническому решению является способ биоремедиации нефтезагрязненных почв путем обработки почвы бакпрепаратами и посев семян бобовых и злаковых культур растений, предварительно обработанных раствором бакпрепаратов, содержащих Actinomycetes sp.1-96A АбЗТ Биофлора №В-05 и Azotobacter chroococcum ВКПМ, некорневой подкормкой вегетирующих растений минеральными удобрениями. Для обработки почвы используют вышеуказанные препараты с добавлением дополнительных бакпрепаратов, включающих Bacillus mucitaginosus ВКПМ В-5987 и консорциум ВКПМ 5972. состоящего из Streptococcus thermophitus. Streptococcus bobis, Lactobacillus salivanius rear. salicinicus, Lactobacillus saliresriums var salicinicus, Lactobacillus saliuarius var salivanius, Lactobacillus thermophilus и использование для роста растений активатора Эль-1 заводского изготовления (патент РФ №2176164).

Недостатком указанного способа является обработка семян жидкими бакпрепаратами, что требует немедленного их внесения в почву, так как от длительного хранения они теряют активность. Поэтому бактериальные препараты можно применять только на ближайшем расстоянии от пункта их приготовления, а на большие расстояния - жидкие препараты изготовлять не рекомендуется. Кроме того, внесение большого количества биопрепаратов (8 видов), а также использование для роста растений активатора Эль-1 заводского изготовления требуются определенные затраты, что удорожает использование данного способа.

Задачей изобретения является разработка технологии биологической ремедиации нефтезагрязненных почв, обеспечивающая разложение нефтепродуктов в почве, с наименьшими затратами как физическими, так и материальными.

Технический результат - создание устойчивого травостоя на почве после разложения нефтепродуктов.

Технический результат поставленной задачи достигается тем, что в способе биологической ремедиации нефтезагрязненных почв, включающий обработку почвы бакпрепаратами, посев смеси семян бобовых и злаковых культур, предварительно обработанных регулятором роста растений, согласно изобретению почву обрабатывают сухим бакпрепаратом с наполнителем в количестве 50 кг/га, в котором в качестве микроорганизмов используют штамм Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 и штамм Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609 в соотношении 1:1, а в качестве наполнителя используют отходы бурого угля, при этом в качестве регулятора роста растений используют сухой бакпрепарат на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д в количестве 2 кг/га и соотношении бактериальных культур 1:1.

При этом бакпрепараты Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д содержат гуминовые, карбоновые, аминокислоты, полисахариды, витамины группы В.

Штамм микроорганизмов Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 депонирован 20.04.2004 под регистрационным номером Д-619 в группе эпифитных, микроорганизмов и находится в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Штамм микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609 депонирован 02.08.2002 под регистрационным номером "Д-609 ВНИИСХМ" в группе эпифитных микроорганизмов и находится в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Штамм Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д депонирован 14.05.1999 г.в группе споровых микроорганизмов под регистрационным номером "ВНИИСХМ В-135 Д" 14 мая 1999 г.в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Штамм Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д депонирован 14.05 1999 г. под регистрационным номером "ВНИИСХМ В-35 Д" в группе азотфиксирующих микроорганизмов в коллекции ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

Использование сухих бактериальных препаратов Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609, Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 для биологической ремедиации нефтезагрязненных почв с наполнителем совместно с обработкой семян перед посевом бакпрепаратом, содержищим Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д, позволяет не только уменьшить затраты материальные и физические по ремедиации, но и добиться разложения нефтепродуктов в почве, при этом осуществить это за вегетационный период и создать устойчивый травостой.

Заявляемый способ реализуется следующим образом.

Пример 1. Почву, загрязненную мазутом (содержание мазута 13%) на спланированном и выровненном участке, обрабатывали сухим бакпрепаратом с наполнителем, содержащим бактериальные культуры Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 и Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609, взятых в соотношении 1:1, а в качестве наполнителя использовали отходы бурого угля, содержащие комплекс всех микроэлементов, необходимых для роста и развития растений.

Количество препарата по сухому весу составило 50 кг/га. Бактериальный титр равен 10⁹.

