Способ мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом и развитием неврологических и сосудистых его осложнений
Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для оценки состояния больных сахарным диабетом и развитием у них неврологических и сосудистых осложнений. Сущность изобретения состоит в том, что определяют иммунореактивность сыворотки крови по отношению к инсулину, к антиинсулиновым антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, к антиантиинсулиновым антителам, связывающим антитела к инсулину и антитела к фактору роста или их антигенсвязывающим фрагментам и антигену ANCA и по увеличению иммунореактивности сыворотки по отношению к определяемым параметрам относительно нормы определяют степень прогрессии сахарного диабета и неворологических и сосудистых осложнений. Техническим результатом является повышение точности мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом.
Изобретение относится к медицине, в частности к терапии и эндокринологии, и может найти применение в оценке эффективности терапии сахарного диабета 1 и 2 типа.
Известно, что иммунная система здорового человека постоянно продуцирует естественные регуляторные аутоантитела (ауто-АТ) к любым антигенным компонентам собственного организма, в том числе ауто-АТ к компонентам клеток поджелудочной железы и инсулиновым рецепторам (Полетаев А.Б. и др. Регуляторная метасистема, М.: Медицина, 2002). Синтез ауто-АТ в здоровом организме поддерживается в определенных границах, необходимых для выполнения последними определенных регуляторных функций, а их избыточная, равно как и недостаточная продукция могут вести к развитию патологических состояний, в том числе инсулинзависимого сахарного диабета (СД типа 1) и инсулиннезависимого сахарного диабета (СД типа 2), а также сосудистых и неврологических осложнений основного заболевания, нередко ведущих к стойкой инвалидности.
Вышесказанное явилось основанием для разработки предлагаемого способа, пригодного для диагностической и прогностической оценки уровней ряда ауто-АТ, содержание которых отражает уровень аутоиммуноагрессии к инсулинсекретирующим клеткам поджелудочной железы при СД-1, к периферическим инсулиновым рецепторам при СД-2, а также осуществлять контроль за развитием основных осложнений сахарного диабета (сосудистых и неврологических).
Общепринятым способом диагностики сахарного диабета и мониторинга за их состоянием является определение уровня сахара в крови (В.В.Медведев, Ю.З.Волчек. "Клиническая лабораторная диагностика" "Гиппократ" СПб, 1997, стр.154).
Недостатком этого известного способа является его сравнительно невысокая надежность и невозможность мониторинга за развитием основных сосудистых и неврологических осложнений, сопровождающих сахарный диабет.
Задача изобретения - способ мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом и развитием неврологических и сосудистых его осложнений, позволяющий более объективно судить о прогрессии сахарного диабета и о развитии неврологических и сосудистых осложнений.
Поставленная задача решается способом, заключающимся в том, что определяют иммунореактивность сыворотки крови по отношению к инсулину, к антиинсулиновым антителам (связывающим антитела к рецепторам инсулина) или их антигенсвязывающим фрагментам, антиантиинсулиновым антителам, связывающим антитела к инсулину и антитела к фактору роста нервов (антиидиотипам антиинсулиновых антител) или их антигенсвязывающим фрагментам и антигену ANCA и при увеличении иммунореактивности на 6-15% по отношению к инсулину и/или к антиинсулиновым антителам или их антигенсвязывающим фрагментам делают вывод об умеренной прогрессии сахарного диабета, а при одновременном в такой же степени повышении иммунореактивности по отношению к антиантиинсулиновым антителам, связывающим антитела к инсулину и антитела к фактору роста нервов или антигенсвязывающим фрагментам делают вывод об умеренной прогрессии диабетической нейропатии, а при одновременном повышении в такой же степени иммунореактивности по отношению к ANCA делают вывод о диабетической ангиопатии, а при более высокой иммунореактивности по отношению к перечисленным реагентам делают вывод о высокой степени прогрессии сахарного диабета и его неврологических и сосудистых осложнений.
Практическое осуществление способа включает следующие стадии:
I. Сорбцию на стандартные 96-луночные полистироловые планшеты для ИФА а) инсулина, б) молекул идиотипических антиинсулиновых антител (или их фрагментов) - иммунохимических аналогов инсулиновых рецепторов; б) антиидиотипических антител (антиантител), специфически взаимодействующих с антителами к инсулину; в) анионных белков цитоплазмы нейтрофилов (ANCA);
II. Нанесение на них тестируемых проб сывороток пациентов и эталонной референс-сыворотки, полученной от здоровых лиц;
III. Выявление образующихся антигенантительных комплексов с помощью конъюгатов вторичных (антивидовых) иммуноглобулинов, меченных пероксидазой хрена или иным ферментом;
IV. Проявление реакции в лунках планшета с помощью субстрата-хромогена;
V. Сравнение интенсивности реакции в лунках, содержащих тестируемые сыворотки с лунками, содержащими референс-сыворотку.
Для проведения анализа ЭЛИ-ДИА-Тест требуется около 0,03 мл сыворотки крови обследуемого (например, полученной из подушечки пальца).
ПОЛУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ КОМПОНЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПО ПРЕДЛАГАЕМОМУ СПОСОБУ (ТЕСТ-СИСТЕМЕ ЭЛИ-ДИА-ТЕСТ).
1. В работе используется коммерческий препарат инсулина.
2. Получение антиинсулиновых антител или их антигенсвязывающих фрагментов проводили с помощью стандартных процедур иммуноаффинной хроматографии, как описано ранее (Полетаев А.Б. и др. Ж. Нейроиммунология, 2003, 1, 1, 11-17).
3. Получение антиантиинсулиновых антител или их антигенсвязывающих фрагментов проводили с помощью стандартных процедур иммуноаффинной хроматографии, как описано ранее (Полетаев А.Б. и др. Ж. Нейроиммунология, 2003, 1, 1, 11-17).
4. Получение антигена ANCA проводили следующим образом: из цельной крови человека выделяли фракцию нейтрофилов, экстрагировали ее с помощью нейтрального буферного раствора (например, трис-хлоридного), экстракт пропускали через анионообменную колонку (например, ДЕАЕ-целлюлоза), связавшийся материал элюировали солевым раствором (например, 1 М хлоридом натрия) и использовали в работе.
МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ НЕПРЯМОГО ИФА.
1. Для сорбции на стандартные 96-луночные плоскодонные планшеты для иммуноферментного анализа готовили растворы каждого из компонентов тест-системы на карбонатном буфере рН 9-10. Приготовленные растворы вносили в отдельные лунки планшета и инкубировали в течение 1-24 ч.
2. После инкубации отмывали планшеты отмывочным буфером (например, 0.15 М NaCl с 0.05% твин-20) и проводили тестирование сывороток; для этого:
а) в отдельных флаконах или ванночках для ИФА готовили разведения сывороток (например, 1:200) на отмывочном буфере,
б) вносили разведенные сыворотки в лунки планшета,
в) планшеты инкубировали ночь при +4°С или 1-3 ч при +37...+39°С,
г) отмывали планшеты и проявляли реакцию с помощью стандартных приемов, используя конъюгат пероксидазы хрена (или иного фермента) с антителами к иммуноглобулинам IgG человека и раствор субстрата-хромогена (например, 0.01-0.05% о-фенилендиамин с 0.001-0.01% перекиси водорода на 0.01-0.05 М цитрат-фосфатном буфере в случае применения пероксидазных конъюгатов).
3. Инкубировали планшеты в темноте 10-30 мин при комнатной температуре.
4. По достижении оптимального уровня окрашивания (обычно через 10-20 мин инкубации в темноте) реакцию останавливают добавлением 0.2-0.4 М кислоты.
5. Регистрация результатов реакции: интенсивность окрашивания оценивают с помощью иммуноферментного анализатора (ИФА-ридера) любой модели.
6. Обработка полученных данных:
по полученным значениям оптической плотности лунок рассчитывают относительную интенсивность реакции тестировавшихся сывороток с каждым из компонентов тест-системы ЭЛИ-ДИА-Тест по отношению к реакции контрольной сыворотки с тем же антигеном за минусом 100 единиц и выражают в условных единицах. Для расчета используют формулу:
где
R(aг1) - величина оптической плотности анализируемой сыворотки крови в лунках с антигеном-1;
R(агn) - величина оптической плотности анализируемой сыворотки крови в лунках с антигеном-n;
R(к1...кn) - величина оптической плотности контрольной сыворотки крови в лунках с антигенами 1...n.
7. Интерпретация полученных данных:
а) в случае если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов тест-системы не выходила за пределы +5% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят к 1-й классификационной группе (лица без прогрессии основного заболевания и без признаков развития осложнений),
б) в случае если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов выходит за пределы группы-1, но не превышает +15% по отношению к реакции сыворотки-эталона, данную сыворотку относят ко 2-й классификационной группе или группе умеренных отклонений (лица с прогрессией СД и/или его осложнениями умеренной выраженности),
в) в случае, если интенсивность реакции исследуемой сыворотки с любым из компонентов выходит за пределы 1-й и 2-й групп, данную сыворотку относят к 3-й классификационной группе или группе выраженных отклонений (лица с высоким риском быстрой прогрессии основного заболевания и/или его осложнений),
г) вероятность прогрессии СД-1 пропорциональна степени отклонений от нормы в содержании ауто-АТ к инсулину,
д) вероятность прогрессии СД-2 пропорциональна степени отклонений от нормы в содержании ауто-АТ к инсулиновым рецепторам, выявляемым по реакции в лунках с адсорбированными антиинсулиновыми антителами (идиотипическими) или их фрагментами,
е) вероятность прогрессии диабетической нейропатии пропорциональна степени отклонений от нормы в содержании антител, перекрестно реагирующих как с инсулином, так и с фактором роста нервов, выявляемым по реакции в лунках с адсорбированными анти-антиинсулиновыми антителами (антиидиотипическими) или их фрагментами,
ж) вероятность прогрессии диабетической ангиопатии пропорциональна степени отклонений от нормы в содержании антител, реагирующих с антигеном ANCA,
з) по динамике изменений в содержании соответствующих ауто-АТ можно судить о позитивных или нарастании негативных тенденций в состоянии обследуемых, например, на фоне проводимого лечения.