После внесения в почву сухих бактериальных препаратов проводили рыхление на глубину корнеобитаемого слоя ˜15 см для улучшения физического режима влагоемкости и улучшения аэрации. Через неделю (7 дней) обработанный участок засевали смесью семян, состоящей из овсяницы луговой - 40%, вики, гороха, овса по 20%, предварительно обрабатанных сухим бакпрепаратом, содержащим культуру Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, содержащей регуляторы роста растений (гуминовые, карбоновые, аминокислоты, полисахариды, витамины группы В), и культуру Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д, также стимулирующей рост растений. Бактериальные культуры Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д берут в соотношении 1:1.

Количество сухого препарата, содержащего культуру Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д и культуру Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д с содержанием бактериальных клеток в 1 г - 10⁹ составило 2 кг/га. Соотношение бактериальных культур в препарате 1:1.

Контрольный участок загрязненной земли засевали тем же составом семян в том же количестве, без обработки бактериальными препаратами.

Опыт проводили в диапазоне температуры от 17 до 25°С. Всходы на опытном участке появились на 5-7 день.

Морфофизиологические и биометрические обследования посевов проводили в процессе роста и развития растений при определении динамики содержания нефтезагрязнителя в почве и микробиологическом анализе почвы.

Результаты представлены в таблице 1.

В таблице 1 приведены результаты роста опытных растений в контроле (без обработки бакпрепаратами) и в опыте (предлагаемым способом). Результаты опыта сравнивались с прототипом. Из таблицы видно, что в контроле появление всходов было единичным. В прототипе всходы появились на 7-10 день, в опыте на 4-6 день. Плотность травостоя в контроле через 30 дней составила в количестве 5 шт. на 1 дм², в прототипе - 49 шт., в опыте - 75 шт. После перезимовки рост растений в контроле отсутствует, а в прототипе - сплошной газон, в опыте - гутой сплошной газон.

В таблице 2 приведены результаты разложения мазута микроорганизмами.

Были проведены следующие варианты опытов: на почве, не загрязненной мазутом, контроль, без обработки препаратами, по прототипу, предлагаемым способом. Как видно из таблицы, в почве, не загрязненной мазутом, количество бактерий после обработки почвы бакпрепаратами через 3 месяца возросло с 5,2·10⁶ до 6,8·10⁶ в 1 г почвы. Количество мазута в контроле через 3 месяца снизилось со 100 до 98,7%, в прототипе - со 100 до 11,7%, в предлагаемом способе - со 100 до 0,08%. В такой же степени наблюдалось увеличение численности микроорганизмов в почве, т.е. в контроле количество микроорганизмов повысилось незначительно за 3 месяца с 0,1·10⁴ до 0,1·10⁵. В прототипе количество микроорганизмов повысилось с 0,2·10⁵ до 0,5·10⁵. В предлагаемом способе отмечалось значительное повышение количества микроорганизмов с 0,1·10⁴ до 3,7·10⁶.

Таблица 1
Варианты опыта	Появление всходов, шт.	Плотность травостоя на 1 дм2 через 30 дней, шт.	Число растений после перезимовки
Контроль	Единичные	5	"Черный пар"
Прототип	на 7-10 день	49	Сплошной газон
Предлагаемый способ	на 4-6 день	75	Густой сплошной газон
Таблица 2
Варианты опыта	Содержание мазута в почве через:	Динамика численности микроорганизмов в почве (в 1 г) через:
до обработки, %	3 недели, %	№ месяца, %	до обработки	3 недели	3 месяца
Почва не загрязненная	-	-	-	5,2·106	6,3·106	6,8·106
Контроль	100	100	98,7	0,1·104	0,1·105	0,1·105
Прототип	100	88,3	11,7	0,2·105	0,2·105	0,5·105
Предлагаемый способ	100	75,4	0,08	0,1·104	0,4·106	3,7·106

Пример 2.

Почву, загрязненную гудроном (11%), подготовленную и обработанную сухим бакпрепаратом, содержащим бактериальные культуры Pseudomonas fluorescens КО ВНИ-ИСХМ Д-619 и Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609, взятых в соотношении 1:1, и наполнитель, в качестве которого использовали отходы бурого угля, содержащие комплекс всех микроэлементов, необходимых для роста и развития растений. Количество бакпрепарата составило 50 кг/га с бактериальным титром 10⁹. После внесения в почву сухих бакпрепаратов на опытных участках проводилось рыхление на глубину корнеобитаемого слоя ˜15 см. Через неделю (7 дней) обработанный участок засевали смесью семян, состоящей из овсяницы луговой - 50%, вики - 40%, житняка - 10%, обработанных сухим бактериальным препаратом, содержащим культуру Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д и культуру Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д. Количество препарата составило 2 кг/га, содержание бактериальных клеток в 1 г - 10⁹. Соотношение бактериальных культур в препарате 1:1. Результаты представлены в таблице 3.

Из таблицы 3 видно, что в контроле, без обработки почвы бакпрепаратами появление всходов отмечалось единичное: плотность травостоя через 30 дней была минимальной - 3 шт. на 1 дм². В прототипе появление всходов растений было на 9-11 день; плотность травостоя через 30 дней была 38 шт. на 1 дм². После перезимовки на участке был почти сплошной газон. В опыте по предлагаемому всходы взошли на 7-8 день, плотность травостоя на 1 дм² через 30 дней равнялась 54 шт., а после перезимовки - рос сплошной газон.

В таблице 4 представлено содержание гудрона в почве в течение вегетационного периода роста растений, через 3 недели и через 3 месяца и динамика численности микроорганизмов в почве до обработки, через 1 и 3 месяца. В почве, не загрязненной гудроном, количество микроорганизмов до обработки составило 6,1·10⁶, через 1 месяц - 6,7·10⁶; через 3 месяца 7,4·10⁶. В контроле без обработки бакпрепаратом количество гудрона за 3 месяца не снизилось. Количество микроорганизмов до обработки составило 0,5·10⁶, через 1 и 3 месяца вырастали единичные колонии микроорганизмов. Количество гудрона в прототипе через 3 недели снизилось со 100 до 85%, через 3 месяца до 68,4%. По предлагаемому способу количество гудрона снизилось в почве через 3 недели до 77,9%, через 3 месяца до 10,0%. Количество микроорганизмов в почве в предлагаемом способе по сравнению с прототипом также резко отличалось как через 1 месяц, так и через 3 месяца обследования. Если в прототипе количество микроорганизмов до обработки было 0,4·10, в предлагаемом - 0,5·10⁶, то через 3 месяца количество микроорганизмов в почве резко отличалось как через 1 месяц, так и через 3 месяца обследования.

Если в прототипе количество микроорганизмов до обработки было 0,4·10⁵, в предлагаемом способе 0,5·10⁶, то через 3 месяца количество микроорганизмов в почве по предлагаемому способу резко возросло до 1,5·10⁶ по сравнению с прототипом (0,6·10⁵), что указывает на хорошие результаты по сравнению с прототипом.

Таблица 3
Варианты опыта	Появление всходов, шт.	Плотность травостоя на 1 дм2 через 30 дней, шт.	Число растений после перезимовки
Контроль	Единичные	3	"Черный пар"
Прототип	на 9-11 день	38	Почти сплошной газон
Предлагаемый способ	на 7-8 день	54	Густой сплошной газон
Таблица 4
Варианты опыта	Содержание гудрона в почве через:	Динамика численности микроорганизмов в почве (в 1 г) через:
до обработки, %	3 недели, %	№ месяца, %	до обработки	3 недели	3 месяца
Почва не загрязненная	-	-	-	6,1·106	6,7·106	7,4·106
Контроль	100	100	100	0,5·106	единичные колонии	единичные колонии
Прототип	100	85,0	68,4	0,4·105	0,7·105	0,6·105
Предлагаемый способ	100	77,9	10,0	0,5·106	0,9·105	1,5·105

Пример 3.

Почву, загрязненную мазутом (содержание 13%) и гудроном (содержание гудрона 11%), на спланированном и выровненном участке проводили работы аналогично примеру 1.