Необходимо отметить, что выполнение анализов производится в условиях in vitro без какого-либо вреда для обследуемого.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Обследуемый 1
Результаты анализов ЭЛИ-ДИА-Тест (иммунореактивность в % от реакции контрольной сыворотки):
| AT к инсулину | AT к инсулиновым рецепторам | AT, реагирующие с инсулином и ФРН | AT к ANCA |
| 3 | 15 | 4 | 2 |
Диагноз: Впервые выявленный сахарный диабет типа-2; давность заболевания около 6 мес. Клинических признаков осложнений не выявлено.
ПРИМЕР 2
Обследуемый 2
Результаты анализов ЭЛИ-ДИА-Тест (иммунореактивность в % от реакции контрольной сыворотки):
| АТ к инсулину | AT к инсулиновым рецепторам | AT, реагирующие с инсулином и ФРН | AT к ANCA |
| 35 | 15 | 44 | 2 |
Диагноз: Сахарный диабет типа-1 с признаками инсулинорезистентности; давность заболевания около 5 лет. Клинические признаки диабетической нейропатии.
ПРИМЕР 3
Обследуемый 3
Результаты анализов ЭЛИ-ДИА-Тест (иммунореактивность в % от реакции контрольной сыворотки):
| AT к инсулину | AT к инсулиновым рецепторам | AT, реагирующие с инсулином и ФРН | AT к ANCA |
| 20 | 45 | 17 | 28 |
Диагноз: Сахарный диабет типа-2 с признаками инсулинорезистентности (смешанный тип 1+2); давность заболевания около 8 лет. Клинические признаки диабетической ангиопатии с изменениями на глазном дне, признаки нейропатии.
ПРИМЕР 4
Обследуемый 4
Результаты анализов ЭЛИ-ДИА-Тест (иммунореактивность в % от реакции контрольной сыворотки):
| AT к инсулину | AT к инсулиновым рецепторам | AT, реагирующие с инсулином и ФРН | AT к ANCA |
| 135 | 115 | 87 | 62 |
Диагноз: Сахарный диабет типа-1, состояние декомпенсации; признаки инсулинорезистентности; давность заболевания около 3 лет. Клинические признаки диабетической нейропатии. Обострение хронического инфекционного процесса.
ПРИМЕР 5
Обследуемый 5
Результаты анализов ЭЛИ-ДИА-Тест (иммунореактивность в % от реакции контрольной сыворотки):
| АТ к инсулину | АТ к инсулиновым рецепторам | AT, реагирующие с инсулином и ФРН | AT к ANCA |
| -5 | -11 | 17 | 62 |
Диагноз: Сахарный диабет типа-2, компенсированный, без признаков аутоиммунного патогенетического компонента; давность заболевания около 10 лет. Клинические признаки диабетической ангиопатии.
В отличие от рассмотренного выше способа-прототипа новый способ позволяет:
1) регистрировать патологические изменения в сывороточном содержании ауто-АТ, взаимодействующих с инсулином (их изменения - характерный признак СД-1),
2) регистрировать патологические изменения в сывороточном содержании ауто-АТ, взаимодействующих с мембранными инсулиновыми рецепторами (их изменения - характерный признак СД-2),
3) регистрировать патологические изменения в сывороточном содержании ауто-АТ, изменения которых предшествуют и сопровождают развитие основных сосудистых и неврологических осложнений диабета как типа 1, так и типа 2 (диабетическая ангиопатия, диабетическая нейропатия),
4) регистрировать патологические изменения, опасные для страдающих сахарным диабетом, но давать прогноз динамики развития основного заболевания у всех лиц, страдающих сахарным диабетом.
Способ мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом, заключающийся в том, что определяют иммунореактивность сыворотки крови по отношению к инсулину, к антиинсулиновым антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, к антиантиинсулиновым антителам, связывающим антитела к инсулину и антитела к фактору роста, или их антигенсвязывающим фрагментам и антигену ANCA и при увеличении иммунореактивности на 6-15% к норме по отношению к инсулину и/или антиинсулиновым антителам или их антигенсвязывающим фрагментам делают вывод об умеренной прогрессии сахарного диабета, а при одновременном в такой же степени повышении иммунореактивности по отношению к антиантиинсулиновым антителам или антигенсвязывающим фрагментам делают вывод об умеренной прогрессии диабетической нейропатии, а при одновременном повышении в такой же степени иммунореактивности по отношению к ANCA делают вывод о диабетической ангиопатии, а при более высокой иммунореактивности по отношению к перечисленным реагентам делают вывод о высокой степени прогрессии сахарного диабета и его неврологических и сосудистых осложнений.