После внесения в почву бакпрепаратов проводилось рыхление на глубину ˜15 см. Через неделю обработанный участок засевали смесью семян овса, гороха, вики в соотношении 1:1:1, предварительно обработанных сухим препаратом, содержащим культуру Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д и культуру Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д.

Контрольный участок, содержащий тот же состав (мазут и гудрон), засевали тем же составом семян в том же количестве, но обработку бакпрепаратами не производили. Смесь овса, гороха, и вики была высеяна на участке в соотношении 1:1:1.

Результаты приведены в таблице 5 и 6. Как видно из таблиц 5 и 6, появление всходов растений в контроле (без обработки бакпрепаратами) было единичным и плотность травостоя на 1 дм³ через 30 дней равнялась 4. После перезимовки растения на участке не росли. В опыте по предлагаемому способу появление всходов растений отмечалось на 6-8 день. Плотность травостоя на 1 дм³ через 30 дней составила 70%, а после перезимовки в опыте отмечается сплошной газон растений. Содержание гудрона и мазута в почве в контрольном участке оставалось в течение 3 месяцев в количестве 100%. В опыте через 3 месяца их количество уменьшилось со 100 до 6,0%. Численность микроорганизмов в опыте также значительно увеличилось за 3 месяца с 0,8·10⁶ до 1,7·10⁶. В контроле, наоборот, количество микроорганизмов резко снизилось через 3 месяца. В почве с контрольного участка вырастали только единичные колонии микроорганизмов.

Таким образом, как показали испытания, количество мазута и гудрона под влиянием внесенных микроорганизмов Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 и Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609 резко снизилось за 3 месяца по сравнению с прототипом, при этом количество микроорганизмов резко возросло за 3 месяца, в прототипе увеличение количества микроорганизмов было незначительным.

Таблица 5
Варианты опыта	Появление всходов, шт.	Плотность травостоя на 1 дм2 через 30 дней, шт.	Число растений после перезимовки
Контроль	Единичные	4	"Черный пар"
Предлагаемый способ	на 6-8 день	70	Сплошной газон
Таблица 6
Варианты опыта	Содержание мазута в почве через:	Динамика численности микроорганизмов в почве (в 1 г) через:
до обработки, %	3 недели, %	№ месяца, %	до обработки	3 недели	3 месяца
Почва не загрязненная	-	-	-	5,2·106	6,3·106	6,8·106
Контроль	100	100	98,7	0,1·104	0,1·105	0,1·105
Прототип	100	88,3	11,7	0,2·105	0,2·105	0,5·105
Предлагаемый способ	100	75,4	0,08	0,1·104	0,4·105	3,7·106

Предлагаемый способ позволяет резко снизить количество нефтепродуктов (мазута и гудрона) в почве в течение вегетационного периода роста растений (3 месяца), обеспечивает хороший рост и развитие растений, а также повышает численность микроорганизмов в почве. Использование бактериальных культур Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д и Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д в качестве регуляторов роста растений повышает плодородие земель, загрязненных нефтью при минимальных затратах.

1. Способ биологической ремедиации нефтезагрязненных почв, включающий обработку почвы бакпрепаратом, посев смеси семян бобовых и злаковых культур, предварительно обработанных регулятором роста растений, отличающийся тем, что почву обрабатывают сухим бакпрепаратом с наполнителем в количестве 50 кг/га, в котором в качестве микроорганизмов используют штамм Pseudomonas fluorescens КО ВНИИСХМ Д-619 и штамм Pseudomonas aeruginosa КОА-3 ВНИИСХМ Д-609 в соотношении 1:1, а в качестве наполнителя используют отходы бурого угля, при этом в качестве регулятора роста растений используют сухой бакпрепарат на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, Bacillus megaterium КС-1 ВНИИСХМ В-135 Д в количестве 2 кг/га и соотношении бактериальных культур 1:1.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сухой бакпрепарат на основе Azotobacter chroococcum Mut-1 ВНИИСХМ В-35 Д, Bacillus megaterium KC-1 ВНИИСХМ В-135 Д содержит гуминовые, карбоновые, аминокислоты, полисахариды, витамины группы В.